Cardiale Sferoïden als in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

LET OP: hiPSC-CMs die voor dit protocol worden gebruikt, zijn commercieel beschikbaar. Gelieve de goedkeuring van de instellingscommissie voor de menselijke ethiek te vragen voordat u dit werk begint indien nodig. 1. Menselijke cardiale fibroblast en endotheelcelcultuur beplating en groei Dooi cryovials met HCFs en HCAECs in een waterbad bij 37 °C gedurende een minuut. Beweeg cryovials onder een steriele laminaire stroom bioveiligheid kast klasse 2. Verzamel 1 mL celsuspensie uit de cryovials met behulp van een 1000 μL pipettip en voeg toe in een 15 mL buis met 7 mL Human Cardiac Fibroblast Medium voor HCFs en 7 mL Human Meso Endo Growth Medium voor HCAECs.OPMERKING: Om de meerderheid van de cellen uit elke cryovial te verzamelen, spoel ze twee keer met 1 mL cultuurmedium uit dezelfde 15 mL buis. Meng voorzichtig celsuspensies. Breng celsuspensies over om T75-kweekkolven te scheiden met behulp van een serologische pipet van 10 mL. Incubeercellen bij 37 °C met 5% CO2. Na 18 uur, aspirate het medium uit beide kweekkolven en spoel ze een keer met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om bevriezing medium en dode cellen te verwijderen. Vervang PBS door 7 mL van geschikt kweekmedium aan elke cultuurkolf en incubate bij 37 °C. Onderzoek cellulaire expansie en levensvatbaarheid regelmatig en vervang media om de andere dag totdat cellen bereiken 80-90% samenvloeiing. 2. iCM cultuurbeplating en groei Precoat twee T25-kweekkolven met 2 mL PBS met 40 μg/mL fibronectin (FN) en incubate bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ten minste 4 uur. Verzamel na 4 uur een cryovial met iCM’s en plaats deze gedurende 4 minuten in een waterbad bij 37 °C. Verplaats de cryovial onder een steriele laminaire stroom bioveiligheid kast klasse 2. Breng de iCMs voorzichtig over van de cryovial naar een steriele 50 mL centrifugebuis met behulp van een 1 mL pipetpunt. Spoel de lege iCMs cryovial met 1 mL kamertemperatuur beplating medium om eventuele resterende cellen terug te vorderen. Breng de 1 mL beplating medium spoeling van de cryoviale druppel-wijs meer dan 90 sec naar de 50 mL centrifuge buis met de iCM cel suspensie.OPMERKING: Draai de buis voorzichtig terwijl u het medium toevoegt om de oplossing volledig te mengen en de osmotische schok op de ontdooide cellen te verminderen. Voeg langzaam 8 mL kamertemperatuur Plating Medium toe aan de 50 mL centrifugebuis. Voeg de eerste 1 mL dropwise toe boven de 30 – 60 s. Voeg vervolgens het resterende volume toe in de volgende 30 s. Draai de centrifugebuis voorzichtig aan terwijl u het beplatingsmedium toevoegt. Meng voorzichtig de inhoud van de 50 mL centrifugebuis door 2 – 3 keer om te keren (het vermijden van krachtig schudden of vortexen). Voer onmiddellijk het tellen van de cel uit met behulp van een hemocytometer en bepaal de levensvatbare celdichtheid (in cellen/mL). Neem de FN-voorgecoate T25 kolven en aspirate de FN-PBS oplossing zonder de kolven te laten drogen. Voeg hierbij het zaaivolume van iCMs toe (1,6 x10 6 levensvatbare iCMs in 8 mL kamertemperatuur beplatingsmedium). Cultuur iCMs in de incubator voor 48 uur bij 37 °C, 5% CO2. Ontdooi het Onderhoudsmedium ‘s nachts bij 4 °C een dag voor gebruik. Equilibrate het Onderhoudsmedium in een 37 °C waterbad en gebruik onmiddellijk. Verplaats na 2 dagen de iCM’s T25-kolven onder de bioveiligheidskast. Spoel dode cellen en puin voorzichtig af door het Plating Medium 5 keer op en neer te pipetten. Aspirate de Plating Medium en vervangen door de 8 mL van voorverwarmd Onderhoudsmedium. Plaats de T25 kolven terug in de couveuse. Vervang het Onderhoudsmedium om de andere dag en bekijk de samenvloeiing regelmatig. 3. Celisolatie en -telling Begin met het verzamelen van eerste HCAECs en HCF’s, en vervolgens iCMs door het volgen van stap 3.2-3.12. Bereid cs-kweekmedium voor door 10 mL iCMs Maintenance Medium, 5 mL Human Cardiac Fibroblast Medium en 5 mL meso Endo Growth Medium te mengen. Verwijder kweekmedium uit elke weefselkolf met HCF’s en HCAECs en spoel één keer af met 5 mL PBS voor T75-kolven. Verwijder PBS. Voeg 5 mL van 0,25% trypsine EDTA-oplossing toe aan elke T75-kolf en incubbate gedurende 5 minuten bij 37 °C, 5% CO2. Zodra cellen loskomen, neutraliseer onmiddellijk de trypsine EDTA-oplossing met 5 mL cultuurmedium. Breng celsuspensies over naar een buis van 15 mL en centrifugecellen op 300 x g gedurende 4 minuten. Verwijder de supernatant voorzichtig uit elke buis. Voeg 1 mL CS medium toe aan elke celpellet en maak ze opnieuw op. Houd de buis op ijs en tel cellen met behulp van Trypan Blue en een hemocytometer. Verwijder Maintenance Medium uit weefselkolven met iCM’s en spoel één keer af met 3 mL PBS. Voeg 1 ml van 0,25% trypsine EDTA-oplossing toe aan elke T75-kolf en incubeer bij 37 °C, 5% CO2. Controleer cellen elke minuut tot los. Zodra cellen loskomen, neutraliseer onmiddellijk de trypsine EDTA-oplossing met 4 mL cultuurmedium. Breng celsuspensies over naar een buis van 15 mL en vercentrifugeer ze op 300 x g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant voorzichtig uit elke buis. Voeg 1 mL kweekmedium toe aan de celpellet en verhoog het opnieuw. Houd de buis op ijs en tel cellen met behulp van Trypan Blue en een hemocytometer. 4.CS generatie en groei Mix iCMs, HCFS en HCAECs in 2:1:1 ratio door 10.000 iCMs, 5.000 HCF’s en 5.000 HCAECs per hanging drop cultuur met 20 μL CS medium te beplating. Pas aan het uiteindelijke volume voor het totale aantal CS’en. Pipette 20 μL celsuspensie in elke put van de 384 put HDC plaat handmatig of met behulp van een robotische multichannel pipet voor geautomatiseerde vloeistofbehandeling. Pipette 1,5 mL steriele PBS aan weerszijden van het kanaal rond de Hanging Drop Plate om uitdroging van CS’en te voorkomen. Incubate HDC-plaat bij 37 °C. Bestudeer de vorming van IG’s op een dagelijkse basis totdat een volledig gevormde sferoïde wordt waargenomen in de meerderheid van de putten. Voeg om de dag 7,5 μL CS-medium toe aan elke put totdat een CS wordt gevormd. 5.CS inbedding in collageengels Verzamel CS’en met een pipettip van 1 mL.OPMERKING: Het is noodzakelijk om de punt van pipet ongeveer 0,2 cm van de rand te snijden voordat het wordt gebruikt met een steriel scherp oppervlak (ofwel een scalpel of een schaar) om schade te voorkomen gel ingebed sferoïden tijdens hun collectie. Verzamel de CS-suspensie in een buis van 50 mL op ijs. Centrifuge de buis op 300 x g gedurende 5 minuten.LET OP: de verkregen pellet moet tot het gebruik op ijs worden gehouden. Bereid een collageengeloplossing (100 μL/put voor 30 putten van 96 putplaat) op ijs met behulp van rat staart collageen en CS medium in een 3:7 verhouding. Verwijder de supernatant uit de buis met CS’en. Meng de pelleted CS’en in de collageengeloplossing. Voeg 1 μL/mL natriumhydroxide van 5 mM toe aan de CS-collageen gel suspensie en meng voorzichtig. Breng 100 μL CS-collageengel over naar een heldere platte bodem 96 goed zwarte polystyreenmicroplaat en incubaat bij 37 °C gedurende 30 minuten. 6. Levensvatbaarheids- en toxiciteitsmetingen van met DOX behandelde ED’s Na 30 min verzamel je de 96 putplaat uit de couveuse Bereid een 10 μM DOX voor (gebaseerd op eerder vastgesteld protocol voor celdood in CSs14).OPMERKING: Om mogelijk andere agenten te testen die zich kunnen beschermen tegen HF in CS’s, genereert u oplossingen die DOX + Agent A, B, enz. Voeg 100 μL aan oplossingen toe die DOX en/of andere middelen bevatten aan elke put. Controleculturen bevatten media zonder DOX. Incubate plaat voor 18 uur bij 37 °C, 5% CO2. Op de volgende dag, het verzamelen van de Live / Dead kleuring reagens voorraad oplossingen en laat ze ontdooien op ijs in het donker in een biosafety kabinet. Bereid een oplossing voor met Hoechst-vlek, 4 μM ethidiumhodimer en 2 μM calcein-AM. Voeg 100 μL Hoechst-vlek, calcein-AM/ethidium homodimeeroplossing toe aan elke put. Meet de fluorescentie in elke put op 645 nm voor ethidium homodimeer en op 530 nm voor calcein-AM, respectievelijk met behulp van multimode microplate reader. Breng fluorescentiemetingen over naar Graphpad PRISM (of een gelijkwaardige software voor statistische analyse). Gebruik GraphPad Prism-software voor gegevensanalyse en statistieken. Controleer voor kwaliteitscontrole onder een epifluorescentiemicroscoop naar de nuclei-kleuring, samen met calcein-AM en ethidiumhomodimer. 7.CS contractielfunctieevaluatie Verzamel de microplaat zoals voorbereid in stap 5.8. Schakel de computer met de IonOptix-software in voor een videogebaseerde randdetectie, de Fluorescentie assistance interface en de MyoPacer Field Stimulator. Plaats een nieuwe afdeksel op het weefselhouderplatform en monteer het waterbad met elektroden. Verzamel voorzichtig 1S’en van collageengels met behulp van een 1 mL pipetpunt die 0,5 mm van de rand wordt gesneden en breng ze over naar een valkenbuis. Voeg media toe aan CS om het drogen van CS’en te voorkomen. Transfer CS (één voor één) met een paar μL media op het stadium van het IonOptix-systeem. Selecteer de CS die moet worden geanalyseerd via het instellen van pieken aan de linker- en rechterkant van CS met behulp van de IonOptix-software. Gebruik de computergebaseerde bewegingsanalyseer om de beweging van CS-randen bij te houden.OPMERKING: Normaal gesproken wordt contractiliteit gemeten in % celverkorting of % fractionele verkorting. In dit geval hebben we gemeten % sferoïde verkorting. Stabiliseer zowel de pieken die drempel- als randopties van de computer aanpassen. Stel CS’s bloot aan verschillende frequenties (0,3, 0,6, 1, 2 en 3 Hz) en spanningen (1, 2, 3 en 5 V) met behulp van de Myopacer Field Stimulator. Record sferoïde verkorting als CS lengte veranderingen van DOX-behandelde en onbehandelde CS’s. Analyseer gegevens met behulp van de Soft-Edge software en gemiddeld voor elke CS. 8. Microscopie van CS’en: fixatie en immunolabeling Verzamel de 96 put plaat na 30 min (zoals voorbereid in stap 5.8) en fix CSs in 4% paraformaldehyde (PFA) voor 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder PFA en spoel drie keer met PBS met 0,01% natriumazaide (PBSA). Verwijder PBSA. Voeg 200 μL PBSA met 0,02% Triton-X-100 toe aan elke put gedurende 30 minuten op een shaker.LET OP: Deze stap permeabiliseert CS’en voor een betere antilichaaminfiltratie. Voeg 200 μL van 3% runderserum albumine toe in PBSA-oplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.LET OP: Deze stap blokkeert niet-specifieke antilichaambinding in CS’en. Bereid een oplossing voor die 10 μg/mL primaire muisanti-menselijke antilichamen bevat tegen CD31 verdund in blokkeringsoplossing. Voeg 100 μL primaire antilichaamoplossing toe aan elke put en broed ‘s nachts bij 4 °C op een shaker. Spoel de plaat drie keer af met PBSA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een schommelplaat. Bereid een oplossing voor die Hoechst DNA-vlek en 10 μg/mL cy3-geconjugeerd secundaire ezelantimuisantilichaam bevat verdund in blokkeringsoplossing. Voeg 100 μL secundaire antilichaamoplossing met Hoechst-vlek toe aan elke put en broed ‘s nachts bij 4 °C op een shaker.LET OP: Bedek de plaat vanaf dit punt met aluminiumfolie. Spoel de plaat drie keer gedurende 20 minuten met PBSA op kamertemperatuur op een schommelplaat. Voeg 100 μL Vectashield montagemedium toe aan elke put. Beeld CSs onder een laser scanning confocale microscoop. Voer optische secties uit langs de Z-as en vouw beelden samen tot één brandpuntsvlak met ImageJ-software.