הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם HPLC-MS/MS
Summary
שיטה מדויקת הניתנת לשחזור לכימות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים מתוארת כאן. שיטה זו משתמשת ב- HPLC-MS/MS.
Abstract
נוקלאוזידים/נוקלאוטידים הם אבני בניין של חומצות גרעין, חלקים של cosubstrates וקואנזימים, מולקולות איתות תאים, נשאי אנרגיה, אשר מעורבים בפעילויות תאים רבות. כאן, אנו מתארים שיטה מהירה ואמינה להסמכה מוחלטת של תכולת נוקליאוסיד/נוקלאוטידים בצמחים. בקצרה, 100 מ”ג של חומר צמחי הומוגני הוצא עם 1 מ”ל של חיץ מיצוי (מתנול, אצטוניטריל, ומים ביחס של 2:2:1). מאוחר יותר, המדגם התרכז חמש פעמים במייבש הקפאה ולאחר מכן הוזרק לתוך HPLC-MS / MS. נוקלאוטידים הופרדו על עמוד פחמן גרפי נקבובי (PGC) ונוקליאוסידים הופרדו בעמודה C18. המעברים ההמוניים של כל גרעין ונוקלאוטידים היו במעקב על ידי ספקטרומטריית מסה. התוכן של הנוקלאוזידים והנוקלאוטידים התכמת כנגד הסטנדרטים החיצוניים שלהם (ESTDs). לפיכך, בשיטה זו יכולים החוקרים לכמת בקלות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים שונים.
Introduction
נוקלאוזידים/נוקלאוטידים הם מרכיבים מטבוליים מרכזיים בכל האורגניזמים החיים, שהם סימנים מקדימים לחומצות גרעין וקואנזימים רבים, כגון ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD), וחשובים בסינתזה של מקרומולקולטים כגון פוספוליפידים, גליקוליפידים ופוליסכרידים. מבחינה מבנית, נוקליאוסיד מכיל גרעין, אשר יכול להיות אדנין, גואנין, uracil, ציטוצין, או תימינה, ו moiety סוכר, אשר יכול להיות ריבוז או deoxyribose1,2. נוקלאוטידים יש עד שלוש קבוצות פוספט מחייב את המיקום 5 פחמן של moiety הסוכר של נוקלאוזידים3. חילוף החומרים של נוקלאוטידים בצמחים חיוני לנביטת זרעים וצמיחת עלים4,5,6. כדי להבין טוב יותר את תפקידם הפיזיולוגי בהתפתחות הצמח, יש לקבוע את השיטות לכימות מוחלט של נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שונים ב- vivo.
אחת הגישות הנפוצות ביותר למדידת נוקלאוזידים /נוקלאוטידים מעסיקה כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) בשילוב עם גלאי אולטרה סגול גלוי (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. בשנת 2013, באמצעות HPLC, Dahncke ו- Witte כימתו מספר סוגים של גרעינים ב- Arabidopsis thaliana7. הם זיהו תכולת גואנוסין משופרת במוטנט החדרת T-DNA מיקוד בגן deaminase guanosine בהשוואה לצמח מסוג בר. נוקלאוזיד פירמידין נוסף, ציטידין, זוהה גם הוא כמותית בצמחים המשתמשים בשיטה זו, מה שהביא לזיהוי של גן דימינאז ציטידין בתום לב 4. בהתבסס על גלאי UV, שיטה זו, עם זאת, לא יכול להבחין בקלות את הגרעינים אשר יש ספקטרום דומה וזמני שמירה, למשל, גואנוסין או קסנטוסין. מגבלת הגילוי של שיטת HPLC היא גבוהה יחסית, ולכן, הוא משמש לעתים קרובות למדידת תוכן גבוה של נוקלאוזידים ב vivo, כגון ציטידין, uridine, ו guanosine.
בנוסף, כרומטוגרפיה גז בשילוב ספקטרומטריית מסה (GC-MS) יכול לשמש גם במדידת נוקליאוסיד. מרוויח מזה, האק et. AL. זוהה בהצלחה uridine וחומצת שתן, שהוא מטבוליט במורד הזרם של מסלול קטבולי נוקליאוסיד, בזרעים של A. thaliana12. עם זאת, GC משמש בדרך כלל כדי להפריד תרכובות נדיפות אבל לא מתאים לחומרים labile תרמית. לכן, כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) היא כנראה טכניקה אנליטית מתאימה ומדויקת יותר לזיהוי, הפרדה וכימות של הנוקלאוזידים / נוקלאוטידים13,14. מספר מחקרים קודמים דיווחו כי עמודת HILIC יכולה לשמש עבור נוקלאוזידים ונוקלאוטידיםהפרדת 15,16 ו איסוטופי שכותרתו סטנדרטים פנימיים הועסקו עבור כימות מורכב17. עם זאת, שני הרכיבים יקרים יחסית, במיוחד הסטנדרטים המסחריים עם תווית איזוטופ. כאן, אנו מדווחים על גישה רלוונטית מבחינה כלכלית LC-MS / MS למדידת נוקלאוזידים / נוקלאוטידים. שיטה זו כבר שימשה בהצלחה לכימות של נוקלאוזידים / נוקלאוטידים מגוונים, כולל ATP, N6– מתיל-AMP, AMP, GMP, uridine, ציטידין, פסאודורידין1,5,6,18, בצמחים ו Drosophila. יתר על כן, השיטה שאנו מדווחים כאן ניתן להשתמש אורגניזמים אחרים גם כן.
Protocol
Representative Results
Discussion
אורגניזמים מכילים נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שונים, כולל נוקלאוטידים קנוניים וחורגים. עם זאת, נקודות הקצה של המקור והמטבוליות שלהם, במיוחד נוקלאוזידים ששונו, עדיין מעורפלים. יתר על כן, ההבנה הנוכחית של הפונקציה ואת הומאוסטזיס של חילוף החומרים נוקלאוזידים / נוקלאוטידים להישאר לחקור ולהרחיב….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה כספית על ידי קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (KJQN202060), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31900907), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג’יאנגסו (BK20190528), המרכז הבינלאומי להנדסה גנטית וביוטכנולוגיה (CRP /CHN20-04_EC) ל- M.C., וקרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (LGZD202004) עד X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
