Utilizzo di Grafix per la rilevazione di interattori transitori di sottocomplessi di saccharomyces cerevisiae spliceosomi
Summary
Qui, descriviamo l’utilizzo di Grafix (Gradient Fixation), una centrifugazione a gradiente di glicerolo in presenza di un reticolante, per identificare le interazioni tra fattori di splicing che si legano transitoriamente al complesso spliceosoma.
Abstract
Lo splicing pre-mRNA è un processo molto dinamico che coinvolge molti riarrangiamenti molecolari dei sottocomplessi dello spliceosoma durante l’assemblaggio, l’elaborazione dell’RNA e il rilascio dei componenti complessi. La centrifugazione a gradiente di glicerolo è stata utilizzata per la separazione di complessi proteici o RNP (RiboNucleoProtein) per studi funzionali e strutturali. Qui, descriviamo l’utilizzo di Grafix (Gradient Fixation), che è stato sviluppato per la prima volta per purificare e stabilizzare i complessi macromolecolari per la microscopia crioeletnica a singola particella, per identificare le interazioni tra i fattori di splicing che si legano transitoriamente al complesso spliceosoma. Questo metodo si basa sulla centrifugazione di campioni in una concentrazione crescente di un reagente di fissazione per stabilizzare i complessi. Dopo la centrifugazione degli estratti totali di lievito caricati su gradienti di glicerolo, le frazioni recuperate vengono analizzate mediante dot blot per l’identificazione dei sotto-complessi spliceosomiali e la determinazione della presenza di singoli fattori di splicing.
Introduction
Lo splicing è un processo altamente dinamico che richiede il legame e il rilascio di una moltitudine di fattori in modo coordinato. Questi fattori di splicing includono proteine leganti l’RNA, ATPasi, elicasi, protein chinasi e fosfatasi, ubiquitina ligases, tra gli altri1,2,3; e per consentire i riarrangiamenti molecolari, alcuni di questi fattori si legano molto transitoriamente ai sottocomplessi dello spliceosoma, rendendo molto impegnativo l’isolamento e l’identificazione di questi complessi intermedi RNP.
Qui, abbiamo usato il metodo Grafix4,5 per stabilizzare l’interazione del fattore di splicing del lievito Cwc24 con il complesso diatto B6 per consentire l’identificazione di altri fattori legati contemporaneamente a quel sottocomplesso e determinare se l’ubiquitina ligasi Prp19 svolge un ruolo nel legame o nel rilascio di Cwc24 al complesso Nineteen (NTC) e all’estremità 5′ dell’intron prima dell’attivazione e della prima reazione di transesterificazione prende luogo. Il vantaggio di esporre le macromolecole ad una concentrazione crescente del reticolante lungo il gradiente glicerolo è che evita i collegamenti incrociati inter-complessi4,5e quindi, la formazione di aggregati.
Questo metodo è stato utilizzato come complemento ai saggi di coimmunoprecipitazione e pull-down proteici, che, pur consentendo l’isolamento di grandi complessi, potrebbero non essere affidabili per mantenere interazioni transitorie all’interno di grandi complessidinamici 7,8. L’uso di reagenti di fissazione nel gradiente del glicerolo stabilizza il legame di tali fattori, consentendo la conferma delle interazioni di proteine specifiche con sottocomplessi di splicing. Poiché il reticolante scelto era chimicamente irreversibile, le proteine presenti nelle frazioni recuperate sono state analizzate mediante dot blot dopo la centrifugazione a gradiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le interazioni proteina-proteina e acidi ribonucleici-proteina possono essere stabilizzate utilizzando agenti reticolanti. È importante che il complesso risultante sia stabile per resistere all’ultracentrifugazione sul gradiente di glicerolo. Inoltre, le condizioni del buffer dovrebbero consentire l’interazione, ma essere abbastanza rigorose da evitare binding non specifici. Negli esperimenti qui mostrati, abbiamo utilizzato una soluzione tampone già stabilita per le reazioni di splicing in vitro15</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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