ヒト心臓病態生理学を研究するインビトロバイオエンジニアリング心臓組織としての心臓スフェロイド

注: このプロトコルに使用される hiPSC-CM は市販されています。必要に応じて、この作業を開始する前に、制度的な人間倫理委員会の承認を求めてください。 1. ヒト心臓線維芽細胞および内皮細胞培養めっきと増殖 37°Cの水浴にHFとHCAICを含む凍結を1分間解凍する。 滅菌層流量バイオセーフティキャビネットクラス2の下でクライオビアルを移動します。 1000 μL ピペットチップを使用して、クリオシャルから 1 mL の細胞懸濁液を収集し、HF 用のヒト心臓線維芽細胞培地 7 mL と HAIC 用のヒトメソ Endo 成長培地 7 mL を含む 15 mL チューブに追加します。注:各凍結細胞から細胞の大部分を収集するために、同じ15 mLチューブから1mLの培養培地で2回リンスします。 細胞懸濁液を軽く混ぜます。 細胞懸濁液を10 mL血清ピペットを用いてT75培養フラスコを分離する。 5%CO2で37°Cで細胞をインキュベートする。 18時間後、両方の培養フラスコから培地を吸引し、滅菌リン酸緩衝生理食塩液(PBS)で一度リンスし、凍結培地および死細胞を除去する。 各培養フラスコに対してPBSを7mLの適切な培養培地に置き換え、37°Cでインキュベートする。 細胞の拡張と生存率を定期的に調べ、細胞が80〜90%の合流に達するまで1日おきに培地を交換します。 2. iCM培養めっきと成長 フィブロネクチン(FN)の40μg/mLを含む2mLのPBSを用いた2つのT25培養フラスコをプレコートし、37°Cでインキュベートし、5%CO2を少なくとも4時間培養した。 4時間後、iCMを含む1つのクライボシャルを集め、37°Cの水浴に4分間置きます。 滅菌層流のバイオセーフティキャビネットクラス2の下でクライオビアルを移動します。 1 mL ピペットチップを使用して、iCM を凍結管から無菌 50 mL 遠心分離チューブにそっと移します。 空のiCMを1 mLの室温メッキ培地で洗い換え、残留細胞を回収します。1 mLのメッキ培地リンスを、90秒以上の凍結滴下から、iCM細胞懸濁液を含む50 mL遠心分離管に移します。注:溶液を完全に混合し、解凍した細胞の浸透衝撃を減少させるために媒体を追加しながら、チューブを穏やかに旋回させます。 50 mL遠心分離管に室温めっき培地を8 mLゆっくり加えます。最初の 1 mL を 30 ~ 60 s 以上のドロップワイズに追加します。次に、残りのボリュームを次の 30 s に追加します。めっき媒体を加えながら遠心管を軽く旋回します。50 mL遠心管の内容物を2~3回反転して軽く混ぜます(激しい揺れや渦を避ける)。 速やかに、ヘモサイトメーターを使用して細胞計数を行い、生存可能な細胞密度(細胞/mL内)を決定します。 FNプレコーティングされたT25フラスコを取り、フラスコを乾燥させることなくFN-PBS溶液を吸引する。これにiCMのシード量を加える(8 mL室温めっき媒体で1.6 x 10 6実行可能なiCM)。 培養器内の培養iCMは、37°Cで48時間、5%CO2. 使用前の1日4°Cでメンテナンス中の媒体を一晩解凍してください。 メンテナンス中の媒体を37°Cの水浴で平衡化し、すぐに使用してください。 2日後、バイオセーフティキャビネットの下でiCM T25フラスコを移動します。 めっき培地を5回軽くピペット化して、死んだ細胞や破片を静かに洗い流します。 めっき媒体を吸引し、予め温めたメンテナンスミディアムの8 mLに交換してください。T25フラスコをインキュベーターに戻します。メンテナンスメディアを1日おきに交換し、コンフルエンスを定期的に確認します。 3. 細胞の分離とカウント 最初の HAIC と HCF を収集してから、次の手順 3.2 ~ 3.12 に従って iCM を収集します。 ICM維持培地の10mL、ヒト心臓線維芽細胞培地の5mLおよび5mLのメソ遠心成長培地を混合してCS培地を調製する。 HFLおよびHcAICを含む各組織フラスコから培養培地を取り出し、T75フラスコ用に5mL PBSで一度リンスします。PBS を削除します。 0.25%のトリプシンEDTA溶液を5 mLずつT75フラスコに加え、37°C、5%CO2で5分間インキュベートします。 細胞が取り外されると、5 mLの培養培地で直ちにトリプシンEDTA溶液を中和する。 細胞懸濁液を15mLチューブに移し、遠心分離細胞を300xgで4分間移動させます。 各チューブから上清を慎重に取り除いてください。各細胞ペレットに1mLのCS培地を加え、再懸濁します。氷の上にチューブを維持し、トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。 iCMを含む組織フラスコからメンテナンス培地を取り除き、PBSの3 mLで一度すすいします。 各T75フラスコに0.25%トリプシンEDTA溶液の1mLを加え、37°C、5%CO2でインキュベートする。切り離されるまで、毎分セルをチェックします。 細胞が取り外されると、4 mLの培養培地で直ちにトリプシンEDTA溶液を中和する。 細胞懸濁液を15mLチューブに移し、300 x gで5分間遠心分離します。 各チューブから上清を慎重に取り除いてください。培養液1mLを細胞ペレットに加え、再懸濁させた。氷の上にチューブを維持し、トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。 4.CS世代と成長 CS培地20μLを含む吊り下げ培養液10,000個、HCF5,000、および吊り下げ液1回当たり5,000 HAICをめっきすることにより、2:1:1の比率でiCM、HcF、およびHCAICを混合します。CD の合計数の最終ボリュームに合わせて調整します。 384ウェルHDCプレートの各ウェルに、手動で、または自動液体処理用のロボットマルチチャンネルピペットを使用して、細胞懸濁液のピペット20 μL。 ハンギングドロッププレートの周りのチャネルの両側に無菌PBSのピペット1.5 mLは、CSを乾燥させないようにします。 完全に形成されたスフェロイドが大多数のウェルで観察されるまで、毎日のCDの形成を調べる。CSが形成されるまで、1日おきに7.5μLのCS培地を各ウェルに加えます。 5.CSコラーゲンゲルに埋め込む 1 mL ピペットチップで CD を収集します。注:ピペットの先端を、そのコレクション中にスフェロイドを埋め込んだ損傷を防ぐために、無菌の鋭い表面(メスまたははさみのいずれか)で使用する前に、エッジから約0.2 cmのピペットの先端を切断する必要があります。 CSサスペンションを氷上の50mLチューブに回収します。 チューブを300 x gで5分間遠心します。注:得られたペレットは、使用するまで氷の上に保管する必要があります。 ラットテールコラーゲンとCS培地を3:7比で使用し、氷の上にコラーゲンゲル溶液(96ウェルプレートの30ウェルに対して100 μL/well)を調製します。 上清を詰められたチューブから取り除く。 コラーゲンゲル溶液内でペレット化したCDを混ぜます。 CS-コラーゲンゲルサスペンションに水酸化ナトリウム5mMの1μL/mLを加え、やさしく混ぜます。 100 μLのCS-コラーゲンゲルを透明なフラットボトム96ウェルブラックポリスチレンマイクロプレートに移し、37°Cで30分間インキュベートします。 6. DOX処理CDの生存率と毒性測定 30分後インキュベーターから96ウェルプレートを収集 10 μM DOX を準備します(CS14で細胞死のための以前に確立されたプロトコルに基づく)。注: CS で HF から保護する可能性のある他のエージェントをテストする可能性がある場合は、DOX + エージェント A、B などを含むソリューションを生成します。 DOXおよび/または他のエージェントを含む100 μLのソリューションを各ウェルに追加します。コントロール カルチャには、DOX を使用しないメディアが含まれています。 インキュベートプレートは37°Cで18時間、CO2は5%である。 翌日、ライブ/デッド染色試薬ストックソリューションを収集し、バイオセーフティキャビネットで暗闇の中で氷の上で解凍することができます。 ヘーヒスト染色、4 μMのエチジウムホモジマー、2 μM カルセイン-AMを含む溶液を調製します。 100 μLのヘヒスト染色、カルセインAM/エチジウムホモジマー溶液を各ウェルに加えます。 マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、645 nmのエチジウムホモジマーの場合は645 nm、カルセイン-AMの場合は530 nmで各ウェルに蛍光を測定します。 蛍光測定をグラフパッドPRISM(または統計分析のための同等のソフトウェア)に移します。 データ分析と統計にグラフパッド Prism ソフトウェアを使用します。 品質管理のために、核染色のための蛍光顕微鏡の下で、カルセインAMおよびエチジウムホモジマーと共に点検してください。 7.CS収縮関数評価 ステップ5.8で準備したマイクロプレートを収集します。 ビデオベースのエッジ検出、蛍光支援インターフェイス、およびMyoPacerフィールド刺激装置用のIonOptixソフトウェアを含むコンピュータをオンにします。 ティッシュホルダーのプラットホームに新しいカバースリップを置き、電極と水浴を組み立てる。 1 mL ピペットチップカットを使用してコラーゲンゲルからCSを丁寧に採取し、その端から0.5mmカットして、ハヤブサチューブに移します。CSにメディアを追加して、CsSの乾燥を防ぎます。 IonOptixソフトウェアを使用 して 、CSの左右のピークを設定して分析するCSを選択します。 コンピュータベースのモーションアナライザを使用して、CS エッジの動きを追跡します。注: 通常、収縮は%セルの短縮または分数の縮小率で測定されます。この場合、回転楕円体短縮率を測定した。 コンピュータからしきい値とエッジ のオプションを調整するピークを安定させる。 ミオパサーフィールド刺激装置を使用して、異なる周波数(0.3、0.6、1、2、3 Hz)と電圧(1、2、3、5 V)にCSを露出させます。 DOX処理および未処理のCSのCS長変化に伴うスフェロイド短縮を記録します。 8. CDの顕微鏡:固定と免疫標識 30分後(ステップ5.8で作成)96ウェルプレートを回収し、室温で1時間の4%パラホルムアルデヒド(PFA)にCSを固定します。 0.01%のアジドナトリウム(PBSA)を含むPBSでPFAを3回除去し、すすいでください。 PBSA を削除します。 0.02%トリトンX-100を含むPBSAを200μLずつ、シェーカーで30分間各ウェルに追加します。注:このステップは、より良い抗体浸潤のためにCDを透過させます。 PBSA溶液に200μLの3%ウシ血清アルブミンを室温で60分間加えます。注:このステップは、CD内の非特異的抗体結合をブロックします。 ブロッキング溶液で希釈したCD31に対して、10μg/mLの一次マウス抗ヒト抗体を含む溶液を調製します。 各ウェルに100μLの一次抗体溶液を加え、シェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。 ロッキングプレート上の室温で20分間PBSAでプレートを3回洗いすみます。 Hoechst DNA染色と10 μg/mLのCy3-共役ロバ抗マウス抗体をブロッキング溶液に希釈した溶液を調製します。 各ウェルにHoechst染色を含む2次抗体溶液100μLを加え、シェーカー上で一晩4°Cでインキュベートします。注:この時点以降、アルミホイルでプレートを覆います。 ロッキングプレート上の室温でPBSAでプレートを20分間3回洗いすみます。 ベクタシールド取り付け媒体を100μLずつ各ウェルに追加します。 レーザー走査共焦点顕微鏡下の画像CD。Z軸に沿って光断面を行い、ImageJソフトウェアを使用して画像を単一の焦点面に集約します。