Utilisation de Grafix pour la détection des interacteurs transitoires des sous-complexes de Spliceosomes de Saccharomyces cerevisiae
Summary
Ici, nous décrivons l’utilisation de Grafix (Gradient Fixation), une centrifugation de gradient de glycérol en présence d’un réticulateur, pour identifier les interactions entre les facteurs d’épissage qui se lient transitoirement au complexe d’épissage.
Abstract
L’épissage pré-ARNm est un processus très dynamique qui implique de nombreux réarrangements moléculaires des sous-complexes spliceosomes lors de l’assemblage, du traitement de l’ARN et de la libération des composants complexes. La centrifugation du gradient de glycérol a été utilisée pour la séparation de complexes protéiques ou RNP (RiboNucleoProtein) pour des études fonctionnelles et structurelles. Ici, nous décrivons l’utilisation de Grafix (Gradient Fixation), qui a d’abord été développé pour purifier et stabiliser les complexes macromoléculaires pour la cryo-microscopie électronique à particule unique, afin d’identifier les interactions entre les facteurs d’épissage qui se lient transitoirement au complexe spliceosome. Cette méthode est basée sur la centrifugation d’échantillons en une concentration croissante d’un réactif de fixation pour stabiliser les complexes. Après centrifugation d’extraits totaux de levure chargés sur des gradients de glycérol, les fractions récupérées sont analysées par transfert de points pour l’identification des sous-complexes de spliceosomes et la détermination de la présence de facteurs d’épissage individuels.
Introduction
L’épissage est un processus très dynamique qui nécessite la liaison et la libération d’une multitude de facteurs de manière coordonnée. Ces facteurs d’épissage comprennent les protéines de liaison à l’ARN, les ATPases, les hélicases, les protéines kinases et les phosphatases, les ligas d’ubiquitine, entre autres1,2,3; et pour permettre aux réarrangements moléculaires d’avoir lieu, certains de ces facteurs se lient très transitoirement aux sous-complexes spliceosomes, ce qui rend l’isolement et l’identification de ces complexes intermédiaires RNP très difficiles.
Ici, nous avons utilisé la méthode Grafix4,5 pour stabiliser l’interaction du facteur d’épissage de levure Cwc24 avec le complexed’acte B6 afin de permettre l’identification d’autres facteurs liés concomitamment à ce sous-complexe et de déterminer si l’ubiquitine ligase Prp19 joue un rôle dans la liaison ou la libération de Cwc24 au complexe Nineteen (NTC) et à l’extrémité 5′ de l’intron avant l’activation et la première réaction de transestérification prend lieu. L’avantage d’exposer les macromolécules à une concentration croissante du réticulant le long du gradient de glycérol est qu’il évite les réticulations inter-complexes4,5, et donc, la formation d’agrégats.
Cette méthode a été utilisée en complément de la coimmunoprécipitation des protéines et des essais de traction vers le bas, qui, bien que permettant l’isolement de grands complexes, peuvent ne pas être fiables pour maintenir les interactions transitoires au sein de grands complexes dynamiques7,8. L’utilisation de réactifs de fixation dans le gradient de glycérol stabilise la liaison de ces facteurs, permettant la confirmation des interactions de protéines spécifiques avec des sous-complexes d’épissage. Parce que le réticulateur choisi était chimiquement irréversible, les protéines présentes dans les fractions récupérées ont été analysées par transfert de points après la centrifugation du gradient.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les interactions protéine-protéine et acides ribonucléiques-protéines peuvent être stabilisées à l’aide d’agents de réticulation. Il est important que le complexe résultant soit stable pour résister à l’ultracentrifugation sur le gradient de glycérol. De plus, les conditions de tampon doivent permettre l’interaction, mais être suffisamment strictes pour éviter une liaison non spécifique. Dans les expériences présentées ici, nous avons utilisé une solution tampon déjà établie pour les réacti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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