Preparazione del campione dell'impianto per la misurazione del contenuto nucleoside/nucleotidico con hplc-MS/MS
Summary
Qui viene descritto un metodo preciso e riproducibile per la quantificazione in vivo dei nucleosidi/nucleotidi nelle piante. Questo metodo utilizza un HPLC-MS/MS.
Abstract
Nucleosides/nucleotidi sono elementi costitutivi di acidi nucleici, parti di cosubstrati e coenzimi, molecole di segnalazione cellulare e portatori di energia, che sono coinvolti in molte attività cellulari. Qui descriviamo un metodo rapido e affidabile per la qualificazione assoluta del contenuto nucleoside/nucleotidico nelle piante. In breve, 100 mg di materiale vegetale omogeneizzato sono stati estratti con 1 mL di tampone di estrazione (metanolo, acetonitrile e acqua con un rapporto di 2:2:1). Successivamente, il campione è stato concentrato cinque volte in un essiccatore a congelatore e quindi iniettato in una colonna di HPLC-MS/MS. Le transizioni di massa di ogni nucleoside e nucleotide sono state monitorate dalla spettrometria di massa. Il contenuto dei nucleosidi e dei nucleotidi è stato quantificato in base ai loro standard esterni (ESTD). Utilizzando questo metodo, quindi, i ricercatori possono facilmente quantificare nucleosides / nucleotidi in diverse piante.
Introduction
I nucleosides/nucleotidi sono componenti metabolici centrali in tutti gli organismi viventi, che sono i precursori degli acidi nucleici e di molti coenzimi, come la nicotinammide adenina dinucleotide (NAD), e importanti nella sintesi di macromolecole come fosfolipidi, glicolipidi e polisaccaridi. Strutturalmente, il nucleoside contiene una nucleobase, che può essere un’adenina, guanina, uracile, citosina o timina, e una moiety zuccherina, che può essere un ribosio o un deossiribosio1,2. I nucleotidi hanno fino a tre gruppi fosfatici che si legano alla posizione a 5 atomi di carbonio della moiety zuccherina dei nucleosidi3. Il metabolismo dei nucleotidi nelle piante è essenziale per la germinazione dei semi e la crescita dellefoglie 4,5,6. Per comprendere meglio il loro ruolo fisiologico nello sviluppo delle piante, è necessario stabilire i metodi per la quantificazione assoluta dei diversi nucleosidi/nucleotidi in vivo.
Uno degli approcci più comunemente usati per misurare nucleosidi/ nucleotidi utilizza una cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata con un rivelatore uv-vis4,7,8,9,10,11. Nel 2013, utilizzando HPLC, Dahncke e Witte hanno quantificato diversi tipi di nucleosidi in Arabidopsis thaliana7. Hanno identificato un contenuto migliorato di guanosina in un mutante di inserimento del DNA T mirato nel gene della deaminasi della guanosina rispetto alla pianta di tipo selvatico. Un altro nucleoside pirimidina, la citidina, è stato anche rilevato quantitativamente nelle piante che utilizzano questo metodo, il che ha portato all’identificazione di un gene di deaminasi citidina in buona fede4. Basato sul rivelatore UV, questo metodo, tuttavia, non può facilmente distinguere i nucleosidi che hanno spettro e tempi di ritenzione simili, ad esempio guanosina o xanthosina. Il limite di rilevamento del metodo HPLC è relativamente alto, quindi, è frequentemente usato per la misurazione di alto contenuto di nucleosidi in vivo, come citidina, uridina e guanosina.
Inoltre, la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) può essere utilizzata anche nella misurazione nucleoside. Beneficiando di esso, Hauck et. al. ha rilevato con successo uridina e acido urico, che è un metabolita a valle della via catabolica nucleoside, nei semi di A. thaliana12. Tuttavia, gc viene normalmente utilizzato per separare i composti volatili ma non adatto alle sostanze termo labili. Pertanto, una cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS) è probabilmente una tecnica analitica più adatta e accurata per l’identificazione, la separazione e la quantificazione in vivo dei nucleosidi/nucleotidi13,14. Diversi studi precedenti hanno riferito che una colonna HILIC può essere utilizzata per la separazione di nucleosidi e nucleotidi15,16 e standard interni isotopicamente etichettati sono stati utilizzati per la quantificazione composta17. Tuttavia, entrambi i componenti sono relativamente costosi, in particolare gli standard commerciali etichettati isotopici. Qui, segnalamo un approccio LC-MS/MS economicamente applicabile per la misurazione di nucleosidi / nucleotidi. Questo metodo è già stato utilizzato con successo per la quantificazione di diversi nucleosidi /nucleotidi, tra cui ATP, N6-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina e pseudouridina1,5,6,18, nelle piante e Drosophila. Inoltre, il metodo che qui riferiamo può essere utilizzato anche in altri organismi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli organismi contengono vari nucleosidi/nucleotidi, inclusi quelli canonici e aberranti. Tuttavia, l’origine e gli endpoint metabolici di essi, in particolare i nucleosidi modificati, sono ancora oscuri. Inoltre, l’attuale comprensione della funzione e dell’omeostasi del metabolismo dei nucleosidi/nucleotidi deve ancora essere esplorata ed ampliata. Per studiarli, è necessario utilizzare un metodo preciso e standard per questi metaboliti di identificazione e quantificazione. Qui, abbiamo descritto un protocollo che uti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dai Fondi di ricerca fondamentali per le università centrali (KJQN202060), dalla National Natural Science Foundation of China (31900907), dalla Fondazione per le scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20190528), dal Centro internazionale per l’ingegneria genetica e le biotecnologie (CRP / CHN20-04_EC) a M.C., e i Fondi di Ricerca Fondamentale per le Università Centrali (LGZD202004) a X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
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