サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用

スプライシングは、多数の因子の結合と解放を必要とする非常に動的なプロセスです。これらのスプライシング因子は、RNA結合タンパク質、ATPAses、ヘリカーゼ、タンパク質キナーゼおよびホスファターゼ、ユビキチンリガーゼ、とりわけ^1、2、3を含む。また、分子の再調整を可能にするために、これらの要因のいくつかは、スプライセソームサブコンプレックスに非常に一時的に結合し、これらのRNP中間複合体の単離および同定を非常に困難にする。

ここでは、Grafix法^4,5を使用して、酵母スプライシング因子Cwc24とB^アクトコンプレックス⁶との相互作用を安定させ、そのサブ複合体に付随して結合する他の因子を同定し、ユビキチンリガーゼPrp19がCwc24の結合または放出に何らかの役割を果たしているかどうかを判断しました。場所。グリセロール勾配に沿って架橋剤の濃度を増加させる高分子を暴露する利点は、複合体間架橋^4、5、したがって、凝集体の形成を回避することです。

この方法は、タンパク質共免疫沈降およびプルダウンアッセイの補完として使用されたが、これは、大きな複合体の単離を可能にするにもかかわらず、大きな動的複合体^7,8内の一過性相互作用を維持するために信頼できない可能性がある。グリセロール勾配における固定化試薬の使用は、このような因子の結合を安定化させ、特定のタンパク質とスプライシングサブコンプレックスとの相互作用を確認することを可能にする。選択した架橋剤は化学的に不可逆的であったため、回収された画分に存在するタンパク質を、勾配遠心分離後のドットブロットで分析した。