Pflanzenprobenvorbereitung zur Messung des Nukleosid-/Nukleotidgehalts mit EINER HPLC-MS/MS
Summary
Eine präzise und reproduzierbare Methode zur in vivo Nukleoside/Nukleotidquantifizierung in Pflanzen wird hier beschrieben. Diese Methode verwendet eine HPLC-MS/MS.
Abstract
Nukleoside/Nukleotide sind Bausteine von Nukleinsäuren, Teilen von Cosubstraten und Coenzymen, Zellsignalmolekülen und Energieträgern, die an vielen Zellaktivitäten beteiligt sind. Hier beschreiben wir eine schnelle und zuverlässige Methode zur absoluten Qualifizierung von Nukleosid-/Nukleotidgehalten in Pflanzen. Kurz gesagt, 100 mg homogenisiertes Pflanzenmaterial wurden mit 1 ml Extraktionspuffer (Methanol, Acetonitril und Wasser im Verhältnis 2:2:1) extrahiert. Später wurde die Probe fünfmal in einem Gefriertrockner konzentriert und dann in eine HPLC-MS/MS injiziert. Nukleotide wurden auf einer porösen Graphitkohlenstoffsäule (PGC) und Nukleoside auf einer C18-Säule getrennt. Die Massenübergänge jedes Nukleosids und Nukleotids wurden massenspektrometisch überwacht. Die Gehalte der Nukleoside und Nukleotide wurden anhand ihrer externen Standards (ESTDs) quantifiziert. Mit dieser Methode können Forscher daher Nukleoside/Nukleotide in verschiedenen Pflanzen leicht quantifizieren.
Introduction
Nukleoside/ Nukleotide sind zentrale Stoffwechselkomponenten in allen lebenden Organismen, die die Vorläufer für Nukleinsäuren und viele Coenzyme wie Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) sind und wichtig für die Synthese von Makromolekülen wie Phospholipiden, Glykolipiden und Polysacchariden sind. Strukturell enthält Nukleosid eine Nukleobase, die ein Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin oder Thymin sein kann, und einen Zuckerteil, der eine Ribose oder eine Desoxyribose1,2sein kann. Nukleotide haben bis zu drei Phosphatgruppen, die an die 5-Kohlenstoff-Position des Zuckerteils der Nukleosidebinden 3. Der Stoffwechsel von Nukleotiden in Pflanzen ist essentiell für die Samenkeimung und das Blattwachstum4,5,6. Um ihre physiologische Rolle in der Pflanzenentwicklung besser zu verstehen, sollten die Methoden zur absoluten Quantifizierung verschiedener Nukleoside/Nukleotide in vivo etabliert werden.
Einer der am häufigsten verwendeten Ansätze zur Messung von Nukleosiden/ Nukleotiden verwendet eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit einem ultraviolett-sichtbaren (UV-VIS)Detektor 4,7,8,9,10,11. Im Jahr 2013 quantifizierten Dahncke und Witte mit HPLC verschiedene Arten der Nukleoside in Arabidopsis thaliana7. Sie identifizierten einen erhöhten Guanosingehalt in einer T-DNA-Insertionsmutante, die auf das Guanosin-Deaminase-Gen abzielt, verglichen mit der Wildtyppflanze. Ein weiteres Pyrimidinnukleosid, Cytidin, wurde ebenfalls quantitativ in Pflanzen nachgewiesen, die diese Methode anwenden, was zur Identifizierung eines echten Cytidin-Deaminase-Gens4führte. Basierend auf dem UV-Detektor kann diese Methode jedoch nicht leicht die Nukleoside unterscheiden, die ähnliche Spektren und Retentionszeiten aufweisen, z. B. Guanosin oder Xanthosin. Die Nachweisgrenze der HPLC-Methode ist relativ hoch, daher wird sie häufig für die Messung eines hohen Gehalts an Nukleosiden in vivo wie Cytidin, Uridin und Guanosin verwendet.
Darüber hinaus kann die gaschromatographische gekoppelte Massenspektrometrie (GC-MS) auch in der Nukleosidmessung eingesetzt werden. Davon profitieren Hauck et. al. erfolgreich Uridin und Harnsäure, die ein nachgeschalteter Metabolit des Nukleosid-Katabolweges ist, in den Samen von A. thaliana12nachgewiesen wurden. GC wird jedoch normalerweise zur Trennung flüchtiger Verbindungen verwendet, ist jedoch nicht für die thermisch labilen Substanzen geeignet. Daher ist eine mit der Massenspektrometrie gekoppelte Flüssigkeitschromatographie (LC-MS/MS) wahrscheinlich eine geeignetere und genauere Analysetechnik zur In-vivo-Identifizierung, Trennung und Quantifizierung der Nukleoside/Nukleotide13,14. Mehrere frühere Studien berichteten, dass eine HILIC-Säule für Nukleoside und Nukleotide-Trennung15,16 verwendet werden kann und isotopisch markierte interne Standards für die Compound-Quantifizierung17verwendet wurden. Beide Komponenten sind jedoch relativ teuer, insbesondere die kommerziellen isotopenmarkierten Standards. Hier berichten wir über einen wirtschaftlich anwendbaren LC-MS/MS-Ansatz zur Nukleoside/Nukleotid-Messung. Diese Methode wurde bereits erfolgreich zur Quantifizierung verschiedener Nukleoside/Nukleotide, einschließlich ATP, N6-Methyl-AMP, AMP, GMP, Uridin, Cytidin und Pseudouridin1, 5,6,18, in Pflanzen und Drosophilaeingesetzt. Darüber hinaus kann die Methode, über die wir hier berichten, auch in anderen Organismen angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organismen enthalten verschiedene Nukleoside/ Nukleotide, einschließlich kanonischer und abweichender. Der Ursprung und die metabolischen Endpunkte von ihnen, insbesondere modifizierte Nukleoside, sind jedoch noch unklar. Darüber hinaus muss das aktuelle Verständnis der Funktion und Homöostase des Nukleoside/Nukleotidstoffwechsels noch erforscht und erweitert werden. Um sie zu untersuchen, muss eine präzise und goldstandardhafte Methode zur Identifizierung und Quantifizierung dieser Metaboliten eingesetzt werden. Hi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch die Grundlagenforschungsfonds für die Zentralen Universitäten (KJQN202060), die National Natural Science Foundation of China (31900907), die Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20190528), das International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) bis M.C. und die Fundamental Research Funds for the Central Universities (LGZD202004) bis X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
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