Préparation d’échantillons de plantes pour la mesure de la teneur en nucléosides/nucléotides avec une CLHP-MS/MS
Summary
Une méthode précise et reproductible pour la quantification in vivo des nucléosides/nucléotides dans les plantes est décrite ici. Cette méthode utilise une CLHP-MS/MS.
Abstract
Les nucléosides/nucléotides sont des blocs de construction d’acides nucléiques, de parties de cosubstrates et de coenzymes, de molécules de signalisation cellulaire et de vecteurs d’énergie, qui sont impliqués dans de nombreuses activités cellulaires. Ici, nous décrivons une méthode rapide et fiable pour la qualification absolue des teneurs en nucléosides / nucléotides dans les plantes. En bref, 100 mg de matériel végétal homogénéisé ont été extraits avec 1 mL de tampon d’extraction (méthanol, acétonitrile et eau dans un rapport de 2:2:1). Plus tard, l’échantillon a été concentré cinq fois dans un lyophilisateur, puis injecté dans une CLHP-MS/MS. Les nucléotides ont été séparés sur une colonne poreuse de carbone graphitique (PGC) et les nucléosides ont été séparés sur une colonne C18. Les transitions de masse de chaque nucléoside et nucléotide ont été surveillées par spectrométrie de masse. Les teneurs des nucléosides et des nucléotides ont été quantifiées par rapport à leurs étalons externes (ESTD). En utilisant cette méthode, les chercheurs peuvent donc facilement quantifier les nucléosides / nucléotides dans différentes plantes.
Introduction
Les nucléosides/nucléotides sont des composants métaboliques centraux dans tous les organismes vivants, qui sont les précurseurs des acides nucléiques et de nombreux coenzymes, tels que le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), et importants dans la synthèse des macromolécules telles que les phospholipides, les glycolipides et les polysaccharides. Structurellement, le nucléoside contient une nucléobase, qui peut être une adénine, une guanine, un uracile, une cytosine ou une thymine, et une fraction sucrée, qui peut être un ribose ou un désoxyribose1,2. Les nucléotides ont jusqu’à trois groupes phosphates se liant à la position 5-carbone de la fraction sucre des nucléosides3. Le métabolisme des nucléotides chez les plantes est essentiel à la germination des graines et à la croissance des feuilles4,5,6. Pour mieux comprendre leurs rôles physiologiques dans le développement des plantes, il convient d’établir les méthodes de quantification absolue des différents nucléosides/nucléotides in vivo.
L’une des approches les plus couramment utilisées pour mesurer les nucléosides/nucléotides utilise une chromatographie liquide haute performance (CLHP) couplée à un détecteur ultraviolet-visible (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. En 2013, à l’aide de la CLHP, Dahncke et Witte ont quantifié plusieurs types de nucléosides chez Arabidopsis thaliana7. Ils ont identifié une teneur améliorée en guanosine dans un mutant d’insertion d’ADN-T ciblant le gène de la guanosine désaminase par rapport à la plante de type sauvage. Un autre nucléoside de pyrimidine, la cytidine, a également été détecté quantitativement dans les plantes utilisant cette méthode, ce qui a entraîné l’identification d’un gène de la cytidine déaminase de bonne foi 4. Basée sur le détecteur UV, cette méthode, cependant, ne peut pas facilement distinguer les nucléosides qui ont des spectres et des temps de rétention similaires, par exemple, la guanosine ou la xanthosine. La limite de détection de la méthode HPLC est relativement élevée, par conséquent, elle est fréquemment utilisée pour la mesure de la teneur élevée en nucléosides in vivo, tels que la cytidine, l’uridine et la guanosine.
En outre, la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) peut également être utilisée dans la mesure nucléosidique. En bénéficiant, Hauck et. al. a détecté avec succès l’uridine et l’acide urique, qui est un métabolite en aval de la voie catabolique nucléosidique, dans les graines de A. thaliana12. Cependant, gc est normalement utilisé pour séparer les composés volatils, mais ne convient pas pour les substances thermolabiles. Par conséquent, une chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) est probablement une technique d’analyse plus appropriée et plus précise pour l’identification in vivo, la séparation et la quantification des nucléosides/nucléotides13,14. Plusieurs études antérieures ont rapporté qu’une colonne HILIC peut être utilisée pour la séparation des nucléosides et des nucléotides15,16 et des étalons internes marqués isotopiquement ont été utilisés pour la quantification du composé17. Cependant, les deux composants sont relativement coûteux, en particulier les normes commerciales étiquetées isotopiques. Ici, nous rapportons une approche LC-MS/MS économiquement applicable pour la mesure des nucléosides/nucléotides. Cette méthode a déjà été utilisée avec succès pour la quantification de divers nucléosides / nucléotides, y compris l’ATP, N6-méthyl-AMP, AMP, GMP, uridine, cytidine, et pseudouridine1,5,6,18, dans les plantes et la drosophile. D’ailleurs, la méthode que nous rapportons ici peut être employée dans d’autres organizations aussi bien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les organismes contiennent divers nucléosides/nucléotides, y compris des nucléotides canoniques et aberrants. Cependant, l’origine et les paramètres métaboliques de ceux-ci, en particulier les nucléosides modifiés, sont encore obscurs. En outre, la compréhension actuelle de la fonction et de l’homéostasie du métabolisme des nucléosides/nucléotides reste à explorer et à élargir. Pour les étudier, il convient d’utiliser une méthode précise et de référence pour l’identification et la quantificati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu financièrement par les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (KJQN202060), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31900907), la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (BK20190528), le Centre international pour le génie génétique et la biotechnologie (CRP/ CHN20-04_EC) à M.C., et les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (LGZD202004) à X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
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