HPLC-MS/MSによるヌクレオシド/ヌクレオチド含有量測定のための植物サンプル調製
Summary
インビボヌクレオシド/ヌクレオチドの植物定量の正確かつ再現可能な方法をここに記載する。この方法では、HPLC-MS/MS を採用しています。
Abstract
ヌクレオシド/ヌクレオチドは、核酸、共基質および補酵素の一部、細胞シグナル伝達分子、およびエネルギーキャリアの構成要素であり、多くの細胞活動に関与している。ここでは、植物におけるヌクレオシド/ヌクレオチド含量の絶対修飾のための迅速かつ信頼性の高い方法について述べます。簡単に言えば、100mgの均質化植物材料を1mLの抽出緩衝液(メタノール、アセトニトリル、及び水の比率2:2:1)で抽出した。その後、試料を凍結乾燥機に5回濃縮し、HPLC-MS/MSに注入し、多孔質黒鉛炭素(PGC)カラム上でヌクレオチドを分離し、ヌクレオシドをC18カラム上で分離した。各ヌクレオシドおよびヌクレオチドの質量遷移を質量分析法によりモニタリングした。ヌクレオシドおよびヌクレオチドの内容物を、その外部標準(ESTD)に対して定量した。したがって、この方法を使用すると、研究者は異なる植物のヌクレオシド/ヌクレオチドを簡単に定量することができます。
Introduction
ヌクレオシド/ヌクレオチドは、すべての生物の中心的な代謝成分であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)などの核酸および多くの補酵素の前駆体であり、リン脂質、糖脂質、多糖類などの高分子の合成において重要です。構造的には、ヌクレオシドは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、またはチミンであり得るヌクレオベースと、リボースまたはデオキシリボース1、2であり得る糖部分を含む。ヌクレオチドは、ヌクレオシド3の糖部分の5炭素位に結合する最大3つのリン酸基を有する。植物のヌクレオチドの代謝は、種子の発芽と葉の成長4、5、6に不可欠です。植物の開発における生理学的役割をよりよく理解するために、生体内の異なるヌクレオシド/ヌクレオチドの絶対定量化方法を確立する必要があります。
ヌクレオシド/ヌクレオチドを測定するための最も一般的に使用されるアプローチの1つは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて、紫外線可視(UV-VIS)検出器4、7、8、9、10、11を用いる。2013年、HPLCを用いて、ダーンケとウィッテは、シロイヌナズナのヌクレオシドの数種類を定量化した7.彼らは、野生型植物と比較して、グアノシン・デアミネーゼ遺伝子におけるT-DNA挿入変異体標的化におけるグアノシン含有量の増強を同定した。別のピリミジンヌクレオシド、シチジン、また、この方法を採用した植物において定量的に検出され、その結果、ボナフィデスシチジンデアミネーザーゼ遺伝子4の同定を行った。しかし、UV検出器に基づいて、この方法は、類似スペクトルおよび保持時間を有するヌクレオシドを容易に区別することができない、例えば、グアノシンまたはキサントシン。HPLC法の検出限界は比較的高く、従って、シチジン、ウリジン、グアノシンなどの生体内のヌクレオシドの高含量の測定に頻繁に使用される。
また、質量分析(GC-MS)に結合したガスクロマトグラフィーもヌクレオシド測定に使用できる。それから恩恵を受け、ハウクら。Al. A. thaliana12の種子中で、ヌクレオシドの同化経路の下流代謝産物であるウリジンおよび尿酸を正常に検出した。しかし、GCは通常、揮発性化合物を分離するために使用されるが、熱不安定な物質には適していない。したがって、質量分析(LC-MS/MS)に結合した液体クロマトグラフィーは、ヌクレオシド/ヌクレオチド13,14のインビボ同定、分離、定量化に対して、より適した正確な分析技術である可能性が高い。いくつかの以前の研究では、HILICカラムがヌクレオシドおよびヌクレオチド分離に使用され得る、15、16および同位体標識内部標準が化合物定量17のために採用されたことを報告した。しかし、両方のコンポーネントは比較的高価であり、特に商業的同位体標識規格である。ここでは、ヌクレオシド/ヌクレオチド測定に経済的に適用可能なLC-MS/MSアプローチについて報告する。この方法は、ATP、N6-メチル AMP、AMP、GMP、ウリジン、シチジン、および植物およびショウジョウバエにおけるシュードリジン1、5、6、18を含む多様なヌクレオシド/ヌクレオチドの定量に既に成功して使用されています。また、ここで報告する方法は、他の生物でも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
生物には、カノニカルおよび異常なものを含む様々なヌクレオシド/ヌクレオチドが含まれています。しかし、それらの起源および代謝エンドポイント、特に修飾されたヌクレオシドは、依然として不明瞭である。さらに、ヌクレオシド/ヌクレオチド代謝の機能とホメオスタシスの現在の理解は、探求され、拡大する必要があります。それらを調査するには、これらの代謝産物の同定と定量?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中央大学基礎研究基金(KJQN202060)、中国国立自然科学財団(31900907)、江蘇省自然科学財団(BK20190528)、国際遺伝子工学・バイオテクノロジーセンター(CRP/CHN20-04_EC)によって財政的に支援されました.C。 中央大学のための基礎研究資金 (LGZD202004) X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
