マウス真菌敗血症モデルにおける効率的な尾静脈注射のための現代的な温暖化/抑制装置

尾静脈注射と温暖化/抑制装置の使用を含むすべての動物プロトコルは、地元の機関動物ケア委員会(IACUC)によって審査され、承認されました。 1. 準備 少なくとも1週間の住宅環境で動物を順応し、食品および水のアドリビタムを可能にする。注:この注射技術のほとんどの新しいユーザーのために、尾静脈が皮膚を通して容易に見えるように白または明るい色の毛皮を有する動物株が好ましいかもしれません。マウス(例えば、C57BL/6)またはラット(例えば、ブラウンノルウェー)の暗色株は、深く色素化された尾を有し、静脈に対して弱い色コントラストをもたらす。新しいユーザーは、能力が得られるまで十分なトレーニングを受け入れるよう強くお勧めします。 尾静脈注射用薬剤 すべてのテスト エージェントとソリューションを無菌で準備します。生物や細胞材料を投与する場合は、熱物を含まない状態を維持するために、処理のすべてのステップで注意を要します。 通常の生理食塩水(0.9%w/v塩化ナトリウム)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などのバランスの取れた塩溶液のみを尾静脈注入の車両として使用してください。注意:血管損傷の潜在的なリスクのために水、油、または粘性溶液を使用しないでください。血液の緩衝効果とげっ歯類の速い血流率のために、幅広いpH(4.5-8.0)は許容範囲です。しかし、高酸性またはアルカリ性溶液は、注射部位で不必要な組織損傷を引き起こす可能性があり、避けるべきである。 射出の量と頻度を最小限に抑えます。マウスとラットの推奨体積(それぞれ≤200 μLと≤500 μL)を射出前の体温で使用して、動物3へのストレスを最小限に抑えてください。 注射器と針の各調製は、溶液中の気泡から解放されていることを確認します。気泡が存在する場合は、塞栓症のリスクを防ぐためにそれらを完全にパージします。注:通常、27 Gの1mLの注射器は、ほとんどの尾静脈注射には1/2-in針が適しています。 使い捨てまたは専用のガウンとラテックスまたはニトリル手袋の最小値と地元のIACUCによって必要とされる適切な個人的な保護具(PPE)を使用してください。尾静脈注射を行う場合は、安全メガネの使用を強くお勧めします。 温暖化と拘束装置 使用前にすべてのコンポーネントを注意深く点検し、デバイスに欠陥がないことを確認します(図1)。 ウォーミング・デバイスの初期化 (図 2A) 暖かいユニットを清潔な平らなベンチトップに置き、デバイスの電源を入れ、電源を入れろ。サーモスタットの電源インジケータランプが緑色に点灯していることを確認します。寝具を温室の中に置き、エリアを乾燥させ、熱を保ちます。 拘束装置のセットアップ (図 2B) 拘束単位を加温ユニットと並べて、動物に適したコーンサイズを決定します。必要に応じて、柔軟なアルミニウムコーンのベース幅を手動で調整して、動物に十分な拘束を提供します。あるいは、様々な体の大きさのマウスまたはラットを収容するために、コーンをカスタムフィットモデルに置き換えます。 2. 尾静脈注射 装置の調整 内部温度の設定 コントロールダイヤルを使用して、サーモスタットを希望の温度に設定します。ヒーターインジケータが赤色に点灯していること、および電球が点灯していることを確認します。電球が点灯している間は、内部温度表示を注意深く監視します(加熱)。サーモスタットは、目標温度に達すると、約10〜15分で自動的に電球を不活性化します。注:周囲温度よりも高い温度を設定すると、ヒーターがアクティブになります。一般に、標準的なビバリウム条件で推奨される収容温度は20〜26°Cの範囲で異なり、一方で、実験室用マウスの中性(すなわち、快適な)温度は30〜32°C42の間であると考えられる。したがって、温暖化チャンバの内部温度は、熱中性よりわずかに高く、およそ32〜36°Cで上昇することが推奨されます。 サーモスタットを体温より上に設定しないでください。 拘束プラットフォームの位置決め 高さ調整ノブを使用して、ユーザーに最適なレベルにコーンの高さを調整します。 熱処理(図3A) 目標温度(32~36°C)に達したら、動物をハウジングケージから温暖化チャンバーに静かに移します。注意:5~10分間の熱処理は、血管拡張を誘発し、尾静脈の視認性を高めるのに十分です。しかし、動物は、手順の間(通常、温熱の兆候のない20〜30分)の間、熱調節室に安全に保持することができます。温暖化室には、4~6匹のマウスまたは1匹のラットを安全に含めることができます。 急性熱ストレスの兆候(例えば、急速な呼吸、無気力、ジャンプエスケープ挙動)の兆候を動物を監視します。注意:温熱の徴候を示す動物は、再使用前に通常の活動を再開するまでケージに戻し、監視する必要があります。これが最適な範囲を超える内部温度が原因である場合は、ウォーミングデバイスの電源が切れていることを確認してください。 射出ステップ 尾の基部で動物を持ち上げ、温暖化室から取り除きます。拘束ユニットのコーン開口部に動物を導入します。注意: マウスを尾端から持ち上げないでください。これは、重傷につながる可能性があります。取り扱いの代替方法は、肥満または妊娠マウス28のために使用されるべきです。 動物が前足でコーンの遠端をつかむと、尾を後ろ向きにそっと引っ張り、開いたスリットを通します。側面静脈が12時の位置に示されるように、コーンのベースで動物の後端をコーンから突き出して固定します。両側に1つずつ、2つの側面静脈があるので、いずれかの後ろ足を突き出すことができます(図3B)。 親指と人差し指の間の非支配的な手で、尾の長さを3分の2に持ち、横静脈にわずかな張力を入れて尾の位置合わせと血管拡張を維持します。注: 熱処理による拡張静脈の可視性の向上により、最良の結果を得るために注入部位を迅速に決定することができます(図4)。 70%アルコールで湿らせたガーゼスポンジまたはパッドで注射部位の皮膚を拭きます。尾に刺激を避けるために、できるだけ穏やかに、迅速に清掃してください。注: この手順は、機関 IACUC の裁量で省略できます。 シリンジを支配的な手で持ち、針を尾に平行に置きます。針を血流の方向に挿入し、10~15°の角度(図5A–B)で傾斜し、2~4mmを貫通して静脈の内腔にさらに進みます(図5C-D)。ゆっくりと溶液を注入します。注:注入が成功した場合、プランジャーの抵抗は感じるべきで、流体が静脈を通って動いているのが見えます。注射部位の上に抵抗や白い水疱がある場合は、針を取り外し、元の針の配置の上の場所で2回目の注射を試みます。液体が最初の部位を通して放出するので、最初の注射部位の下に注入しようとしないでください。1つの側静脈の注入が失敗した場合は、動物を反対側に再配置し、対側静脈でより多くの試みを行う。試行の最大数は、静脈に沿って試みられた注射を開始する場所と、試行を逃した場合に発生する可能性のある腫れによって異なります。誤注射および関連する傷害に関する機関のIACUC規制を参照してください。 針を外し、親指をしっかりと押して、注入された溶液や血液の逆流を防ぎます。出血が止まるまで、清潔なガーゼ/ワイプまたはティッシュで穏やかな圧縮を続けます(図6)。 動物をケージに戻し、少なくとも5分間監視します。動物がさらなる出血なしに正常な活動を再開することを確認します。 3. 真菌性血流感染と敗血症のマウスモデル マウスの緊張 アクライジテニオススイスウェブスターは、制度的に推奨されるガイドラインごとに6週齢でマウスを繁殖させた。あるいは、このプロトコルに対して近血/遺伝子組換え株(例えば、C57BL/6バックグラウンド)を使用して、改変されたインノキュラを使用することもできます(注参照)。注 (詳細については、説明を参照): 暗いファーを持つマウスの尾静脈は、深く色素化された尾が原因で、薄い毛皮を持つものよりも見えないことが多い(図4)。異なるマウス株間で真菌敗血症/致死性に対する感受性が異なります。スイスウェブスター以外のマウス株の使用は、ホストの免疫状態に影響を与える可能性のある関連要因(例えば、遺伝的背景、年齢、性別、体の大きさ)を考慮することによって、追加のプロトコル最適化を必要とするかもしれない。例えば、C57BL/6マウスにおける致死的な挑戦は、典型的には、スイスのウェブスターマウスに見られる死亡率のレベルを達成するために、より高いイノキュラ(最大10倍)を必要とする。 微生物 致命的な挑戦(敗血症)のために、 カンジダアルビカンス 株DAY185(または選択した株)のストリーク冷凍株は、サボローデキストロース寒天に、30°Cで2日間インキュベートします。 1コロニーを10mL酵母エキスペプトンデキストローススープに移し、30°Cで18時間の静止した成長期に培養します。 イノキュラムソリューション 致死的な挑戦の日に、ブロス培養物を収集し、滅菌PBSで遠心分離(800×g)によってペレットを3回洗浄する。 トリパンブルー染料除外により生菌細胞を同定し、ヘモサイトメーターを用いて列挙する。室温で滅菌PBSで細胞濃度を1 x 106 細胞/mLに調整します。注:各動物は、接種液の100 μLを受け取ります。注入のプロシージャの間に潜在的な損失を可能にするためにイノキュラム(>500 μL)の余分な容積を準備する。最後の接種は、マウスあたり1 x 105 細胞です。接種量は、それに応じて細胞濃度を調整することで最大200μLまで増加させることができます。注意:真菌の接種液は、注射前に室温で保管する必要があります。イノキュラム溶液を体温に温め、酵母細胞からヒファエへの形態変化を引き起こす可能性がある。逆に、冷たい溶液のボーラスi.v投与は、動物の体温を急速に低下させることができ、避けるべきである。 静脈内接種 動物を温め、セクション2の手順に従って血管拡張を誘発する。 27 G、1/2イン針を用いた1 mLシリンジを使用して、100 μLの接種液を尾静脈に注入します。 接種後のモニタリング 敗血症誘発性の次の徴候について動物を監視する:i)毛皮の側面(例えば、 滑らか、フリル)、ii)活動(例えば、自由に動く、無反応)、iii)姿勢(例えば、ハンチ、硬い)、行動(例えば、遅い、位置が遅い)、v)胸部の動き(例えば、正常呼吸、呼吸困難)、vi)まぶた(例えば、開いた、閉じた)43。 敗血症スコアリング 各カテゴリの0から3までの4ポイントグレーディングスケールで敗血症(M-CASS)の変更されたマウス臨床評価スコアに従って観察された罹患率をスコアします: 0、正常;1、軽度。2、中程度。3、重度43. 任意のプロトコル:真菌敗血症に対するワクチン接種 致死的な挑戦の14日前に、Cの代わりにセクション3.2-3.4で説明されているように、カンジダ・ダブリンニエンシス株Wü284または減衰したC.アルビカン株(1匹あたり1×10 5細胞/マウス(1匹あたりマウス当たり1×10 5細胞)を有する接種マウス。 3.2~3.4項に記載されているように、ワクチン接種を受けたマウスで致死的な挑戦を行い、3.5~3.6項に記載の敗血症誘発性罹患率の徴候を監視する。