Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome
Summary
Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), uma centrifugação de gradiente de glicerol na presença de um crosslinker, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas.
Abstract
O emendamento pré-mRNA é um processo muito dinâmico que envolve muitos rearranjos moleculares dos subcoplexos de emenda durante a montagem, processamento de RNA e liberação dos componentes complexos. A centrifugação de gradiente de glicerol tem sido usada para a separação de complexos de proteínas ou RNP (RiboNucleoProtein) para estudos funcionais e estruturais. Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), que foi desenvolvido pela primeira vez para purificar e estabilizar complexos macromoleculares para microscopia crio-elétron de partículas únicas, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas. Este método baseia-se na centrifugação das amostras em uma concentração crescente de um reagente de fixação para estabilizar complexos. Após a centrifugação de extratos totais de levedura carregados em gradientes de glicerol, as frações recuperadas são analisadas por mancha de ponto para a identificação dos sub complexidades e determinação da presença de fatores de emenda individuais.
Introduction
O splicing é um processo altamente dinâmico que requer a vinculação e liberação de uma infinidade de fatores de forma coordenada. Esses fatores de emenda incluem proteínas de ligação de RNA, ATPases, helicases, quinases de proteínas e fosfattases, ligaduras de ubiquitina, entre outros1,2,3; e para permitir que os rearranjos moleculares ocorram, alguns desses fatores se ligam muito transitoriamente aos subcoplexos de emenda, tornando muito desafiador o isolamento e identificação desses complexos intermediários RNP.
Aqui, utilizamos o método Grafix4,5 para estabilizar a interação do fator de emenda da levedura Cwc24 com o complexo deato B6 para permitir a identificação de outros fatores ligados concomitantemente a esse subcoplexo e determinar se a ligase ubiquitina Prp19 desempenha algum papel na vinculação ou liberação do complexo Cwc24 para o Complexo de Dezenove (NTC) e até o final de 5′ do intron antes da ativação e a primeira reação de transesterificação leva lugar. A vantagem de expor as macromoléculas a uma concentração crescente do crosslinker ao longo do gradiente de glicerol é que ele evita inter-complexos crosslinks4,5, e, portanto, a formação de agregados.
Este método foi utilizado como complementação para a co-doença da proteína e ensaios puxados para baixo, que, apesar de permitir o isolamento de grandes complexos, pode não ser confiável para manter interações transitórias dentro de grandes complexos dinâmicos7,8. O uso de reagentes de fixação no gradiente de glicerol estabiliza a vinculação de tais fatores, permitindo a confirmação de interações de proteínas específicas com subcomplexos de emenda. Como o crosslinker escolhido era quimicamente irreversível, as proteínas presentes nas frações recuperadas foram analisadas por mancha de ponto após a centrifugação gradiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Interações proteína-proteína e ácidos ribonucleicos-proteínas podem ser estabilizadas usando agentes de crosslinking. É importante que o complexo resultante seja estável para suportar a ultracentrifugação no gradiente de glicerol. Além disso, as condições do buffer devem permitir a interação, mas ser rigorosas o suficiente para evitar ligações não específicas. Nos experimentos aqui mostrados, utilizamos uma solução tampão já estabelecida para reações in vitro de emenda15.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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