ספרואידים לב כמו במבחנה ביו מהונדסת רקמות לב לחקור פתופיזיולוגיה לב אנושי

הערה: hiPSC-CMs המשמשים עבור פרוטוקול זה זמינים באופן מסחרי. נא בקשו את אישור ועדת האתיקה האנושית המוסדית לפני תחילת עבודה זו במידת הצורך. 1. פיברובלסט לב אנושי ותרבית תא אנדותל ציפוי וצמיחה הפשרה cryovials המכיל HCFs ו HCAECs באמבט מים ב 37 ° C לדקה אחת. להעביר cryovials תחת זרם למינאר סטרילי זרימה biosafety ארון כיתה 2. לאסוף 1 מ”ל של מתלה תא מן cryovials באמצעות קצה פיפטה μL 1000 ולהוסיף לתוך צינור 15 מ”ל המכיל 7 מ”ל של פיברובלסט לב אנושי בינוני עבור HCFs ו 7 מ”ל של אדם Meso אנדו צמיחה בינוני עבור HCAECs.הערה: על מנת לאסוף את רוב התאים מכל cryovial, לשטוף אותם פעמיים עם 1 מ”ל של תרבות בינונית מאותו צינור 15 מ”ל. מערבבים בעדינות מתלי תאים. העבר מתלי תאים כדי להפריד בין מבחנות תרבות T75 באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ”ל. דגירה תאים ב 37 °C עם 5% CO2. לאחר 18 שעות, לשאוף את המדיום משני מבחנות התרבות ולשטוף אותם פעם אחת עם פוספט סטרילי אגירה תמיסת מלח (PBS) כדי להסיר הקפאת תאים בינוניים ומתים. החלף PBS עם 7 מ”ל של תרבות מתאימה בינוני לכל בקבוקון תרבות דגירה ב 37 ° C. לבחון את ההתרחבות הסלולרית ואת הכדאיות באופן קבוע ולהחליף את המדיה כל יומיים עד לתאים להגיע 80-90% confluency. 2. ציפוי תרבות iCM וצמיחה לפני מעיל שני מבחנות תרבות T25 עם 2 מ”ל של PBS המכיל 40 μg / מ”ל של פיברונקטין (FN) דגירה ב 37 °C, 5% CO2 לפחות 4 שעות. לאחר 4 שעות, לאסוף cryovial אחד המכיל iCMs ולמקם אותו באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות. הזז את ההקפאה תחת ארון אבטחה ביולוגית של זרימת למינאר סטרילי מחלקה 2. העבר בעדינות את ה-iCMs מההקפאה לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ”ל באמצעות קצה פיפטה של 1 מ”ל. לשטוף את cryovial iCMs ריק עם 1 מ”ל של ציפוי טמפרטורת החדר בינוני כדי לשחזר את כל התאים שיורית. העבר את 1 מ”ל של ציפוי בינוני לשטוף מן cryovial טיפה חכם מעל 90 שניות לצינור צנטריפוגה 50 מ”ל המכיל את מתלי תא iCM.הערה: מערבבים בעדינות את הצינור תוך הוספת המדיום כדי לערבב את הפתרון לחלוטין ולהקטין את ההלם אוסמוטי על התאים הפשרת. לאט להוסיף 8 מ”ל של טמפרטורת החדר ציפוי בינוני לצינור צנטריפוגה 50 מ”ל. להוסיף את הראשון 1 מ”ל dropwise מעל 30 – 60 s. לאחר מכן, הוסף את אמצעי האחסון הנותר על-פני 30 השניות הבאות. מערבבים בעדינות את צינור הצנטריפוגה תוך הוספת מדיום הציפוי. מערבבים בעדינות את תכולת צינור הצנטריפוגה 50 מ”ל על ידי היפוך 2 – 3 פעמים (הימנעות מרעידות נמרצות או מערבולות). מיד לבצע את ספירת התא באמצעות hemocytometer ולקבוע את צפיפות התא קיימא (בתאים / mL). קח את מבחנות ה-T25 המצופים מראש FN ושאף את פתרון FN-PBS מבלי לתת למבחנות להתייבש. כדי להוסיף נפח זריעה של iCMs (1.6 x 106 iCMs קיימא ב 8 מ”ל טמפרטורת חדר ציפוי בינוני). ICMs תרבות באינקובטור עבור 48 שעות ב 37 °C, 5% CO2. הפשיר את מדיום התחזוקה למשך הלילה ב-4°C יום לפני השימוש. לצייד את מדיום התחזוקה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ולהשתמש בו באופן מיידי. לאחר יומיים, העבר את מבחנות ICMs T25 מתחת לארון ההסתה הביולוגית. לשטוף בעדינות את התאים המתים ופסולת על ידי בעדינות pipetting מדיום ציפוי למעלה ומטה 5 פעמים. שאפף את מדיום הציפוי והחלף ב-8 מ”ל של מדיום תחזוקה חם מראש. מניחים את מבחנות T25 בחזרה באינקובטור. החלף את מדיום התחזוקה כל יומיים ובדוק את הקונפלציה באופן קבוע. 3. בידוד תאים וספירה התחל על-ידי איסוף HCAECs ו- HCFs הראשון, ולאחר מכן iCMs על-ידי ביצוע שלבים 3.2-3.12. להכין את תרבות CS בינוני על ידי ערבוב 10 מ”ל של iCMs תחזוקה בינונית, 5 מ”ל של פיברובלסט לב אנושי בינוני ו 5 מ”ל של Meso Endo צמיחה בינונית. הסר מדיום תרבות מכל בקבוקון רקמות המכיל HCFs ו HCAECs ולשטוף פעם אחת עם 5 מ”ל PBS עבור מבחנות T75. הסר את פי.בי.אס. הוסף 5 מ”ל של פתרון EDTA טריפסין 0.25% לכל בקבוקון T75 ותדגירה במשך 5 דקות ב- 37 °C, 5% CO2. לאחר התאים להתנתק, מיד לנטרל את פתרון EDTA trypsin עם 5 מ”ל של תרבות בינונית. העבר מתלי תאים לצינור 15 מ”ל ותאי צנטריפוגה ב- 300 x g למשך 4 דקות. הסר את הסופרנטנט בזהירות מכל שפופרת. הוסף 1 מ”ל של CS בינוני לכל גלולת תא ולתוסת אותם מחדש. שמור את הצינור על קרח ולספור תאים באמצעות טריפאן כחול וmocytometer. הסר מדיום תחזוקה ממבחנות רקמות המכילות iCMs ולשטוף פעם אחת עם 3 מ”ל של PBS. הוסף 1 מ”ל של 0.25% פתרון EDTA טריפסין לכל בקבוקון T75 דגירה ב 37 °C, 5% CO2. בדוק תאים כל דקה עד למנותק. לאחר התאים להתנתק, מיד לנטרל את פתרון EDTA trypsin עם 4 מ”ל של תרבות בינונית. העבר מתלי תאים לצינור 15 מ”ל וצנטריפוגה אותם ב 300 x g במשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט בזהירות מכל שפופרת. מוסיפים 1 מ”ל של תרבות בינונית לתא ופנסו אותו מחדש. שמור את הצינור על קרח ולספור תאים באמצעות טריפאן כחול וmocytometer. 4.CS ודור וצמיחה לערבב iCMs, HCFs ו HCAECs ב יחס 2:1:1 על ידי ציפוי 10,000 iCMs, 5,000 HCFs ו 5,000 HCAECs לכל תרבות ירידה תלויה המכילה 20 μL של CS בינוני. כוונן לנפח הסופי עבור המספר הכולל של CSs. Pipette 20 μL של מתלה תא לתוך כל באר של 384 גם לוח HDC או באופן ידני או באמצעות פיפטה רב ערוצית רובוטית לטיפול נוזלי אוטומטי. פיפט 1.5 מ”ל של PBS סטרילי בכל צד של הערוץ סביב לוח הטיפה התלויה כדי למנוע ייבוש CSs. דגירה HDC לוח ב 37 ° C. לבחון היווצרות של CSs על בסיס יומי עד spheroid בצורה מלאה נצפתה ברוב בארות. להוסיף 7.5 μL של CS בינוני זה לזה גם בכל יום אחר עד CS נוצר. 5.CS בהלטה בג’ל קולגן לאסוף CSs עם קצה פיפטה 1 מ”ל.הערה: יש צורך לחתוך את קצה פיפטה סביב 0.2 ס”מ מהקצה לפני השימוש בו עם משטח חד סטרילי (אזמל או מספריים) כדי למנוע כל נזק ג’ל מוטבע spheroids במהלך האוסף שלהם. לאסוף את מתלה CS לתוך צינור 50 מ”ל על קרח. צנטריפוגה הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות.הערה: יש לשמור את הכדור שהושג על קרח עד לשימוש. הכן תמיסת ג’ל קולגן (100 μL/well עבור 30 בארות של 96 צלחת היטב) על קרח באמצעות קולגן זנב חולדה וCS בינוני ביחס 3:7. הסר את חומר העל מהצינור המכיל CSs. מערבבים את ה-CSs עם הגלולה בתוך תמיסת ג’ל הקולגן. הוסף 1 μL/mL של 5 מ”מ נתרן הידרוקסיד מתלה ג’ל CS-קולגן ולערבב בעדינות. מעבירים 100 μL של ג’ל קולגן CS לתחתית שטוחה ברורה 96 גם מיקרו-פלטת פוליסטירן שחורה ותדגירה ב-37°C למשך 30 דקות. 6. מדידות קיימות ורעילות של CSS שטופלו על-ידי DOX לאחר 30 דקות לאסוף את צלחת 96 באר מהאינקובטור הכן DOX 10 μM (מבוסס על פרוטוקול שנקבע בעבר עבור מוות תאים ב- CSs14).הערה: כדי לבדוק סוכנים אחרים שעשויים להגן מפני HF ב- CSs, צור פתרונות המכילים DOX + סוכן A, B, וכו ‘. הוסף 100 μL של פתרונות המכילים DOX ו / או סוכנים אחרים לכל באר. תרבויות בקרה מכילות מדיה ללא כל DOX. דגירה צלחת עבור 18 שעות ב 37 ° C, 5% CO2. ביום שלמחרת, לאסוף את פתרונות מלאי Reagent כתמים חיים / מתים ולאפשר להם להפשיר על קרח בחושך בארונות אבטחה ביולוגית. הכן פתרון המכיל כתם Hoechst, 4 μM של אתידיום הומודימר ו 2 μM calcein-AM. להוסיף 100 μL של כתם Hoechst, קלצ’ין-AM / תמיסת הומודימר אתידיום לתוך כל באר. למדוד את הפלואורסצנס לתוך כל באר ב 645 צפון לm עבור אתידיום הומודימר וב 530 צפון צפון עבור calcein-AM, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרופלאטים multimode. העבר מדידות פלואורסצנטיות ל- Graphpad PRISM (או תוכנה מקבילה לניתוח סטטיסטי). השתמש בתוכנה של מנסרה של GraphPad לניתוח נתונים וסטטיסטיקה. לבקרת איכות, לבדוק תחת מיקרוסקופ epifluorescence עבור כתמים גרעין, יחד עם calcein-AM ואתידיום הומודימר. הערכת פונקציית .CS 7 לאסוף את המיקרו-פלטה כפי שהוכן בשלב 5.8. הפעל את המחשב המכיל את תוכנת IonOptix עבור זיהוי קצה מבוסס וידאו, ממשק הסיוע לפלואורסצנטיות וממריץ השדה MyoPacer. מניחים פתק כיסוי חדש על פלטפורמת מחזיק הרקמות והרכיבו אמבט מים עם אלקטרודות. אסוף בעדינות CSs מג’ל קולגן באמצעות קצה פיפטה 1 מ”ל לחתוך 0.5 מ”מ מהקצה ולהעביר אותם לצינור בז. הוסף מדיה ל- CS כדי למנוע ייבוש של CSs. העברת CS (אחד בכל פעם) עם כמה μL של מדיה על הבמה של מערכת IonOptix. בחר את ה- CS שיש לנתח באמצעות הגדרת פסגות בצד שמאל וימין של CS באמצעות תוכנת IonOptix. השתמש במנתח התנועה המבוסס על מחשב כדי לעקוב אחר התנועה של קצוות CS.הערה: בדרך כלל, התכווצות נמדדת ב- % קיצור תאים או בקיצור % שברים. במקרה הזה, מדדנו קיצור של ספרואידים. ייצב הן את פסגות התאמת סף ואפשרויות קצה מהמחשב. לחשוף CSs לתדרים שונים (0.3, 0.6, 1, 2 ו- 3 הרץ) ולחץ (1, 2, 3 ו- 5 V) באמצעות ממריץ השדה Myopacer. קיצור אורך CS של DOX ו- CSs שלא טופלו על-ידי DOX. 8. מיקרוסקופיה של CSS: קיבעון ואימונולציה לאסוף את צלחת 96 באר לאחר 30 דקות (כפי שהוכן בשלב 5.8) ולתקן CSs ב 4% paraformaldehyde (PFA) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. הסר PFA ולשטוף שלוש פעמים עם PBS המכיל 0.01% נתרן אזיד (PBSA). הסר PBSA. הוסף 200 μL של PBSA המכיל 0.02% Triton-X-100 לכל באר במשך 30 דקות על שייקר.הערה: שלב זה מחלחל ל- CSs להסתננות נוגדנים טובה יותר. הוסף 200 μL של 3% אלבומין סרום בשר בפתרון PBSA במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: שלב זה חוסם איגוד נוגדנים לא ספציפי ב- CSs. הכן פתרון המכיל 10 μg/mL של נוגדנים נגד בני אדם עכבר ראשי נגד CD31 מדולל בחסימת פתרון. הוסף 100 μL של פתרון נוגדן ראשי לכל באר ותדגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBSA במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על צלחת נדנדה. הכן פתרון המכיל כתם DNA Hoechst ו 10 μg / מ”ל של Cy3-conjugated חמור משני נגד עכבר נוגדן מדולל בחסימת פתרון. הוסף 100 μL של תמיסת נוגדנים משנית המכילה כתם Hoechst לכל באר ודגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר.הערה: מכסים את הצלחת בנייר כסף מאלומיניום מנומה זו ואילך. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים במשך 20 דקות עם PBSA בטמפרטורת החדר על צלחת נדנדה. להוסיף 100 μL של Vectashield הרכבה בינוני לכל באר. CSS תמונה תחת מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal. בצע מקטע אופטי לאורך ציר Z וכווץ תמונות לתוך מישור מוקד יחיד באמצעות תוכנת ImageJ.