Verwendung von Grafix zum Nachweis transienter Interaktoren von Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes
Summary
Hier beschreiben wir die Verwendung von Grafix (Gradient Fixation), einer Glyceringradientenzentrifugation in Gegenwart eines Vernetzers, um Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren zu identifizieren, die vorübergehend an den Spleißosomkomplex binden.
Abstract
Pre-mRNA-Spleißen ist ein sehr dynamischer Prozess, der viele molekulare Umlagerungen der Spleißosom-Subkomplexe während der Montage, RNA-Verarbeitung und Freisetzung der komplexen Komponenten beinhaltet. Die Glyceringradientenzentrifugation wurde zur Trennung von Protein- oder RNP-Komplexen (RiboNucleoProtein) für funktionelle und strukturelle Studien verwendet. Hier beschreiben wir die Verwendung von Grafix (Gradient Fixation), das zuerst entwickelt wurde, um makromolekulare Komplexe für die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie zu reinigen und zu stabilisieren, um Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren zu identifizieren, die vorübergehend an den Spleißosomenkomplex binden. Diese Methode basiert auf der Zentrifugation von Proben in eine zunehmende Konzentration eines Fixierungsreagenz zur Stabilisierung von Komplexen. Nach der Zentrifugation von Hefe-Gesamtextrakten, die auf Glyceringradienten geladen sind, werden die wiedergewonnenen Fraktionen durch Dot-Blot analysiert, um die Spleißosom-Subkomplexe zu identifizieren und das Vorhandensein einzelner Spleißfaktoren zu bestimmungen.
Introduction
Spleißen ist ein hochdynamischer Prozess, der eine Vielzahl von Faktoren koordiniert binden und freisetzen muss. Zu diesen Spleißfaktoren gehören RNA-bindende Proteine, ATPasen, Helikasen, Proteinkinasen und Phosphatasen, Ubiquitinligasen, unter anderem1,2,3; und um die molekularen Umlagerungen zu ermöglichen, binden einige dieser Faktoren sehr vorübergehend an die Spleißosom-Subkomplexe, was die Isolierung und Identifizierung dieser RNP-Zwischenkomplexe sehr schwierig macht.
Hier haben wir die Grafix-Methode4,5 verwendet, um die Wechselwirkung des Hefe-Spleißfaktors Cwc24 mit demB-Act-Komplex 6 zu stabilisieren, um die Identifizierung anderer Faktoren zu ermöglichen, die gleichzeitig an diesen Subkomplex gebunden sind, und um festzustellen, ob die Ubiquitinligase Prp19 eine Rolle bei der Bindung oder Freisetzung von Cwc24 an den Nineteen (NTC) -Komplex und an das 5′-Ende des Introns vor der Aktivierung spielt und die erste Transesterreaktion dauert Ort. Der Vorteil der Exposition der Makromoleküle gegenüber einer zunehmenden Konzentration des Vernetzers entlang des Glyceringradienten besteht darin, dass es Interkomplexvernetzungen4,5und damit die Bildung von Aggregaten vermeidet.
Diese Methode wurde als Ergänzung zu Protein-Coimmunopräzipitations- und Pull-Down-Assays verwendet, die, obwohl sie die Isolierung großer Komplexe ermöglichen, möglicherweise nicht zuverlässig sind, um transiente Wechselwirkungen innerhalb großer dynamischer Komplexeaufrechtzuerhalten 7,8. Die Verwendung von Fixierungsreagenzien im Glyceringradienten stabilisiert die Bindung solcher Faktoren und ermöglicht die Bestätigung der Wechselwirkungen spezifischer Proteine mit Spleißsubkomplexen. Da der gewählte Vernetzer chemisch irreversibel war, wurden die in den wiederhergestellten Fraktionen vorhandenen Proteine nach der Gradientenzentrifugation per Punktblot analysiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-Protein- und Ribonukleinsäure-Protein-Interaktionen können mit Vernetzern stabilisiert werden. Es ist wichtig, dass der resultierende Komplex stabil ist, um einer Ultrazentrifugation auf Glyceringradient standzuhalten. Darüber hinaus sollten die Pufferbedingungen die Interaktion ermöglichen, aber streng genug sein, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. In den hier gezeigten Experimenten haben wir eine bereits etablierte Pufferlösung für In-vitro-Spleißreaktionenverwendet 15.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein FAPESP-Stipendium (15/06477-9) unterstützt.
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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