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Immunology and Infection

Un dispositif contemporain de réchauffement / retenue pour des injections efficaces de la veine de la queue dans un modèle de septicémie fongique murine

Published: November 06, 2020
doi:
10.3791/61961
, , ,
1Center for Oral and Craniofacial Biology,Louisiana State University Health-School of Dentistry, 2Department of Microbiology and Immunology,Tulane University School of Medicine

Summary

Ici, nous présentons une méthode efficace et efficiente pour les injections de veines de queue de rongeurs à l’aide d’un dispositif de réchauffement / retenue de conception unique. En rationalisant l’initiation des processus de vasodilatation et de contention, ce protocole permet des injections intraveineuses précises et opportunes de grands groupes d’animaux avec une détresse minimale.

Abstract

Dans les modèles de rongeurs, les injections de veines caudales sont des méthodes importantes pour l’administration intraveineuse d’agents expérimentaux. Les injections de veine caudale impliquent généralement le réchauffement de l’animal pour favoriser la vasodilatation, ce qui aide à la fois à identifier les vaisseaux sanguins et à positionner l’aiguille dans la lumière du vaisseau tout en retenant solidement l’animal. Bien que les injections de veines caudales soient des procédures courantes dans de nombreux protocoles et ne soient pas considérées comme très techniques si elles sont effectuées correctement, des injections précises et cohérentes sont cruciales pour obtenir des résultats reproductibles et minimiser la variabilité. Les méthodes conventionnelles d’induction de la vasodilatation avant les injections de veines caudales dépendent généralement de l’utilisation d’une source de chaleur telle qu’une lampe chauffante, des coussins chauffants électriques / rechargeables ou de l’eau préchauffée à 37 ° C. Bien qu’ils soient facilement accessibles dans un laboratoire standard, ces outils souffrent évidemment d’une capacité thermorégulatrice médiocre ou limitée. De même, bien que diverses formes de dispositifs de retenue soient disponibles dans le commerce, ils doivent être utilisés avec précaution pour éviter tout traumatisme aux animaux. Ces limites des méthodes actuelles créent des variables inutiles dans les expériences ou entraînent des résultats variables entre les expériences et / ou les laboratoires.

Dans cet article, nous démontrons un protocole amélioré à l’aide d’un dispositif innovant qui combine un dispositif de réchauffement indépendant, à régulation thermique, avec une unité de retenue réglable en un seul système pour une injection efficace et rationalisée de la veine de la queue. L’exemple que nous utilisons est un modèle intraveineux d’infection fongique de la circulation sanguine qui entraîne une septicémie. L’appareil de chauffage se compose d’une boîte en acrylique réfléchissant la chaleur installée avec un thermostat automatique réglable pour maintenir la température interne à un seuil prédéfini. De même, la largeur et la hauteur de l’appareil de retenue du cône peuvent être ajustées pour s’adapter en toute sécurité à différentes tailles de rongeurs. Avec les caractéristiques avancées et polyvalentes de l’appareil, la technique présentée ici pourrait devenir un outil utile dans une gamme de domaines de recherche impliquant des modèles de rongeurs qui utilisent des injections de veines caudales.

Introduction

L’utilisation de modèles animaux impliquant des rongeurs a été un élément de base de la recherche biomédicale. De nombreuses souches consanguines et consanguines, ainsi que des lignées génétiquement modifiées, sont disponibles et couramment utilisées dans les laboratoires du monde entier. L’injection de veine caudale est l’une des méthodes essentielles dans les modèles de rongeurs nécessitant l’administration intraveineuse (i.v.) d’agents expérimentaux. Généralement, les injections i.v. présentent des avantages majeurs par rapport à d’autres voies d’administration telles que des taux d’absorbance élevés en contournant les tissus locaux et le tube digestif et une tolérance élevée aux solutions d’une large gamme de concentrations ou de pH non physiologique1,2,3,4. Parmi les autres voies i.v. viables (par exemple, veines saphènes, sinus veineux rétro-orbitaux), les veines caudales sont considérées comme le vaisseau sanguin le plus sûr et le plus facilement accessible chez les rongeurs2,3,5,6. Par conséquent, l’injection de veines caudales a été largement utilisée dans un éventail de modèles de rongeurs, y comprislesmodèles de maladies infectieuses7,8,9, la transplantation de matériel biologique10,11, l’évaluation des thérapies précliniques12,13, et les analyses toxicologiques14,15.

La cohérence et la précision du dosage sont une exigence essentielle dans la réussite des injections de veines caudales. Étonnamment, l’évaluation quantitative et qualitative des injections de veine caudale dans la littérature implique des erreurs d’injections fréquentes16,17. Une étude a rapporté que douze injections sur trente effectuées par des injecteurs entraînés laissaient plus de 10% des doses injectées dans la queue18. En outre, la sécurité et le confort de l’animal recevant des injections de veine caudale devraient être une préoccupation majeure pendant la procédure. Une mauvaise contention peut entraîner des blessures et une gamme de pathologies liées au stress (p. ex., perte de poids, troubles des réponses immunitaires) qui pourraient introduire des variables substantielles dans la qualité de l’échantillon19,20. Ces erreurs peuvent entraîner une variabilité accrue des données et une mauvaise reproductibilité, affectant ainsi négativement les résultats de l’étude.

L’induction d’une dilatation vasculaire chez l’animal est souvent nécessaire lors d’injections de veine caudale en raison du petit diamètre du vaisseau, estimé à 300 μm chez la souris21. La vasodilatation améliore la visibilité des veines de la queue et aide à obtenir un alignement optimal aiguille-veine dans la lumière veineuse. Diverses méthodes ont été rapportées par des laboratoires telles que l’immersion de la queue dans de l’eau tiède22,l’application de chaleur sur la queue à l’aide d’un drapé chaud, d’une lampe ou d’un sèche-cheveux23, 24, ou le placement de l’animal dans un environnement chaud à l’aide d’un coussin chauffant, d’un incubateur ou d’une boîte combinée à l’une de ces sources de chaleur25. Les appareils peuvent être fabriqués par eux-mêmes à des fins spécifiques ou disponibles auprès de fournisseurs commerciaux. Cependant, beaucoup manquent de capacités thermorégulatrices et, le cas échéant, la température de l’appareil est mal maintenue et souvent sujette à des variations de température ambiante. De même, l’utilisation d’un dispositif de contention est nécessaire pour les injections de veine caudale car l’utilisation de l’anesthésie n’est pas recommandée26,27. Plusieurs types de dispositifs de contention spécifiques au laboratoire ou commerciaux ont été développés. En règle générale, l’animal est placé dans un tube conique jetable de 50 ml4,des parois en plexiglas fendues, un tunnel ou un cône28,qui permettent tous une exposition suffisante de la queue tout en limitant les mouvements de l’animal. Cependant, la plupart des contentions ont des limites de taille en raison de la rigidité des matériaux. En outre, les dispositifs modernes de grande complexité, malgré leur conception pratique et sophistiquée, ne semblent pas réalisables pour les injections impliquant de grands groupes d’animaux22.

Les modèles murins d’infection de la circulation sanguine et de septicémie associée sont un excellent exemple de situations nécessitant l’utilisation de cette technique. Parmi toutes les étiologies microbiennes de la septicémie clinique sévère, la septicémie fongique est souvent une affection mortelle avec des taux de mortalité de >40% malgré le traitement antifongique29. En fait, l’infection par Candida albicans a été signalée comme la quatrième cause d’infection de la circulation sanguine acquise à l’hôpital (candidémie)30,31. Dans la candidose intra-abdominale, les micro-organismes dans le tractus gastro-intestinal peuvent se disséméreuer par la circulation sanguine et provoquer une septicémie polymicrobique avec une mortalité encore plus grande32,33,34. Comme la plupart des cas de candidémie nosocomienne émergent de cathéters de ligne centrale contaminés ou de dispositifs médicaux à demeure35,36, i.v. l’inoculation avec C. albicans par injection de veine caudale peut refléter étroitement le développement de la septicémie humaine et a été une méthode de base dans un modèle murin de candidose disséminée hématogène37,38. Dans ce modèle, la mortalité qui se produit en jours peut être prolongée ou raccourcie en ajustant l’inoculum39,40,41de C. albicans i.v.

Récemment, notre laboratoire a développé un protocole innovant pour une injection de veine caudale rationalisée de manière optimale à l’aide d’un dispositif innovant équipé d’une unité de réchauffement thermorégulée, associée à une unité de retenue réglable, dans un système pratique. Ce protocole permet aux chercheurs d’effectuer des injections de veines caudales de manière précise et rapide, tandis que les animaux peuvent être conditionnés et retenus en toute sécurité pour la procédure avec un minimum de détresse. Les techniques démontrées ici, avec l’utilisation du dispositif avancé de réchauffement et de contention, pourraient servir d’outil utile dans divers domaines de recherche utilisant des modèles de rongeurs.

Protocol

Tous les protocoles animaux impliquant des injections de veines caudales et l’utilisation du dispositif de réchauffement/contention ont été examinés et approuvés par le Comité local de soins aux animaux en établissement (IACUC). 1. Préparation Acclimater les animaux dans l’environnement du logement pendant au moins 1 semaine et laisser la nourriture et l’eau ad libitum.REMARQUE: Pour la plupart des nouveaux utilisateurs de cette technique d’injection, les souches animales à fourrure blanche ou de couleur claire peuvent être préférables car les veines de la queue sont facilement visibles à travers la peau. Les souches de couleur foncée de souris (par exemple, C57BL / 6) ou de rats (par exemple, Brown Norway) ont une queue profondément pigmentée, ce qui entraîne un faible contraste de couleur avec la veine. Il est fortement recommandé que les nouveaux utilisateurs reçoivent une formation adéquate jusqu’à ce que la compétence soit atteinte. Agents pour l’injection de veines caudales Préparez tous les agents et solutions de test de manière aseptique. Lors de l’administration d’organismes ou de matières cellulaires, prendre des précautions à toutes les étapes du traitement pour maintenir des conditions exemptes de pyrogènes. Utilisez uniquement une solution saline normale (0,9 % p/v de chlorure de sodium) ou des solutions salines équilibrées telles qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme véhicules pour l’injection dans la veine caudale.ATTENTION: N’utilisez jamais d’eau, d’huile ou de solutions visqueuses en raison du risque potentiel de dommages vasculaires. Une large gamme de pH (4,5-8,0) est tolérable en raison de l’effet tampon du sang et des débits sanguins rapides chez les rongeurs. Cependant, les solutions très acides ou alcalines peuvent entraîner des dommages tissulaires inutiles au site d’injection et doivent être évitées. Limitez le volume et la fréquence d’injection au minimum. Utilisez les volumes recommandés pour les souris et les rats (≤200 μL et ≤500 μL, respectivement) à la température corporelle avant l’injection pour minimiser le stress de l’animal3. S’assurer que chaque préparation de la seringue et de l’aiguille est exempte de bulles d’air dans la solution; si des bulles sont présentes, purgez-les complètement pour éviter le risque d’embolie.REMARQUE: En règle générale, des seringues de 1 mL avec des aiguilles de 27 G et 1/2 pouce conviennent à la plupart des injections de veines caudales. Utilisez l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié requis par l’IACUC local avec le minimum de blouses jetables ou dédiées et de gants en latex ou en nitrile. L’utilisation de lunettes de sécurité est fortement recommandée lors de l’injection de la veine caudale. Le dispositif de réchauffement et de contention Inspectez soigneusement tous les composants avant utilisation pour vous assurer que l’appareil est exempt de tout défaut (Figure 1). Initialisation du dispositif de réchauffement (Figure 2A) Placez l’unité de chauffage sur une paillasse plate propre et allumez l’appareil. Assurez-vous que le voyant d’alimentation du thermostat est allumé en vert. Placez les matériaux de literie à l’intérieur de la chambre de réchauffement pour garder la zone sèche et retenir la chaleur. Configuration du dispositif de retenue (Figure 2B) Placez l’unité de retenue à côté de l’unité de réchauffement et déterminez les tailles de cônes appropriées pour l’animal. Si nécessaire, ajustez manuellement les largeurs de base du cône en aluminium souple pour fournir une retenue adéquate à l’animal. Alternativement, remplacez le cône par des modèles personnalisés pour accueillir des souris ou des rats de différentes tailles de corps. 2. Injection de veine caudale Réglages de l’appareil Réglage de la température interne À l’aide de la molette de commande, réglez le thermostat à la température souhaitée. Assurez-vous que l’indicateur de chauffage est allumé en rouge et que l’ampoule s’allume. Surveillez attentivement l’affichage de la température interne pendant que l’ampoule est allumée (chauffage). Le thermostat inactive automatiquement l’ampoule une fois qu’une température cible a atteint, environ en 10 à 15 minutes.REMARQUE: Régler une température supérieure à la température ambiante active le chauffage. En général, la température recommandée du boîtier dans des conditions de vivarium standard varie, allant de 20 à 26 °C, tandis que la température neutre (c’est-à-dire confortable) pour les souris de laboratoire est considérée comme comprise entre 30 et 32 °C42. Par conséquent, il est recommandé que la température interne de la chambre de réchauffement soit légèrement supérieure à la thermoneutralité, environ à 32–36 °C. Ne réglez jamais le thermostat au-dessus de la température corporelle. Positionnement de la plateforme de retenue À l’aide du bouton de réglage de la hauteur, ajustez la hauteur du cône au niveau optimal pour l’utilisateur. Traitement thermique (Figure 3A) Une fois la température cible atteinte (32–36 °C), transférez doucement les animaux de la cage de logement dans la chambre de réchauffement.REMARQUE: Un traitement thermique de 5 à 10 minutes est suffisant pour induire une vasodilatation et améliorer la visibilité des veines de la queue. Cependant, les animaux peuvent être maintenus en toute sécurité dans la chambre thermorégulée pendant toute la durée de la procédure (généralement 20 à 30 minutes sans signe d’hyperthermie). La chambre de réchauffement peut contenir en toute sécurité 4 à 6 souris ou un rat. Surveiller l’animal pour détecter tout signe de stress thermique aigu (p. ex., respiration rapide, léthargie, comportement d’évasion de saut).ATTENTION : Les animaux présentant des signes d’hyperthermie doivent être renvoyés dans leur cage et surveillés jusqu’à ce qu’ils reprennent une activité normale avant d’être réutilisés. Si cela est dû au fait que la température interne dépasse la plage optimale, assurez-vous que le dispositif de chauffage est éteint. Étapes d’injection Soulevez l’animal par la base de la queue et retirez-le de la chambre de réchauffement. Introduire l’animal sur l’ouverture conique de l’unité de retenue.ATTENTION: Ne soulevez jamais de souris de l’extrémité de la queue; cela peut entraîner des blessures graves. D’autres méthodes de manipulation doivent être utilisées pour les souris obèses ou gravides28. Lorsque l’animal s’agrippe au bord le long du cône avec ses pattes antérieures, tirez doucement la queue vers l’arrière et passez la queue à travers la fente ouverte. Fixez l’extrémité postérieure de l’animal à la base du cône avec une patte postérieure dépassant du cône afin que la veine latérale soit montrée à une position de 12 heures. L’une ou l’autre patte postérieure peut être saillante car il y a deux veines latérales, une de chaque côté(Figure 3B). Saisissez la queue à mi-hauteur des deux tiers avec la main non dominante entre le pouce et l’index, en mettant une légère tension sur la veine latérale pour maintenir le positionnement de la queue et la vasodilatation.REMARQUE: Une meilleure visibilité des veines dilatées par traitement thermique permet à l’utilisateur de déterminer rapidement un site d’injection pour obtenir les meilleurs résultats(Figure 4). Essuyez la peau du site d’injection avec une éponge de gaze ou un tampon humidifié avec 70% d’alcool. Nettoyez aussi doucement et rapidement que possible pour éviter toute irritation de la queue.NOTE: Cette procédure peut être omise à la discrétion de l’IACUC institutionnelle. Tenez la seringue avec la main dominante et positionnez l’aiguille parallèlement à la queue. Insérez l’aiguille dans la direction du flux sanguin, faites un biseau vers le haut à un angle de 10 à 15°(figure 5A à B)et avancez plus loin dans la lumière de la veine en pénétrant de 2 à 4 mm(figure 5C-D). Injecter lentement la solution.REMARQUE: Si l’injection réussit, aucune résistance sur le piston ne doit être ressentie et le liquide peut être vu se déplacer dans la veine. En cas de résistance ou de cloques blanches au-dessus du site d’injection, retirez l’aiguille et tentez une deuxième injection à un site situé au-dessus de la mise en place initiale de l’aiguille. N’essayez pas d’injecter sous le site d’injection initial, car le liquide se libérera par le site initial. Si l’injection d’une veine latérale échoue, repositionnez l’animal du côté opposé et faites plus de tentatives sur la veine controlatérale. Le nombre maximal de tentatives dépendra de l’endroit où l’on commence la tentative d’injection le long de la veine et de l’enflure qui peut survenir avec des tentatives manquées. Consultez les règlements institutionnels de l’IACUC pour les erreurs d’injection et les blessures associées. Retirez l’aiguille et appuyez fermement avec le pouce pour éviter le reflux de la solution injectée et / ou du sang. Continuer d’appliquer une compression douce avec une gaze/essuyage ou un tissu propre jusqu’à ce que le saignement ait cessé (Figure 6). Ressevez l’animal dans sa cage et surveillez pendant au moins 5 minutes. Assurez-vous que l’animal reprend une activité normale sans autres saignements. 3. Un modèle murin d’infection fongique de la circulation sanguine et de septicémie Souches de souris Acclimater les souris femelles suisses Webster élevées à l’âge de 6 semaines selon les directives recommandées par l’institution. Alternativement, utilisez des souches consanguines/génétiquement modifiées (p. ex., C57BL/6 de fond) pour ce protocole avec des inocula modifiés (voir NOTE).NOTE (voir discussion pour plus de détails) : Les veines caudales des souris à fourrure foncée sont souvent moins visibles que celles à fourrure plus claire en raison de la queue profondément pigmentée(figure 4). Il existe une susceptibilité variable à la septicémie fongique / létalité entre les différentes souches de souris. L’utilisation de souches de souris autres que Swiss Webster peut nécessiter une optimisation supplémentaire du protocole en tenant compte des facteurs pertinents (par exemple, le bagage génétique, l’âge, le sexe, la taille du corps) qui pourraient influencer le statut immunitaire de l’hôte. Par exemple, un défi mortel chez les souris C57BL/6 nécessite généralement un inocule plus élevé (jusqu’à 10x) pour atteindre le niveau de mortalité observé chez les souris Webster suisses. Micro-organismes Pour un défi mortel (septicémie), striez des stocks congelés de la souche DAY185 de Candida albicans (ou des souches de choix) sur la gélose au dextrose Sabouraud et incubez à 30 °C pendant 2 jours. Transférer une seule colonie dans un bouillon d’extrait de levure-peptone-dextrose de 10 mL et la mettre en culture dans la phase stationnaire de croissance pendant 18 h à 30 °C en agitant. Solutions Inoculum Le jour d’un défi mortel, collectez la culture du bouillon et lavez le granulé 3 fois par centrifugation (800 × g)dans du PBS stérile. Identifier les cellules de levure viables en excluant le colorant bleu trypan et dénombrer à l’aide d’un hémocytomètre. Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 106 cellules/mL dans le PBS stérile à température ambiante.REMARQUE: Chaque animal recevra 100 μL de la solution d’inoculum. Préparer un excès de volume de l’inoculum (>500 μL) pour permettre une perte potentielle pendant la procédure d’injection. L’inoculum final est de 1 x 105 cellules par souris. Le volume de l’inoculum peut être augmenté jusqu’à 200 μL en ajustant la concentration cellulaire en conséquence.ATTENTION : La solution d’inoculum fongique doit être conservée à température ambiante avant l’injection. Le réchauffement de la solution d’inoculum à la température corporelle peut induire un changement morphologique des cellules de levure aux hyphes. Au contraire, l’administration de bolus i.v de solutions froides peut rapidement abaisser la température corporelle de l’animal et doit être évitée. Inoculation intraveineuse Réchauffez les animaux et induisez une vasodilatation en suivant les procédures décrites à la rubrique 2. Injecter 100 μL de la solution d’inoculum dans la veine caudale à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 27 G, 1/2 po. Surveillance post-inoculation Surveiller les animaux pour détecter les signes suivants de morbidité induite par la septicémie : i) aspect fourrure (p. ex., lisse, ébouriffé), ii) activité (p. ex., se déplacer librement, ne pas répondre), iii) posture (p. ex., v. voûté, raide), iv) comportement (p. ex., lent, pas de déplacement), v) mouvements thoraciques (p. ex., respiration normale, dyspnée), vi) paupières (p. ex., ouvertes, fermées)43. Score de la septicémie Noter la morbidité observée selon un score d’évaluation clinique de souris modifié pour la septicémie (M-CASS) dans une échelle de notation en quatre points de 0 à 3 dans chaque catégorie: 0, normal; 1, doux; 2, modéré; 3, sévère43. Protocole facultatif : Vaccination contre la septicémie fongique Quatorze jours avant un défi mortel, inoculer des souris avec la souche Wü284 de Candida dubliniensis ou des souches atténuées de C. albicans, telles que le mutant Δefg1/ Δcph1 (1×105 cellules par souris), comme décrit aux rubriques 3.2 à 3.4 au lieu de C. albicans DAY185. Effectuer une épreuve létale chez les souris vaccinées, comme décrit aux rubriques 3.2 à 3.4, et surveiller les signes de morbidité induite par la septicémie décrits aux rubriques 3.5 à 3.6.

Representative Results

La température à l’intérieur de la chambre de réchauffement est détectée en permanence par le capteur interne et autorégulée par le thermostat. Tout d’abord, la molette de commande du thermostat était positionnée à 78, 85, 90 ou 95 °F (26, 29, 32 ou 95 °C) pour sélectionner les températures réglées. Une fois le chauffage activé(Figure 7,points jaunes), l’émission de chaleur par l’ampoule a rapidement augmenté la température interne pendant les 5 à 15 premières minutes, en fonction de la température réglée. L’appareil de chauffage a désactivé l’ampoule si la température interne détectée dépassait la température réglée (points gris). Les températures maximales initiales doivent atteindre 5 à 7 °C au-dessus des températures définies dans tous les groupes pour compenser la perte de température pendant le transfert d’animaux. Par la suite, l’appareil continue à répéter automatiquement le cycle de chaleur et maintient la chambre de réchauffement à la température réglée. Un exemple de données expérimentales obtenues par des injections réussies de veines caudales à l’aide du protocole actuel est illustré à la figure 8. Dans un modèle murin de candidose de la circulation sanguine entraînant une septicémie, un défi i.v. avec Candida albicans (1 x 105 cellules par souris) chez des souris Webster suisses a provoqué un début rapide de septicémie et de dissémination des organismes, entraînant une mortalité élevée dans les 3 à 4 jours (points ouverts) (Figure 8A). En revanche, les animaux pourraient être protégés contre la septicémie par une vaccination antérieure par i.v. avec une souche de levure avirulente, Candida dubliniensis, atteignant une survie de >95% après le défi i.v. mortel avec C. albicans virulent (points solides). Ces résultats en matière de mortalité progressive par rapport à la protection médiée par le vaccin ont été obtenus de manière reproductible dans quatre expériences indépendantes(figure supplémentaire 1). Une protection similaire pourrait être obtenue en utilisant d’autres souches de levure avirulentes telles que les mutants atténués de C. albicans (Δefg1/ Δcph1) (données non présentées). La septicémie pourrait également être surveillée et corrélée à la mortalité; les animaux non vaccinés atteints d’une infection létale présentaient une augmentation significative de la morbidité induite par la septicémie, tandis que le groupe vacciné présentait des symptômes minimes après la lutte létale (Figure 8B). Figure 1 : Description du dispositif de réchauffement et de contention des rongeurs. (A) montre la vue extérieure du dispositif de réchauffement, qui consiste en: Couvercle du thermostat – soulevez vers le haut par la poignée pour exposer le thermostat Boîtier électrique – scellé en permanence pour la protection Couvercle de la chambre – soulever vers le haut pendant le transfert de l’animal vers / depuis Chambre chauffante – amovible, recouvrir le sol de literie avant utilisation Appareil de retenue – escamotable avec le dispositif chauffant lorsqu’il n’est pas utilisé Interrupteur d’alimentation – interrupteur à bascule en ligne pour les fonctions principales marche/arrêt Cordon d’alimentation – tension / courant: 120V / 10A B) montre l’intérieur du dispositif de réchauffement: Ampoule à incandescence – puissance lumineuse à 100 Watts Bouclier de protection d’ampoule – amovible pour le remplacement de l’ampoule Sonde de capteur de température – située à l’intérieur de la chambre Thermomètre de température interne – placer à l’intérieur de la chambre pour surveiller la température (C) montre les composants du thermostat du dispositif de réchauffement: Thermomètre de température interne Thermostat – régule automatiquement le chauffage Levier de commande de consigne – minimum/maximum : 78 °F/108 °F (25 °C/42 °C) Indicateur de puissance du thermostat – le voyant vert indique un fonctionnement normal Indicateur de chauffage du thermostat – allumé en rouge pendant le cycle de chauffage D) montre les composants du dispositif de retenue: Cône – feuille d’aluminium souple conçue pour la retenue des rongeurs Canal de queue – façonné pour permettre un positionnement en douceur de la queue Plate-forme élévatrice à cône – fournit un levage robuste de la base du cône Bouton de réglage de la hauteur – conçu pour le réglage manuel de la hauteur Cric à ciseaux – plage de hauteur de 45 à 140 mm (1,77 à 5,52 po) Plaque de support – installée avec des pieds en caoutchouc pour assurer la stabilité Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2 : Dispositif de réchauffement et de contention des rongeurs. (A) Avant utilisation, les deux parties de l’appareil sont placées côte à côte sur une paillasse propre. (B) Une fois le dispositif de chauffage allumé, le thermostat active le chauffage. L’ampoule reste allumée et émet de la chaleur jusqu’à ce que la chambre de réchauffement ait atteint la température réglée. Le dispositif de réchauffement répète automatiquement le cycle de chaleur pour maintenir la température interne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Souris (C57BL/6) placées dans le dispositif de réchauffement et de contention. (A) Souris recevant un traitement thermique pour vasodilatation. Les animaux (4 à 6 souris par traitement) sont transférés de leur cage de logement dans la chambre de réchauffement de l’appareil et traités thermiquement pendant au moins 5 à 10 minutes. (B) Une souris retenue pour l’injection de veine de la queue. La souris est transférée de la chambre de réchauffement dans l’ouverture conique du dispositif de retenue avec sa queue passant à travers la fente ouverte. La souris est doucement tirée vers l’arrière jusqu’au bord éloigné du cône jusqu’à ce que la base de la queue atteigne l’extrémité du cône. Lorsque l’animal est attiré vers la base du cône avec une légère rotation latérale, une patte postérieure est positionnée vers le haut de sorte qu’elle dépasse de la fente ouverte permettant à la veine latérale de la queue d’être positionnée à 12 heures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Identification des veines latérales de la queue chez la souris. (A) La queue d’une souris Webster suisse non traitée. La souris est placée dans le dispositif de retenue sans traitement thermique préalable pour la vasodilatation. La veine latérale de la queue peut être identifiée comme un mince vaisseau sombre qui passe sous la peau. (B) La queue d’une souris Webster suisse traitée avec le dispositif de réchauffement pendant 10 min. La souris traitée thermiquement est retenue pour l’injection de la veine caudale. La veine latérale de la queue est facilement visible à travers la peau en raison de l’élargissement du diamètre des vaisseaux induit par la vasodilatation. (C) La queue d’une souris C57BL/6 traitée avec le dispositif chauffant pendant 10 min et retenue pour l’injection de la veine caudale. La vasodilatation améliore la visibilité de la veine caudale à travers la peau profondément pigmentée, bien que la veine ne soit pas aussi facilement visible que chez les souris Webster suisses de couleur claire en raison d’un faible contraste de couleur avec la veine. Les flèches rouges indiquent l’emplacement de la veine latérale de la queue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Injection de veine caudale réalisée chez des souris traitées thermiquement (Swiss Webster). (A–B) Insertion d’aiguilles dans la veine latérale de la queue au site d’injection. L’aiguille (27 G, 1/2 po) est positionnée parallèlement à la veine caudale avec le biseau vers le haut et pointée vers le flux sanguin et insérée. (C–D) Placement de l’aiguille dans la veine caudale et injection. La pointe de l’aiguille est encore avancée de 2 à 4 mm dans la lumière de la veine. Le pouce est positionné sur le piston de la seringue et le volume souhaité est dispensé d’une pression lente et constante. Des cercles ovales indiquent les sites d’injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Procédure post-injection. (A) Une zone de saignement au site d’injection. Le saignement et le reflux de la solution injectée se produisent immédiatement après le retrait de l’aiguille. Cela peut être minimisé en appliquant une compression ferme sur le site d’injection avec le pouce. (B) Formation de caillots sanguins au site d’injection. Une compression douce avec une gaze / lingette propre facilite la coagulation du sang sur la plaie d’injection. Les flèches désignent les sites d’injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Température interne de la chambre de réchauffement pendant l’utilisation. Le dispositif de réchauffement a été activé pour le réchauffement aux températures définies désignées. La chambre de réchauffement de l’appareil a été surveillée pour la température de l’air interne et les cycles de chaleur (ampoule allumée / points jaunes, points éteints / gris) ont été enregistrés pendant 45 minutes. La zone orange indique la plage de température optimale pour l’induction de la vasodilatation chez les rongeurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 8 : Mortalité par septicémie par rapport à la protection médiée par le vaccin à la suite d’une contestation létale avec Candida albicans. Des souris (femelles Webster suisses âgées de 8 semaines) ont été vaccinées par voie intraveineuse avec Candida dubliniensis Wü284(Cd)vivant avirulent, suivi d’un défi intraveineux mortel avec C. albicans de type sauvage JOUR 185 (1 x 105 cellules par souris) 14 jours plus tard. (A) La mortalité a été évaluée dans les 10 jours suivant la contestation létale. (B) Les animaux ont été surveillés pour la morbidité de la septicémie et notés selon un score d’évaluation clinique modifié de la souris pour la septicémie (M-CASS)43. Les données sont cumulatives de 4 expériences indépendantes avec 10 souris par groupe et analysées à l’aide du test de classement log-rank de Mantel-Cox. p < 0,0001. SEM, erreur type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure supplémentaire 1 : Reproductibilité de la mortalité par septicémie et survie médiée par le vaccin à partir d’un défi de Candida albicans dans le sang. Chaque panneau représente les données de quatre expériences indépendantes incluses dans un résultat cumulatif illustré à la figure 8A. Chaque expérience a été menée sur 10 souris par groupe et analysée à l’aide du test de classement log-rank de Mantel-Cox. Ca, Candida albicans. Cd, Candida dubliniensis. p < 0,0001. p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Discussion

Un dosage cohérent et précis sont des exigences clés pour la fiabilité expérimentale dans les modèles animaux. Ceci est particulièrement important dans les cas d’administration par voie d’administration i.v. où la biodisponibilité systémique des agents injectés est considérablement plus élevée/plus rapide qu’avec d’autres voies d’administration3. Ainsi, des erreurs dans l’injection de la veine caudale pourraient avoir un impact négatif sur les résultats de l’étude. Historiquement, l’injection intrapéritonéale (i.p.), plutôt que l’i.v., a été la méthode la plus courante pour l’accès systémique chez les rongeurs en raison de la simplicité technique et de la commodité. Cependant, les voies d’administration deviennent plus cruciales lors de la traduction des lectures précliniques des animaux en milieux cliniques. Par conséquent, il est nécessaire d’améliorer continuellement les protocoles des rongeurs qui pourraient faciliter une injection réussie de la veine caudale.

La principale avancée du protocole actuel est le dispositif de réchauffement thermorégulé innovant qui permet l’induction efficace de la vasodilatation chez les rongeurs, ce qui améliore considérablement la visibilité des veines caudales et l’alignement des aiguilles. Les méthodes de chauffage mal thermorégulées (p. ex., lampes), vasodilatateurs topiques ou irritants pour la peau (p. ex. xylènes) sont non seulement peu fiables, mais aussi dangereuses pour l’animal et doivent être évitées44. Contrairement à d’autres méthodes conventionnelles, telles que l’immersion de la queue dans de l’eau chaude, la capacité d’autorégulation de cet appareil peut conditionner en toute sécurité plusieurs animaux simultanément. De plus, ce protocole est encore renforcé par l’utilisation du dispositif de retenue conçu de manière optimale et permettant une immobilisation rapide et sûre de l’animal dans une position qui affiche le mieux la veine latérale de la queue.

Les formats tubaires transparents observés dans de nombreux systèmes de retenue actuels, bien que pratiquement bien conçus, nécessitent plus de temps de manipulation avec chaque animal, prolongeant ainsi le processus de contention45. Cela peut être plus problématique chez les souches de rongeurs avec des traits agressifs qui offrent une coopération limitée46,47. En revanche, la structure conique semi-fermée du dispositif de retenue permet un positionnement rapide de l’animal et aide à minimiser la durée de la contention. Ensemble, le protocole rationalisé utilisant le système innovant et hautement optimisé de réchauffement/ retenue accélère la procédure d’injection, permettant un dosage rapide et efficace de grands groupes d’animaux. Dans notre laboratoire, nous effectuons généralement une procédure d’injection complète de 30 souris, du traitement thermique à la surveillance post-injection en 1 h en utilisant ce protocole.

Malgré les fonctionnalités avancées, cet appareil présente des inconvénients apparents: le premier est le coût de l’appareil et le remplacement de routine de l’ampoule dans la chambre de réchauffement. Cependant, en plus de l’efficacité et de la rapidité des injections, l’appareil est durable pour une utilisation répétée et compatible avec la plupart des désinfectants courants, ce qui permet un nettoyage en profondeur de l’appareil entre les utilisations. Ensemble, cela compense l’investissementinitial. Dansles situations où l’espace de travail est limité, un inconvénient de ce protocole peut être l’exigence d’un banc dédié suffisamment grand pour placer les deux unités, côte à côte, lors de l’injection. Cependant, étant donné que le dispositif peut être largement utilisé dans plusieurs protocoles de rongeurs impliquant des injections i.v., il est possible que le dispositif puisse servir d’instrument de base similaire à d’autres équipements de vivarium communs tels que les vaporisateurs d’isoflurane. Quoi qu’il en soit, les deux unités sont facilement portables et peuvent être regroupées et rangées lorsqu’elles ne sont pas utilisées.

Le modèle de défi létal i.v. de la septicémie fongique murine décrit dans ce protocole imite étroitement les infections de la circulation sanguine à C. albicans chez l’homme et a été largement utilisé pour étudier la virulence fongique, tester l’efficacité des thérapies antifongiques et caractériser les réponses immunitaires de l’hôte àl’infection37,39,48. Pour obtenir une infection reproductible, l’inoculation par injection de la veine caudale est l’étape la plus vitale du protocole pour assurer une livraison précise des organismes dans la circulation sanguine. En fait, les animaux réagissent très différemment aux différents niveaux de défis de Candida i.v. ; l’administration de trop faibles quantités d’inoculum entraînera des récupérations spontanées non désirées, tandis que les animaux recevant des doses trop élevées succomberont prématurément. La fenêtre spécifique de la taille des inoculums pour qu’un organisme donné induise un niveau constant de septicémie / mortalité dépend en grande partie des souches fongiques et des souches de souris.

Le protocole actuel utilisant des souris Webster suisses à l’inoculum de 1 x 105 C. albicans de type sauvage a induit de manière reproductible l’apparition de la morbidité de la septicémie dans un délai de 1 jour, suivie d’une mortalité progressive entraînant une létalité de 100% de 5 à 7 jours. En revanche, les inocula supérieurs à 1 x 105 entraînent généralement des décès accélérés (c’est-à-dire 1 à 2 jours à 1 x 106,3 à 4 jours à 5 x 105), et ceux inférieurs à 1 x 105 sont sublétaux. Conformément à de nombreux rapports dans la littérature, l’utilisation d’espèces nonalbicans Candida à la place de C. albicans entraîne une diminution significative de la létalité40,49. De plus, le choix des souches de souris, ou même l’origine des colonies, peut avoir un impact considérable sur les résultats de l’infection en raison de susceptibilités variables entre les souches de souris, comme rapporté par d’autres39,40,41,50,51,52,53,54,55. Par conséquent, les deux doivent être pris en considération lors de la conception des expériences.

À la suite d’un défi i.v. mortel, les cellules fongiques se propagent rapidement dans la circulation sanguine et commencent à envahir plusieurs organes, parmi lesquels les plus touchés sont les reins41. Les autres organes touchés sont le cerveau, la rate et la moelle osseuse48,56. Quoi qu’il en soit, la septicémie aiguë est la cause ultime de décès aux premiers points de temps37. Comme le montrent les résultats représentatifs, la gravité de la septicémie peut être évaluée quantitativement par le score d’évaluation clinique de la souris pour la septicémie (M-CASS) en fonction des signes présentés d’une affection septicémie chez les animaux mis en défi43,57. Parmi les nombreux marqueurs de substitution de la septicémie létale, l’hypothermie a été suggérée comme un prédicteur critique de la mort imminente dans la septicémie clinique et expérimentale43,58,59.

Bien qu’aucune étude formelle n’ait été menée pour comparer directement les souris consanguines par rapport aux souris consanguines dans ce modèle, les données obtenues à partir du protocole actuel utilisant des souris Webster suisses consanguines sont exceptionnellement reproductibles dans divers paramètres de septicémie, malgré l’hétérogénéité génétique présumée. En général, un modèle de mortalité qui tombe dans les 3 à 5 jours est un modèle ferme de septicémie aiguë, comme en témoigne l’élévation rapide de la morbidité de la septicémie et des niveaux de marqueurs inflammatoires dans les heures suivant le défi post-létal50,51. Pour des temps de survie plus longs (7 à 10 jours), la mortalité est probablement le résultat d’une charge microbienne entraînant des lésions tissulaires mortelles dans les organes cibles et le système nerveux central. Le choix de la septicémie ou de la charge microbienne peut être appliqué au besoin pour évaluer les fonctions immunitaires ou les réponses aux régimes anti-inflammatoires ou aux thérapies/vaccins antifongiques, tels que déterminés par l’inoculum utilisé.

En plus du modèle de défi létal i.v., l’infection intra-abdominale par C. albicans chez la souris via un défi i.p. peut également entraîner une candidose disséminée et une septicémie subséquente, bien que la co-inoculation avec l’agent pathogène bactérien, Staphylococcus aureus, augmente synergiquement la mortalité par rapport à la mono-infection à C. albicans 51,60,61. Dans le modèle de défi létal i.p., des inocules microbiens considérablement plus élevés (1,75 x10 7C. albicans/ 8 x10 7S. aureus par souris) sont nécessaires pour provoquer une péritonite polymicrobienne et la dissémination des organismes de la cavité abdominale dans la circulation sanguine. De même, l’infection gastro-intestinale par C. albicans chez les souris traitées avec des agents immunosuppresseurs et / ou endommageant les muqueuses entraîne la translocation des cellules fongiques dans la circulation sanguine et entraîne une septicémie fongique62,63. Malgré les voies d’inoculation distinctives, le mécanisme de la septicémie fongique qui s’ensuit est largement analogue entre les trois modèles de la maladie, impliquant une réponse pro-inflammatoire systémique incontrôlée à Candida qui conduit à une défaillance d’organe37,51,61. De même, chez l’homme, c’est ce processus de réponse de l’hôte, et pas seulement la candidémie, qui provoque la morbidité / mortalité élevée associée à la candidose hématogène disséminée acquise dans les milieux de soins de santé64,65.

En utilisant le modèle actuel de septicémie fongique, nous démontrons ici que la protection contre l’infection mortelle à C. albicans peut être obtenue par i.v. pré-immunisation / vaccination avec C. dubliniensis (avirulent) ou atténué c. albicans mutants, concomitant à une réduction significative de la morbidité de la septicémie. La protection est médiée par des cellules suppressrices innées dérivées de Gr-1+ myéloïdes qui semblent être induites dans la moelle osseuse comme une forme d’immunité innée entraînée66,67. Des efforts sont en cours pour élargir la compréhension de cette nouvelle forme de protection innée à médiation immunitaire contre les infections de la circulation sanguine à C. albicans.

En conclusion, le dispositif innovant de réchauffement/retenue des rongeurs a joué un rôle déterminant dans l’amélioration de notre capacité à effectuer des injections par injection i.v. d’études animales multi-groupes à grande échelle de manière efficace et efficiente. En tant que tel, nous avons inventé le terme, Mouse a Minute, pour l’appareil. Les spécifications de l’appareil sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande d’achat d’un appareil similaire. Les techniques démontrées ici pourraient servir d’outil utile dans les modèles de rongeurs utilisant des injections de veines caudales dans un large éventail de domaines de recherche.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la LSUHSC Foundation (PLF), et en partie par U54 GM104940 du National Institute of General Medical Sciences des National Institutes of Health, qui finance le Louisiana Clinical and Translational Science Center.

Materials

Candida albicans strain DAY185 Carnegie Melon University N/A provided by the laboratory of Aaron Mitchell
Candida albicans strain efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ University of Tennessee Health Sciences Center N/A provided by the laboratory of Glen Palmer
Candida dubliniensis strain Wü284 Trinity College, Dublin, Ireland N/A provided by the laboratory of Gary Moran
Mice Charles River Laboratories 551NCICr:SW Female Swiss Webster; 6-8 weeks old
Mice Charles River Laboratories 556NCIC57BL/6 Female C57BL/6; 6-8 weeks old
Needles, 27G, ½-in Becton Dickinson 305109 can be substituted from other vendors
Phosphate buffered saline (PBS) GE SH30028.02 can be substituted from other vendors
Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute) LSU Health custom order Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health
Sabouraud dextrose agar (SDA) Becton Dickinson 211584 can be substituted from other vendors
Syringes, 1 mL Becton Dickinson 309659 can be substituted from other vendors
Trypan blue solution Sigma T8154
Yeast peptone dextrose (YPD) broth Fisher Scientific BP2469 can be substituted from other vendors
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Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model. J. Vis. Exp. (165), e61961, doi:10.3791/61961 (2020).
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