HPLC-MS/MS ile Nükleozid/Nükleotid İçerik Ölçümü için Bitki Numunesi Hazırlama
Summary
Bitkilerde in vivo nükleozidler/nükleotidler nicelemesi için kesin ve tekrarlanabilir bir yöntem burada açıklanmıştır. Bu yöntem bir HPLC-MS/MS kullanmaktadır.
Abstract
Nükleozidler/nükleotitler, nükleik asitlerin yapı taşları, kosubstratların ve koenzimlerin parçaları, hücre sinyal molekülleri ve birçok hücre faaliyetinde yer alan enerji taşıyıcılarıdır. Burada, bitkilerdeki nükleozid/ nükleotid içeriğinin mutlak kalifikasyon için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklıyoruz. Kısaca, 100 mg homojenize bitki materyali 1 mL ekstraksiyon tamponu (metanol, asetonitril ve su 2:2:1 oranında) ile çıkarıldı. Daha sonra, örnek bir dondurarak kurutucuda beş kez yoğunlaştı ve daha sonra bir HPLC-MS/MS’e enjekte edildi. Her nükleozid ve nükleotitin kütle geçişleri kütle spektrometresi ile izlendi. Nükleozidlerin ve nükleotitlerin içeriği dış standartlarına (ESTD’ ler) göre ölçüldür. Bu nedenle, araştırmacılar bu yöntemi kullanarak farklı bitkilerdeki nükleozidleri / nükleotitleri kolayca ölçebilirler.
Introduction
Nükleozidler/Nükleotitler, nükleik asitlerin ve nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) gibi birçok koenzim için öncü olan ve fosfolipidler, glikolipidler ve polisakkaritler gibi makromoleküllerin sentezinde önemli olan tüm canlı organizmalarda merkezi metabolik bileşenlerdir. Yapısal olarak, nükleozid, adenin, guanin, urasil, sitozin veya timin olabilen bir nükleobase ve riboz veya deoksiriboz1,2olabilen bir şeker moiety içerir. Nükleotitler, nükleozidlerin şeker moietysinin 5 karbon pozisyonuna bağlı en fazla üç fosfat grubuna sahiptir3. Bitkilerdeki nükleotitlerin metabolizması tohum çimlenmesi ve yaprak büyümesi için gereklidir4,5,6. Bitki gelişimindeki fizyolojik rollerini daha iyi anlamak için, vivo olarak farklı nükleozidlerin / nükleotitlerin mutlak nicelemesi için yöntemler oluşturulmalıdır.
Nükleozidleri/nükleotidleri ölçmek için en sık kullanılan yaklaşımlardan biri, ultraviyole görünür (UV-VIS) dedektör 4 ,7,8,9,10,11ile birlikte yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) kullanmaktadır. 2013 yılında, HPLC, Dahncke ve Witte kullanarak Arabidopsis thaliana7’dekinükleozidlerin çeşitli türlerini ölçtü. Vahşi tip bitkiye kıyasla guanosin deaminaz geninde hedef alan bir T-DNA ekleme mutantında gelişmiş bir guanosin içeriği tespit ettiler. Başka bir pirimidin nükleozid, sitidin, bu yöntemi kullanan bitkilerde nicel olarak tespit edildi, bu da iyi niyetli bir sitidin deaminaz geninin tanımlanmasıyla sonuçlandı4. Bununla birlikte, UV dedektörüne dayanarak, bu yöntem, guanosin veya ksantozin gibi benzer spektrumlara ve tutma sürelerine sahip nükleozidleri kolayca ayırt edemez. HPLC yönteminin algılama sınırı nispeten yüksektir, bu nedenle, sitidin, uridin ve guanosin gibi yüksek miktarda nükleozid in vivo ölçümü için sıklıkla kullanılır.
Ayrıca çekirdek ölçümünde kütle spektrometresi (GC-MS) ile birleştirilmiş gaz kromatografisi de kullanılabilir. Bundan faydalanmak, Hauck ve diğerleri. al. A. thaliana12tohumlarında nükleozid katabolik yolun aşağı akış metabolit olan uridin ve ürik asit başarıyla tespit edildi. Bununla birlikte, GC normalde uçucu bileşikleri ayırmak için kullanılır, ancak termal olarak labile maddeler için uygun değildir. Bu nedenle, kütle spektrometresi (LC-MS/ MS) ile birleştirilmiş bir sıvı kromatografisi muhtemelen nükleozidlerin / nükleotitlerin13,14’ünin vivo tanımlanması, ayrılması ve nicelleştirilmesi için daha uygun ve doğru bir analitik tekniktir. Daha önceki birkaç çalışmada, nükleozidler ve nükleotidler ayrımı için bir HILIC sütununun kullanılabileceği bildirilmiştir15,16 ve izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar bileşik niceleme içinkullanılmıştır 17. Bununla birlikte, her iki bileşen de nispeten pahalıdır, özellikle ticari izotop etiketli standartlar. Burada nükleozidler/nükleotidler ölçümü için ekonomik olarak uygulanabilir bir LC-MS/MS yaklaşımı rapor ediyoruz. Bu yöntem, atp, N 6 -metil-AMP, AMP, GMP, üridin, sittin ve psödouridine 1 ,5,6,18, bitkilerde ve Drosophiladahil olmak üzere çeşitli nükleozidlerin / nükleotidlerin niceliği için zaten başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, burada rapor ettiğimiz yöntem diğer organizmalarda da kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organizmalar, kanonik ve sapkın olanlar da dahil olmak üzere çeşitli nükleozidler / nükleotitler içerir. Bununla birlikte, bunların kökeni ve metabolik uç noktaları, özellikle modifiye nükleozidler, hala belirsizdir. Ayrıca, nükleozidler/ nükleotid metabolizmasının fonksiyonu ve homeostazının mevcut anlayışı araştırılmak ve genişletilmeye devam etmektedir. Bunları araştırmak için, bu metabolitlerin tanımlanması ve nicelleştirilmesi için kesin ve altın standartlı bir yöntemin kullanı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (KJQN202060), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31900907), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (BK20190528), Uluslararası Genetik Mühendisliği ve Biyoteknoloji Merkezi (CRP/CHN20-04_EC) tarafından M.C., ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (LGZD202004) X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
