İn vitro Biyomühendislik Kalp Dokuları Olarak Kardiyak Sferoidler İnsan Kalp Patofizyolojisi Çalışma

NOT: Bu protokol için kullanılan hiPSC-CM’ler ticari olarak kullanılabilir. Gerekirse bu işe başlamadan önce lütfen kurumsal insan etik kurulunun onayını isteyin. 1. İnsan kardiyak fibroblast ve endotel hücre kültürü kaplama ve büyüme 37 °C’de bir su banyosunda HCF ve HCAEC içeren cryovial’ları bir dakika lığına eritin. Steril laminar akış biyogüvenlik kabine sınıf 2 altında cryovials taşıyın. 1000 μL’lik pipet ucu kullanarak cryoviallerden 1 mL hücre süspansiyonu alın ve HCAEC’ler için 7 mL İnsan Kardiyak Fibroblast Orta ve HCAEC’ler için 7 mL Human Meso Endo Growth Medium içeren 15 mL’lik bir tüp ekleyebilirsiniz.NOT: Her cryovial’dan hücrelerin çoğunluğunu toplamak için, aynı 15 mL tüpten 1 mL kültür ortamı ile iki kez durulayın. Hücre süspansiyonlarını hafifçe karıştırın. Hücre süspansiyonlarını 10 mL serolojik pipet kullanarak T75 kültür şişelerini ayırmak için aktarın. 37 °C’de %5 CO2ile inküb hücreler. 18 saat sonra, her iki kültür şişelerinden orta aspire ve dondurucu orta ve ölü hücreleri kaldırmak için steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez durulayın. PBS’yi her kültür şişesine 7 mL uygun kültür ortamı ile değiştirin ve 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Hücresel genişlemeyi ve canlılığı düzenli olarak inceleyin ve hücreler -90 biraraya gelene kadar her gün ortamı değiştirin. 2. iCM kültür kaplama ve büyüme 40 μg/mL fibronektin (FN) içeren 2 mL PBS ve 37 °C’de kuluçka, en az 4 saat boyunca %5 CO2 içeren iki Adet T25 kültür şişesi ön kat. 4 saat sonra, bir cryovial içeren iCMs toplamak ve 4 dakika için 37 °C’de bir su banyosu yerleştirin. Steril laminar akış biyogüvenlik kabine sınıf 2 altında cryovial taşıyın. ICM’leri 1 mL pipet ucu kullanarak cryovial’dan steril 50 mL santrifüj tüpe hafifçe aktarın. Boş iCMs cryovial 1 mL oda sıcaklığında kaplama orta ile herhangi bir artık hücreleri kurtarmak için durulayın. 90 sn’nin üzerindeki cryovial damla dan kaplama orta durulama 1 mL iCM hücre süspansiyon içeren 50 mL santrifüj tüp aktarın.NOT: Çözeltiyi tamamen karıştırmak ve çözülmüş hücrelerdeki ozmotik şoku azaltmak için ortayı eklerken tüpü yavaşça döndürün. 50 mL santrifüj tüpüne yavaşça 8 mL oda sıcaklığında Kaplama Medium ekleyin. 30 – 60 s üzerinde ilk 1 mL damla akıllıca ekleyin. Daha sonra, sonraki 30 s üzerinde kalan hacmi ekleyin. Kaplama ortamını eklerken santrifüj tüpünü hafifçe döndürün. 50 mL santrifüj tüpünün içeriğini 2 – 3 kez ters çevirerek (güçlü titreme veya girdaplardan kaçınarak) yavaşça karıştırın. Hemen bir hemositometre kullanarak hücre sayma gerçekleştirmek ve canlı hücre yoğunluğunu belirlemek (hücre / mL). FN ön kaplamalı T25 şişelerini alın ve şişelerin kurumasına izin vermeden FN-PBS çözeltisini aspire edin. Bu iCMs tohumlama hacmi eklemek için (1.6 x 106 8 mL oda sıcaklığında kaplama orta canlı iCMs). 37 °C’de 48 saat kuluçka makinesinde kültür iCM’leri, %5 CO2. Bakım Ortamını kullanımdan bir gün önce 4 °C’de bir gecede eritin. Bakım Ortamını 37 °C’lik bir su banyosunda dengeleyin ve hemen kullanın. 2 gün sonra, iCMs T25 şişelerini biyogüvenlik kabininin altına taşıyın. Platin ortasını 5 kez hafifçe borulandırarak ölü hücreleri ve döküntüleri hafifçe yıkayın. Kaplama Ortamını aspire edin ve önceden ısıtılmış Bakım Ortamının 8 mL’si ile değiştirin. T25 şişelerini kuvöze geri yerleştirin. Bakım Ortamını her gün değiştirin ve birleşimi düzenli olarak inceleyin. 3. Hücre izolasyonu ve sayma 3.2-3.12 adımlarını izleyerek önce HCAEC’leri ve HCF’leri ve ardından iKM’leri toplayarak başlayın. 10 mL iCMs Bakım Ortamı, 5 mL İnsan Kardiyak Fibroblast Orta ve 5 mL Meso Endo Büyüme Ortamı karıştırılarak CS kültür ortamı hazırlayın. HcF’ler ve HCAEC’ler içeren her doku şişesinden kültür ortamını çıkarın ve T75 şişeleri için 5 mL PBS ile bir kez durulanın. PBS’yi kaldırın. Her T75 şişesine %0,25 tripsin EDTA çözeltisi 5 mL ekleyin ve 37 °C’de 5 dakika, %5 CO2’deinkübül. Hücreler bir kez detach, hemen kültür orta 5 mL ile tripsin EDTA çözeltisi nötralize. Hücre süspansiyonlarını 15 mL’lik bir tüpe ve santrifüj hücrelerine 300 x g’da 4 dk aktarın. Supernatant’ı her tüpten dikkatlice çıkarın. Her hücre peletine 1 mL CS orta ekleyin ve yeniden askıya alın. Tüp buz üzerinde tutun ve Trypan Mavi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Bakım Ortamını iC’ler içeren doku şişelerinden çıkarın ve 3 mL PBS ile bir kez durula. Her T75 şişesine %0,25 tripsin EDTA çözeltisi 1 mL ekleyin ve 37 °C,%5 CO2’dekuluçkaya yatırın. Ayrılana kadar her dakika hücreleri kontrol edin. Hücreler bir kez detach, hemen kültür orta 4 mL ile tripsin EDTA çözeltisi nötralize. Hücre süspansiyonlarını 15 mL’lik bir tüpe aktarın ve 5 dk boyunca 300 x g’da santrifüj edin. Supernatant’ı her tüpten dikkatlice çıkarın. Hücre peletine 1 mL kültür ortamı ekleyin ve yeniden askıya alın. Tüp buz üzerinde tutun ve Trypan Mavi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak. 4.CS üretimi ve büyümesi 20 μL CS orta içeren asma damla kültürü başına 10.000 iCM, 5.000 HCF ve 5.000 HCAEC kaplama ile 2:1:1 oranında iCM’leri, HHC’leri ve HCAEC’leri karıştırın. Toplam CS sayısı için son ses birimine ayarlayın. Pipet 20 μL hücre süspansiyonu 384 iyi HDC plakanın her bir kuyununiçine manuel olarak veya otomatik sıvı işleme için robotik çok kanallı pipet kullanarak. Pipet 1.5 mL steril PBS CSs. Incubate HDC plaka 37 °C kurutmaönlemek için Asılı Bırakma Plakası etrafında kanalın her iki tarafında. Kuyuların çoğunda tam olarak oluşan bir küresel gözlemlenene kadar GÜNLÜK OLARAK CSs oluşumunu inceleyin. Bir CS oluşana kadar her iki günde bir kuyuya 7,5°L CS orta ekleyin. 5.CS kollajen jellere gömme 1 mL pipet ucu ile CSs toplayın.NOT: Pipetin ucunu steril keskin bir yüzeyle (neşter veya makas) kullanmadan önce kenardan yaklaşık 0,2 cm kesmek gerekir. CS süspansiyonu buz üzerinde 50 mL’lik bir tüpe toplayın. 5 dk için 300 x g tüp santrifüj.NOT: Elde edilen pelet kullanıma kadar buz üzerinde tutulmalıdır. Fare kuyruk kollajeni ve CS orta kullanarak buz üzerinde 3:7 oranında bir kollajen jel çözeltisi (100 μL/iyi 96 kuyu 30 kuyu için) hazırlayın. CSs içeren tüpten supernatant çıkarın. Kollajen jel çözeltisi içinde peletli CSs karıştırın. CS-kollajen jel süspansiyonuna 1 μL/mL 5 mM sodyum hidroksit ekleyin ve hafifçe karıştırın. 100 μL CS-kollajen jeli net düz bir alt 96 iyi siyah polistiren mikroplakave 30 dakika boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatırın. 6. DOX ile tedavi edilen CS’lerin canlılık ve toksisite ölçümleri 30 dk sonra kuvözden 96 kuyu plakasını toplayın 10 μM DOX hazırlayın (CSs14’tehücre ölümü için önceden belirlenmiş protokole göre).NOT: BOS’larda HF’ye karşı koruyabilecek diğer aracıları test etmek için DOX + Agent A, B, vb. içeren çözümler üretin. Her kuyuya DOX ve/veya diğer ajanlar içeren 100 μL’lik çözümler ekleyin. Kontrol kültürleri herhangi bir DOX olmadan medya içerir. 37 °C’de 18 saat kuluçka plakası, %5 CO2. Ertesi gün, Live/Dead boyama reaktifi stok çözeltilerini toplayın ve biyogüvenlik kabininde karanlıkta buz üzerinde erimelerine izin verin. Hoechst lekesi, 4 μM ethidyum homodimer ve 2 μM calcein-AM içeren bir çözelti hazırlayın. Her kuyuya 100 μL Hoechst lekesi, kalcein-AM/ethidium homodimer çözeltisi ekleyin. Floresan’ı her kuyuya ethidium homodimer için 645 nm ve çok modlu mikroplaka okuyucu kullanarak sırasıyla calcein-AM için 530 nm olarak ölçün. Floresan ölçümlerini Graphpad PRISM’e (veya istatistiksel analiz için eşdeğer bir yazılıma) aktarın. Veri analizi ve istatistikleri için GraphPad Prizma yazılımLarını kullanın. Kalite kontrol için, calcein-AM ve ethidyum homodimer ile birlikte çekirdek boyama için bir epifloresan mikroskobu altında kontrol edin. 7.CS kontraktil fonksiyon değerlendirmesi Adım 5.8’de hazırlanan mikroplakayı toplayın. Video tabanlı kenar algılama, Floresan Yardım Arabirimi ve MyoPacer Alan Uyarıcısı için IonOptix yazılımını içeren bilgisayarı açın. Doku tutucu platforma yeni bir kapak fişi yerleştirin ve elektrotlarla su banyosu monte edin. Kollajen jellerden, kenardan 0,5 mm kesilmiş 1 mL pipet ucu kullanarak CS’leri yavaşça toplayın ve bir şahin tüpüne aktarın. CSs. Transfer CS (birer birer birer) IonOptix sisteminin aşamasında medya birkaç μL ile kuruma önlemek için CS üzerine medya ekleyin. IonOptix yazılımını kullanarak CS’nin sol ve sağ tarafındaki zirveleri ayarlayarak analiz edilecek CS’yi seçin. CS kenarlarının hareketini izlemek için bilgisayar tabanlı hareket çözümleyicisini kullanın.NOT: Normalde kontraktür % hücre kısaltması veya % kesirli kısaltma ile ölçülür. Bu durumda% sheroid kısalması ölçtük. Bilgisayardan eşik ve kenar seçeneklerini ayarlayarak hem tepe noktalarını stabilize edin. Myopacer Alan Uyarıcısını kullanarak CSs’leri farklı frekanslara (0.3, 0.6, 1, 2 ve 3 Hz) ve gerilimlere (1, 2, 3 ve 5 V) maruz bırakın. DOX ile tedavi edilen ve işlenmemiş CS’lerin CS uzunluğu değişiklikleri olarak spheroid kısalma kaydedin. 8. CSs mikroskobu: fiksasyon ve immünetiketleme 30 dakika sonra 96 iyi plaka toplamak (adım 5.8 olarak hazırlanan) ve oda sıcaklığında 1 saat için% 4 paraformaldehit (PFA) CSs düzeltmek. PfA’yı çıkarın ve %0.01 sodyum azit (PBSA) içeren PBS ile üç kez durulayın. PBSA’yı kaldırın. Bir shaker üzerinde 30 dakika boyunca her kuyuya %0,02 Triton-X-100 içeren 200 μL PBSA ekleyin.NOT: Bu adım daha iyi antikor infiltrasyonu için CSs permeabilize. Oda sıcaklığında 60 dakika PBSA çözeltisi içinde % 3 sığır serum albumin 200 μL ekleyin.NOT: Bu adım, CSs’de spesifik olmayan antikor bağlanmasını engeller. Bloklama çözeltisinde seyreltilmiş CD31’e karşı 10 μg/mL birincil fare anti-insan antikorları içeren bir çözelti hazırlayın. Her kuyuya 100 μL primer antikor çözeltisi ekleyin ve bir shaker üzerinde 4 °C’de bir gecede kuluçkaya yatırın. Bir sallanan plaka üzerinde oda sıcaklığında 20 dakika pbsa ile üç kez plaka durulayın. Hoechst DNA lekesi ve bloke çözeltisinde seyreltilmiş Cy3 konjuge ikincil eşek anti-fare antikorunun 10 μg/mL’sini içeren bir çözelti hazırlayın. Her kuyuya Hoechst lekesi içeren 100 μL ikincil antikor solüsyonu ekleyin ve bir shaker üzerinde 4 °C’de gece boyunca kuluçkaya yatırın.NOT: Bu noktadan itibaren plakayı alüminyum folyo ile kapatın. Bir sallanan plaka üzerinde oda sıcaklığında PBSA ile 20 dakika boyunca plaka üç kez durulayın. Her kuyuya 100 μL Vectashield montaj ortamı ekleyin. Bir lazer tarama konfokal mikroskop altında Görüntü CSs. Z ekseni boyunca optik kesit gerçekleştirin ve ImageJ yazılımını kullanarak görüntüleri tek bir odak düzlemine daraltın.