JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

Published: March 20, 2021
doi:
10.3791/61972
, , , , , , , , , ,
1Université de Strasbourg, Architecture et Réactivité de l’ARN, UPR 9002, CNRS,Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Biochemistry and Molecular Biology, Institute for Biochemistry,Leipzig University, 3Paul Scherrer Institute, Swiss Light Source, 4European XFEL GmbH

Summary

Karşı difüzyon yöntemini kullanarak bir enzimin kristalleşmesini, ıslatarak kristallere bir substratın girmesini ve oda sıcaklığında çipin içindeki kristallerin seri analizi ile enzim:substrat kompleksinin 3D yapısının belirlenmesini sağlayan çok yönlü bir mikroakışkan cihaz tarif edilir.

Abstract

İyi dağınık kristallerin hazırlanması ve X-ışını analizlerinden önce ele alınması biyokristalografik çalışmaların iki kritik adımıdır. Kristallerin verimli bir karşı difüzyon yöntemiyle üretilmesini sağlayan çok yönlü bir mikroakışkan çipi tarif ediyoruz. Mikroakışkan kanallar tarafından sağlanan konveksiyonsuz ortam kristal büyümesi için idealdir ve bir substratı kristal enzimin aktif bölgesine dağıtmak için yararlıdır. Burada bu yaklaşımı, sunulan örnekte psişik bakteri Planococcus halocryophilus’un CCA ekleyen enzimine uyguladık. Kristalleşme ve substrat difüzyon/ıslatma sonrasında enzim:substrat kompleksinin kristal yapısı seri kristalografi ve doğrudan çipin içindeki birden fazla kristalin analizi ile oda sıcaklığında belirlendi. Tüm prosedür, kristal işleme gerektirmediğinden numunelerin orijinal kırınım özelliklerini korur.

Introduction

Kristalografi, biyolojik makromoleküllerin 3D mimarisini deşifre etmek için bir yöntemdir. İkincisi, bir enzimin alt tabakalarını nasıl seçtiğini ve işlediğini anlamak için önemlidir. Kristal bir yapının belirlenmesi, hedef makromolekülün kristalleşmesini ve kristallerin X-ışını kırınımı1ile analizleri için şartlandırılmasını gerektirir. Hem kristal hazırlama hem de elleçleme, kristal kalitesini ve kırınım özelliklerini ve dolayısıyla ortaya çıkan 3D yapının çözünürlüğünü (yani doğruluğunu) etkileyebilecek çok önemli ancak hassas adımlardır. Yüksek kaliteli kristallerin hazırlanmasını kolaylaştırmak ve kırınım özelliklerini korumak için gereksiz kullanımı ortadan kaldırmak için ChipX2,3,4adlı kullanıcı dostu ve çok yönlü bir mikroakışkan cihaz tasarladık.

Bu yazıda, kristalleri karşı difüzyonla hazırlamak için geleneksel laboratuvar malzemesini kullanarak protein çözeltisinin ChipX kanallarına nasıl yüklendiğini göstereceğiz. Bu kristalizasyon yöntemi, kristalize edici maddenin difüzyonu ile oluşturulan konsantrasyon gradyanı nedeniyle enzim çözeltisini içeren mikroakışkan kanallar boyunca aşırı doygunluğun ve potansiyel çekirdeklenme koşullarının verimli bir şekilde taranmasını sağlar5,6.

Talaş kurulumu basittir, sadece standart laboratuvar pipetleri kullanır ve herhangi bir maliyetli ekipman gerektirmez. ChipX’te kristaller büyüdüğünde, enzimin ligandları difüzyon ile tanıtılabilir. Kırınım verileri daha sonra bir senkrotron X-ışını kaynağı kullanılarak çipin kanallarında bulunan bir dizi kristal üzerinde oda sıcaklığında toplanır. Burada açıklanan yapısal çalışma, bir tRNA olgunlaşma enziminin yapılarının apo formunda ve karmaşık bir şekilde, ıslatılarak tanıtılan CTP substratının bir analog ile belirlenmesine yol açmıştır. CCA ekleyen enzim adı verilen bu protein, tRNA’ların 3′ ucundaki CCA trinükleotid kuyruğunu polimerize eder. Seri kristalografi ile elde edilen iki 3D görüntü karşılaştırması, kriyo-kristalografide kullanılanlardan daha fizyolojik koşullarda ligandın bağlanmasıyla ilgili lokal konformasyonel değişiklikleri ortaya koymaktadır. Bu videoda açıklanan protokol genellikle bir protein, nükleik asit veya çok bileşenli bir kompleks olsun, herhangi bir biyomolekül için geçerlidir.

Protocol

1. ChipX’te kristalizasyon tahlillerinin kurulması NOT: ChipX mikroakışkan cihaz yazarlardan temin edilebilir. Yonganın açıklaması Şekil 1 ‘de verilmiştir. Kristalleşmeyi tetiklemek için kullanılan kristalleşmeyi (veya kristalize edici maddeyi) içeren çözümler ticari kökenli olabilir veya deneyci tarafından hazırlanabilir. Biyomolekül numunesi yükleniyorNOT: ChipX’in her kanalının düz bölümünde tek bir karşı difüzyon tahlili gerçekleştirmek için gereken örnek hacim 300 nL’dir. Ancak kolaylık sağlamak için kavisli bölümlerinin değişken uzunluğunu ve giriş ölü hacimlerini dikkate alarak sekiz kanalı tamamen doldurmak için 5 μL yüklemenizi öneririz. Standart 10 μL pipet ve uç kullanarak pipet 5 μL enzim çözeltileri. Ucu numune girişine dikey olarak sokun ve sekiz kanal karşı uçlarına kadar doldurulana kadar çözeltiyi enjekte edin (kristal eğimli rezervuarın girişi). Kanalları birbirinden kesmek için numune girişine 1 μL parafin yağı enjekte edin. Standart bir 10 μL pipet kullanarak her kanalın ekstremitesinde kristalant rezervuarındaki ekstra çözeltiyi kurtarın. Numune giriş kısmını 1 cm x 1 cm bant parçası ile kapatın. Kristalizasyon çözümlerini yükleme Standart 10 μL pipet ve uç kullanarak pipet 5 μL kristalizasyon çözeltisi. Rezervuar hacmi 10 μL’dir, ancak sadece yarısının yüklenmesi bantla sızdırmazlık yaparken taşma olmasını önler ve emme deneyleri için ligandın daha fazla eklenmesini kolaylaştırır. buhar difüzyonu ile ilk kristalleşme koşulları elde edildiyse, kristallant konsantrasyonunu 1,5 – 2 kat artırın. Çözeltiler her rezervuarda farklı olabilir (sunulan durumda, 1 M diammonyum hidrojen fosfat, 100 mM sodyum asetat, pH 4.5 boyunca kullanılmıştır). Çözelti birikimi üzerine bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için pipet ucunu rezervuarın huni şeklindeki kısmında kanalın girişine doğru yönlendirin. İki çözelti arasındaki teması ve kanala kristal difüzyonu önleyecektir. Kristal çözeltisini rezervuara enjekte edin. Rezervuarları 2,5 cm x 1 cm bant parçası ile kapatın. Çipi 20 °C’de kuluçkaya yatırın (sıcaklık hedefe bağlı olarak ayarlanabilir, tipik olarak 4 ila 37 °C 4). 2. Floresan tespiti için karboksihodamin ile protein etiketleme NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Floresan kullanılarak talaştaki kristallerin algılanmasını kolaylaştırmak için numune yüklemeden önce yapılmalıdır. İz floresan etiketlemenin ayrıntılı yöntemi Pusey ve iş arkadaşları tarafından açıklandı7. Tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. 5 mg karboksihodamin ester tozunu 1 mL susuz dimetil-formamidde çözün, çözeltiyi -20 °C’de depolanacak 0,6 μL aliquots’a bölün. 1 M Na-borat pH 8.75 stok çözümü hazırlayın. Reaksiyon tamponunu 0,05 M Na-borat pH 8,75’te hazırlamak için stoğu seyreltin. Bir tuzdan arındırma sütununu (7 kDa MWCO, 0,5 mL) 800 μL reaksiyon tamponu ile durulayın. Sütunu 1400 x g’da 1 dakika santrifüj edin, filtratı çıkarın. Sütunu yıkamak için bu işlemi iki kez (adım 2.4-2.5) tekrarlayın. Kolon üzerindeki depolama tamponunda 80 μL protein biriktirin (protein gerekirse hacmi artırmak için 1 mg / mL’ye kadar seyreltilebilir). Sütunu 1400 x g’da 1 dakika santrifüj edin. Bu adım, proteini depolama tamponundan reaksiyon arabelleğine aktarmayı amaçlamaktadır. Akışı kurtarın (reaksiyon tamponunda proteini içeren) ve 0,6 μL karboksirhodamin çözeltisi ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır. Bu arada, 3 x sütununu depolama arabelleğiyle durulayın, sütunu 1400 x g’da 1 dakika santrifüj edin ve filtratı atın. Reaksiyon çözeltisini sütuna yatırın. Sütunu 1400 x g’da 1 dakika santrifüj edin ve akışını geri kazan (yani, depolama tamponunda etiketli protein çözeltisi). Stok protein çözeltisini etiketli proteinin % 0,1-1’i (w/w) ile destekleyin. Bölüm 1’de açıklandığı gibi ChipX kristalleştirme testlerini kurulum. Floresan probu 520 nm dalga boyu ışık kaynağı ile heyecanlaştırarak testlerde protein kristallerinin varlığını kontrol edin. 3. Kristal gözlemi NOT: ChipX cihazı, sıcaklığın kontrol edilmesi gerekmesi dışında, içinde kristaller olsa bile özel bir bakım olmadan işlenebilir. ChipX’teki kristalizasyon testlerinin sonucunu kontrol etmek için herhangi bir stereomikroskop kullanın. Ayak izi mikroskop slaytlarının standart boyutlarına sahiptir ve herhangi bir sistem ve slayt tutucu ile uyumludur. Kristalant konsantrasyonunun en düşük olduğu numune girişine kristalant konsantrasyonunun en yüksek olduğu rezervuardan başlayarak mikroakışkan kanalların içeriğini kontrol edin. ChipX malzemesi görünür ışığa şeffaftır, polarizatörlerin kullanımıyla ve ayrıca iç triptotan floresan 8 ile protein kristali tanımlama içinUVaydınlatma ile uyumludur. Kanallar boyunca kabartmalı etiketleri kullanarak kristal konumlarını kaydedin veya talaş yüzeyinde yanlarında renk noktaları çizerek kristal konumlarını kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin. 4. Ligands ile kristal ıslatma NOT: Bu yordam isteğe bağlıdır. Kristallere ligandlar, enzim substratları veya ağır atomlar sokmak için kullanılır ve kanallar boyunca ve kristallere bileşik difüzyona izin vermek için X-ışını analizinden önce en az 24-48 saat yapılmalıdır. Sızdırmazlık bandını rezervuarlardan yavaşça çıkarın. 10 μL mikropipet kullanarak bir veya birkaç rezervuara 5 μL’ye kadar ligand çözeltisi ekleyin (örnekte, 3,75 mM’lik nihai konsantrasyon elde etmek için 10 mM sitidin-5’-[(α,β)-metilenno] trifosfat (CMPcPP) çözeltisi eklendi). CMPcPP, enzimin doğal bir substratı olan CTP’nin hidrolize edilemez bir analogdur. Rezervuarları 2,5 cm x 1 cm bant parçası ile kapatın. Çipin kanalları boyunca ligand difüzyona izin vermek için çipi kontrollü sıcaklıkta 24-48 saat boyunca kuluçkaya bırakın. 5. Seri kristalografi ile kristal analizi NOT: Protokolün bu bölümünün kiriş çizgisi kurulumuna ve kristallerin kırınım özelliklerine bağlı olarak uyarlanması gerekir. X06DA kiriş hattında (SLS, Villigen, İsviçre) yapılan deneylere dayanan kristalografik analiz için sadece genel endikasyonlar verilmiştir. Beamline goniometreye ChipX montajıNOT: ChipX tutucusuna 3D yazdırma dosyasıref 4. Işın hattının kriyo-jetini kapatın. Buradaki analiz oda sıcaklığında gerçekleştirilir. ChipX’i, tutucunun ortasına yerleştirilecek analiz edilecek kristalleri içeren kanalla özel bir tutucuya monte edin. ChipX tutucu4, ChipX için mükemmel bir uyum sağlamak üzere tasarlandığı için herhangi bir vida veya ek parça gerektirmez. Tutucuyu goniometreye takın. Veri toplama ChipX’in en kalın tabakasını (üst katman, Şekil 1)(kanallar boyunca bu yönlendirme etiketlerinde, kiriş çizgisinin merkezleme kamerası kullanılarak doğrudan okunabilir), doğrudan ışına ve ref3’teaçıklandığı gibi dağınık sinyalin zayıflamasını en aza indirmek için kristalin arkasındaki en ince yüze doğru yönlendirin. ChipX’in çevredeki malzemeyle (kiriş üstü, kolimatör) çarpışmasını önlemek için, X-ışını ışınlarına dik olan kanallara karşılık gelen ±30° (0° aralığındaki goniometre hareketlerini kısıtlayın). Kanallar boyunca kabartmalı etiketlerin yardımıyla kristallerin konumunu bulun. Kristal bir pozisyon seçin. Kristali standart düşük doz ızgara/ raster tarama veya 1 tıklama prosedürü ile ortalayın (video ızgara taramasının bir örneğini gösterir). -30° / +30° aralığında kırınım verilerini toplayın. Çipin çevirisinin ardından aynı kanaldaki başka bir kristal üzerinde 5.2.4-5.2.6 adımlarında yordamı yeniden başlatın. Tutucunun merkezindeki başka bir ChipX kanalını manuel olarak yeniden hizala ve bu kanalda bulunan kristaller üzerinde veri toplamaya devam et. Verileri işlemek ve birleştirmek, ardından yapıyı çözmek ve iyileştirmek için standart kristalografik paketleri ve prosedürleri kullanın.

Representative Results

Burada açıklanan mikroakışkan çip, kristalizasyon testlerinin kolay kurulumunu ve oda sıcaklığında kristal analizini sağlamak için tasarlanmıştır. Yukarıda ve videoda açıklanan prosedür, CCA ekleyen enzimin soğuk adapte olmuş Planococcus halocryophilus bakterisinden yapısal karakterizasyonu çerçevesinde uygulandı. Bu enzim, CTP ve ATP9,10kullanarak tRNA’larda 3′ CCA dizisinin sıralı eklenmesini katalze eden temel bir polimerazailesineaittir. Çip ilk olarak karşı difüzyon yöntemiyle enzimin kristallerini yapısal analize hazırlamak için kullanıldı. Bu amaçla, enzim çözeltisi sekiz mikroakışkan kanala (kristalizasyon odaları) çipin numune girişine tek bir enjeksiyonla yüklendi (bkz. Şekil 1). Enzim, 20 mM Tris / HCl pH 7.5, 200 mM NaCl ve 5 mM MgCl2içeren depolama tamponunda 5.5 mg / mL’de kullanıldı. Bu adım standart 10 μL mikropipet ile manuel olarak gerçekleştirildi. Kristalizasyon çözeltileri (100 mM sodyum asetat pH 4.5,1 M diammonyum hidrojen fosfat) daha sonra kanalların diğer ekstremitesinde rezervuarlarda biriktirildi. Yükleme prosedürü basittir ve beş dakikadan uzun sürmez(Şekil 2). Kristallant daha sonra kanallara yayılır, kristal çekirdeklenmeyi ve büyümeyi tetikleyen bir konsantrasyon gradyanı oluşturur. Bu gradyan dinamik olarak gelişir ve kanallar ve rezervuar arasındaki kristalent konsantrasyonunun dengesine ulaşana kadar5,6 aşırı doyma durumlarının bir sürekliliğini araştırır. Kristalleşme tahlilleri genellikle kristallerin büyümesini izlemek için 2 – 4 haftalık bir süre boyunca mikoskop altında kontrol edilir. CCA ekleyen enzimin bipyramidal kristalleri, 20 °C’de birkaç günlük inkübasyondan sonra kanallar boyunca ortaya çıkmıştır (Şekil 3). proteininisteğe bağlı floresan etiketlemesi, protein kristallerinin tanımlanmasını ve tuz kristallerinden ayrımcılığını büyük ölçüde kolaylaştırır (Şekil 4). Kristalleri oluşturan enzime bir substrat sunmak için çip kanallarındaki difüzif ortamdan yararlandık. Mevcut durumda, bir CTP analogu olan CMPcPP, rezervuar çözeltilerine 3,75 mM ‘lik son konsantrasyonda eklendi (Şekil 5). Bu ekleme, CMPcPP’nin enzimin katalitik bölgesine ulaşmasına ve işgal etmesine izin vermek için kristalografik analizden iki gün önce, daha sonra kristal yapısı tarafından onaylandığınız gibi gerçekleştirildi (aşağıya bakın). 3D yazıcı kullanarak polilaktik asitte bir talaş tutucu(Şekil 6)ürettik. Tutucu, standart manyetik kafalar kullanarak goniometrelere talaş montajı sağlar. Bu nedenle çip, kristalleri kırınım konumuna getirmek için X-ışını ışınında kolayca konumlandırılabilir ve çevrilebilir. Veri toplama stratejisinin kiriş çizgisi özelliklerine ve kristal özelliklerine bağlı olarak uyarlanması gerekir. CCA ekleyen enzim durumunda, veriler sırasıyla 1.0 şve Pilatus 2M-F ve 6M piksel dedektörlerinin X-ışını dalga boyu ile X06DA ve X10SA kiriş hatlarında, İsviçre Işık Kaynağı’nda (SLS) toplanarak toplandı. Oda sıcaklığında her kristalde 0,1° veya 0,2° ve 0,1 s pozlama görüntüleriyle 30-60° dönüş toplanarak toplan edilmiştir (bkz. Tablo 1). Kısmi veri kümeleri ayrı ayrı işlendi ve radyasyon hasarı nedeniyle kırınım desenlerinin çözünürlüğü bozulmaya başladığında kesildi (sinyal-gürültü oranının ve CC1/2’ninazalması ve yüksek çözünürlüklü kabukta Rmeas artışı ile tespit edildi). Tam veri kümeleri, 5 kristalden elde edilen veriler birleştirilerek yeniden inşa edilmiştir (Tablo 1). Kristal yapılar, standart kristalografik paketler ve veri işleme11 ve arıtma12prosedürleri kullanılarak moleküler değişim ile türetilmiştir. Enzimin ve kompleksinin yapılarının CMPcPP ile karşılaştırılması, CCA ekleyen enzimin aktif bölgesinde substrat bağlanmasına eşlik eden yerel konformasyonsal adaptasyonu ortaya koymaktadır(Şekil 7). Şekil 1: ChipX tasarımı. Çip, sekiz mikroakışkan kanalın ve rezervuarın basıldığı COC’den (kalınlık: 1 mm) oluşan bir üst katmandan oluşur. Çipin tamamı bir COC tabakası (kalınlık: 0,1 mm) ile kapatılmıştır. Tüm kanallar, eşzamanlı numune enjeksiyonu için sol taraftaki tek bir girişe ve kristalizasyon çözeltilerinin biriktirdiği sağ taraftaki bireysel rezervuarlara bağlanır. Çipin gerçek kristalleşme odalarını oluşturan kanallar 4 cm uzunluğundadır ve 80 μm x 80 μm’lik bir kesite sahiptir. ChipX standart bir mikroskop slaydı (7,5 cm x 2,5 cm) boyutuna sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: ChipX’te kristalizasyon tahlillerinin kurulması. 1) Standart 10 μL pipet ve uç kullanarak 5-6 μL enzim çözeltilerini biriktirin. 2) Ucu numune girişine dikey olarak sokun ve çözeltiyi sekiz kanala enjekte edin. 3) Pipet 1 μL parafin yağı. 4) Ucu numune girişine dikey olarak sokun ve kanalları birbirinden çıkarmak için yağı enjekte edin. 5) Girişi bir bant parçasıyla kapatın. 6) Pipet 5 μL kristalizasyon çözeltisi standart 10 μL pipet ve ucu kullanarak. Çözümler her rezervuarda farklı olabilir (örneğin, bir eleme kitinden). 7) Pipet ucunu rezervuarın huni şeklindeki kısmına kanalın girişine doğru yönlendirin (çözelti birikimi üzerine bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için) ve kristal çözeltiyi rezervuara enjekte edin. 8) Rezervuarları bir bant parçası ile kapatın ve çipi kontrollü sıcaklıkta kuluçkaya yatırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: ChipX’in mikroakışkan kanallarında karşı difüzyon ile yetiştirilen CCA ekleyen enzim kristalleri. Ölçek çubuğu 0,1 mm’dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Kristal ıslatma prosedürü. 1) Bandı rezervuarlardan yavaşça çıkarın. 2) 10 μL mikropipet kullanarak 5 μL’ye kadar ligand çözeltisi biriktirin. 3) Ligand’ı bir veya birkaç rezervuara ekleyin. 4) Rezervuarları bir bant parçasıyla tekrar kapatın ve çipi veri toplamadan önce 24-48 saat boyunca kontrollü sıcaklık altında kuluçkaya yatırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Eser floresan etiketleme proteini (solda) tuz (sağ) kristallerinden ayırır. CCA ekleyen enzim çözeltisi karboksirhodamin ile etiketlenmiş % 0.4 (w/w) protein içeriyordu. Sağda, kristaller 520 nm dalga boyu ışık kaynağı ile aydınlatılmıştır ve görüntü 550 nm’de (LP550) düşük geçiş filtresi ile alınır; (inset) karboksirhodamin-succinimidyl ester yapısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: (Solda) Seri kristal analizi için SLS’de (Villigen, İsviçre) X06DA kiriş çizgisinin goniometresine monte edilen ChipX tutucunun ve (Sağda) ChipX’in çizimi. Şekil 7: CCA ekleyen enzim aktif bölgesinin apo formunda (pembe) ve komplekste CTP analog (yeşil) ile karşılaştırılması. Enzimin genel uyumu etkilenmese de, CMPcPP ligandının bağlanmasına aktif bölgede yan zincirlerin hafif bir şekilde yeniden düzenlenmesi eşlik edilir. 2Fo-Fc elektron yoğunluk haritası (mavi) 1.2 sigma konturludur. 4 sigma (yeşil) konturlu fark elektron yoğunluk haritası, ligandın aktif bölgede varlığını doğrular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Kristalize örnek CCA ekleyen enzim CCA-ekleme enzimi + CMPcPP Kristal analizi X-ışını kiriş çizgisi SLS – X06DA SLS – X10SA Dalga Boyu (Å) 1.000 1.000 Sıcaklık (K) 293 293 Dedektörü Pilatus 2M-F Pilatus 6M Kristal dedektör mesafesi (mm) 300 400 Toplanan kristaller 6 14 Kristaller seçildi 5 5 Görüntü başına döndürme aralığı (°) 0.1 0.2 Görüntü başına pozlama süresi 0.1 0.1 Hayır. seçilen resimlerin sayısı 1000 540 Toplam dönüş aralığı (°) 100 108 Boşluk grubu P43212 P43212 a, c (Å) 71.5, 293.8 71.4, 293.6 Ortalama mozaiklik (°) 0.04 0.04 Çözünürlük aralığı (Å) 46 – 2.54 (2.6 – 2.54) 48 – 2.3 (2.4 – 2.3) Toplam No yansımaların 176105 (9374) 232642 (32937) Hayır. benzersiz yansımaların 23922 (1598) 34862 (4066) Tamlık (%) 90.6 (84.6) 99.5 (100.0) Yedeklilik 7.5 (6.0) 6.7 (8.1) 8.1 (1.3) 6.9 (0.7) Rmeas (%) § 18.6 (126.0) 18.0 (231.2) CC1/2 (%) £ 98.7 (55.0) 98.7 (46.9) Wilson arsasından genel B faktörü (ş2) 57.4 60.6 Kristalografik arıtma Hayır. yansımaların, çalışma kümesinin / test kümesinin 23583 / 1180 34840 / 3405 Son Rcryst (%) / Rücretsiz (%) 18.8 / 21.4 20.0 / 22.9 Hayır. H olmayan atomların: genel / protein / ligand / çözücü 2998 / 2989 / 0 / 9 3057 / 2989 / 29 / 10 Tahviller için R.m.s. sapmaları (Å) / açılar (°) 0.009 / 1.23 0.010 / 1.22 Ortalama B faktörleri (ş2):genel / protein / ligand / solvent 60.1 / 60.1 / 0 / 52.7 62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5 Ramachandran arsa: en çok tercih edilen (%) / izin verilen (%) 98.1 / 1.9 97.2 /  2.8 PDB kimliği 6IBP 6Ç52 Tablo 1: Veri toplama ve iyileştirme istatistikleri § Yedeklilikten bağımsız Rmeas = Φhkl(N/N-1)1/2Φi | Ii(hkl)- <I(hkl)>| / ΦhklΦi i(hkl), burada N veri çokluğu 17’ dir. £ Dış kabukta (<2.0) düşük olan veriler CC1/2 ölçütüne göre dahil edildi (veri kümesinin iki rastgele yarısı arasındaki korelasyon > ) Karplus & Diederichs tarafından önerildiği gibi 18.

Discussion

Biyokristallografideki mevcut protokoller, buhar difüzyonu veya parti13,14gibi yöntemler kullanılarak kristallerin hazırlanmasını ve kriyojenik koşullarda bir azot jetinde kırınım analizini yapmadan önce kriyo soğutma15,16 için bir mikroloop içine aktarılmasını içerir. Buna karşılık, ChipX3’te doğrudan kristal kriyo soğutması mümkün değildir ve kristaller mikroakışkan kanallarından çıkarılamaz, bu da bu kurulumun sınırlamaları olarak görülebilir. Bununla birlikte, makalede açıklanan protokol, kristal yapıların oda sıcaklığında (yani daha fizyolojik koşullarda) belirlenmesi için tam entegre bir boru hattı sağlar. Oda sıcaklığında veri toplama radyasyon hasarının artmasına neden olsa da19, bu etki hızlı veri toplama süresi (her kristalde maksimum 60° dönüş toplanır) ve birkaç kısmi veri kümesinin birleştirilmesiyle dengelenmiştir. Hem ChipX tasarımı hem de malzemesi, arka plan saçılma ve kırınım sinyali zayıflamasını azaltmak için optimize edilmiştir3ve veri toplama, kanalların yarısına eşdeğer boyutlara sahip kristaller üzerinde gerçekleştirilebilir (40 μm)4.

Özetlemek gerekirse, protokolün ana avantajları şunlardır. Kristaller, yüksek kaliteli kristallerin büyümesi için çok elverişli olan konveksiyonsuz bir ortamda (mikroakışkan kanallar) üretilir. ChipX’te uygulanan karşı difüzyon yöntemi, aşırı doyma ortamının taranmasında çok etkilidir; kristalantların talaş kanalına yayılması, uygun çekirdeklenme ve büyüme koşullarını belirlemeye yardımcı olan bir konsantrasyon ve aşırı doyma dalgası oluşturur5. Kristaller hiçbir zaman doğrudan ele alınmaz, ancak orijinal kırınım özelliklerini koruyan çipin içinde yerinde analiz edilir (yani, fiziksel etkileşim veya kriyosyon ile kristal mozaiği değiştirmez)20. Kırınım analizi, radyasyon hasarını en aza indirmek için düşük doz maruziyeti ile çip kanalları boyunca dağıtılan bir dizi kristal üzerinde gerçekleştirilir ve seriden kısmi veriler birleştirilerek tam bir veri kümesi birleştirilir. ChipX’in standart ayak izi ve basit tasarımı, gelecekte senkrotron veya XFEL tesisleri kullanılarak yerinde veri toplamanın tam bir otomasyonunu sağlayacaktır. Protokolün tüm adımları ChipX’te gerçekleştirilir. Deneyci bakış açısından, talaş kurulumu basit ve standart pipetlerle gerçekleştirilmesi kolaydır ve ekstra ekipman gerektirmez. Örnek girişindeki ağaç benzeri kanal bağlantısı, sistemdeki ölü hacimleri en aza indirir, bu da arındırılması zor veya yalnızca sınırlı miktarda bulunan örneklerle çalışırken önemlidir.

Sonuç olarak, ChipX’te uygulanan çip üzerinde laboratuvar yaklaşımı, karşı difüzyon ve kristal yapı belirleme ile kristalleşme sürecini basitleştirir ve verimli bir şekilde küçültür ve numuneden tek bir cihazda 3D yapısına geçmelerini sağlar. Yaygın olarak uygulanabilir ve oda sıcaklığında rutin seri biyokristallografi incelemeleri için kullanıcı dostu, uygun maliyetli bir çözüm sunar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, X10SA (PXII) ve X06DA (PXIII) kiriş hatlarındaki projeye ışınlanma süresi tahsisi için İsviçre Işık Kaynağı’nı (Villigen, İsviçre), yapı iyileştirmesine katkılarından dolayı Alexandra Bluhm’u, seslendirmenin kaydedilmesi için Clarissa Worsdale’i ve video düzenleme ve SFX’teki yardımlarından dolayı François Schnell’i (Université de Strasbourg) kabul ediyor. Bu çalışma Strazburg Üniversitesi Fransız Merkezi National de la Recherche Scientifique (CNRS) tarafından desteklendi. LabEx konsorsiyumu “NetRNA” (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), Strazburg Üniversitesi Mükemmellik girişiminden (IdEx) R.dW’ye Fransız Ulusal Programı “Investissements d’Avenir” çerçevesinde doktora fonu, Fransız-Alman Üniversitesi’nden (UFA-DFH) K.R.’a doktora fonu, hayır. CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (hibe no. Mo 634/10-1). Yazarlar PROCOPE Hubert Curien işbirliği programından (Fransa Dışişleri Bakanlığı ve Deutscher Akademischer Austauschdienst) yararlandı.

Materials

Axioscope A1 stereomicroscope Zeiss Crystal observation  (step 3)
Carboxyrhodamine succinimidyl ester Invitrogen C-6157 Protein labeling (step 2)
CMPcPP Jena Bioscience NU-438 Crystal soaking (step 4)
Crystal clear sealing tape Hampton research HR3-511 ChipX sealing  (step 1)
Parafin oil Hampton research HR3-411 ChipX loading  (step 1)
Ultimaker 2 extended+ Ultimaker 3D printer – Representative results
UV light source Xtal Concepts Gmbh XtalLight100c Crystal observation  (step 3)
Zeba spin desalting column 7K MWCO ThermoFisher Scientific 89882 Protein labeling  (step 2)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giegé, R., Sauter, C. Biocrystallography: past, present, future. HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).
  2. Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).
  3. Pinker, F., et al. ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature. Crystal Growth & Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).
  4. de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).
  5. García-Ruiz, J. M. A supersaturation wave of protein crystallization. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 149-155 (2001).
  6. Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
  7. Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. Trace fluorescent labeling for protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).
  8. Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).
  9. Betat, H., Rammelt, C., Mörl, M. tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).
  10. Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., Jühling, F., Betat, H., Mörl, M. Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity. RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).
  11. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  12. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  13. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (47), e2285 (2011).
  14. Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Giegé, R., Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. Crystallization – General Methods. International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. , 99-120 (2012).
  15. Garman, E. “Cool” crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage. Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).
  16. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).
  17. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).
  18. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  19. de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -. P., Weik, M. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).
  20. Nave, C. A. Description of Imperfections in Protein Crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).

Tags

CrystallizationStructural DeterminationEnzyme-substrate ComplexSerial CrystallographyMicrofluidic ChipCounter-diffusionIn Situ X-ray DiffractionBiomoleculeCrystal GrowthRoom Temperature Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
de Wijn, R., Rollet, K., Olieric, V., Hennig, O., Thome, N., Noûs, C., Paulus, C., Lorber, B., Betat, H., Mörl, M., Sauter, C. Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip. J. Vis. Exp. (169), e61972, doi:10.3791/61972 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image