إعداد عينة النبات لقياس محتوى النيوكليوسيد/النيوكليوتيدات باستخدام جهاز HPLC-MS/MS
Summary
ويرد هنا وصف لطريقة دقيقة وقابلة للاستنساخ في النيوكليوسيدات الحية/النيوكليوتيدات في النباتات. يستخدم هذا الأسلوب HPLC-MS/MS.
Abstract
النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات هي لبنات بناء الأحماض النووية ، وأجزاء من الكوسوبسترات والإنزيمات ، وجزيئات إشارات الخلايا ، وحاملات الطاقة ، والتي تشارك في العديد من أنشطة الخلايا. هنا، ونحن نصف طريقة سريعة وموثوق بها للتأهيل المطلق لمحتويات النيوكليوسيد / النيوكليوتيدات في النباتات. لفترة وجيزة، تم استخراج 100 ملغ من المواد النباتية المتجانسة مع 1 مل من العازلة استخراج (الميثانول، أسيتونيتريل، والمياه بنسبة 2:2:1). وفي وقت لاحق، تركزت العينة خمس مرات في مجفف تجميد ثم حقنت في أحد أعمدة النيوكليوتيدات HPLC-MS/MS. وتم فصلها على عمود كربون جرافيتي مسامي (PGC) وتم فصل النيوكليوسيدات على عمود C18. ورصدت التحولات الجماعية لكل نيوكليوسيد ونوكليوتيد عن طريق قياس الطيف الكتلي. تم قياس محتويات النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات كميا وفقا لمعاييرها الخارجية (ESTDs). باستخدام هذه الطريقة، لذلك، يمكن للباحثين بسهولة قياس النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات في النباتات المختلفة.
Introduction
النيوكليوسيدات/ النيوكليوتيدات هي مكونات التمثيل الغذائي المركزية في جميع الكائنات الحية، والتي هي سلائف للأحماض النووية والعديد من الأنزيمات، مثل النيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد (NAD)، ومهمة في تركيب الجزيئات الكبيرة مثل فوسفوليبيدس، الجليكوليبيدات، والسكريات. هيكليا، النيوكليوسيد يحتوي على نواة، والتي يمكن أن تكون أدينين، جوانين، أوراسيل، السيتوزين، أو الثيمين، وموسيتي السكر، والتي يمكن أن تكون الريبوز أو ديوكسيريبوز1،2. النيوكليوتيدات لديها ما يصل إلى ثلاث مجموعات فوسفات ملزمة لموقف 5 الكربون من moiety السكر من النيوكليوسيدات3. التمثيل الغذائي للنيوكليوتيدات في النباتات أمر ضروري لإنبات البذور ونمو الأوراق4،5،6. لفهم أفضل أدوارها الفسيولوجية في تطوير النبات، ينبغي أن تنشأ أساليب القياس الكمي المطلق للنيوكليوسيدات المختلفة / النيوكليوتيدات في الجسم الحي.
واحدة من النهج الأكثر استخداما لقياس النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات توظف الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إلى جانب الأشعة فوق البنفسجية مرئية (الأشعة فوق البنفسجية-VIS) كاشف4،7،8،9،10،11. في عام 2013، باستخدام HPLC، Dahncke وويت كميا عدة أنواع من النيوكليوسيدات في Arabidopsis thaliana7. وحددوا محتوى معززا من الجوانوزين في عملية استهداف متحولة لإدراج الحمض النووي في جين جوانوسين ديموناسي مقارنة بالنبات البري. كما تم الكشف عن نواة بيريميدين أخرى، وهي السيتيدين، كميا في النباتات التي تستخدم هذه الطريقة، مما أدى إلى تحديد جين الدياميناسي السيتيدين حسن النية 4. واستنادا إلى كاشف الأشعة فوق البنفسجية، لا يمكن لهذه الطريقة أن تميز بسهولة بين النيوكليوسيدات التي لها أطياف وأوقات استبقاء مماثلة، مثل الجوانوزين أو زانثوسين. الحد الأقصى للكشف عن طريقة HPLC مرتفع نسبيا ، لذلك ، فإنه يستخدم بشكل متكرر لقياس المحتوى العالي من النيوكليوسيدات في الجسم الحي ، مثل السيتيدين ، أوريدين ، وغوانوزين.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام كروماتوغرافيا الغاز إلى جانب قياس الطيف الكتلي (GC-MS) في قياس النيوكليوسيد. الاستفادة منه، هاك وآخرون. al. اكتشف بنجاح uridine وحمض اليوريك، وهو المستقلب المصب من مسار تقويضي نيوكليوسيد، في بذور A. الثاليانا12. ومع ذلك، يستخدم عادة GC لفصل المركبات المتطايرة ولكن ليست مناسبة للمواد labile حراريا. لذلك ، فإن الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) هي على الأرجح تقنية تحليلية أكثر ملاءمة ودقة لتحديد النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات13،14. وأفادت عدة دراسات سابقة أن عمود HILIC يمكن استخدامها لفصل النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات15،16 والمعايير الداخلية وصفت نظائرها استخدمت للقياس الكمي المركب17. ومع ذلك، فإن كلا العنصرين مكلفان نسبيا، ولا سيما المعايير التجارية المسماة بالنظائر. هنا، نبلغ عن نهج LC-MS/MS القابل للتطبيق اقتصاديا لقياس النيوكليوسيدات/النيوكليوتيدات. وقد تم بالفعل استخدام هذه الطريقة بنجاح لكمية من النيوكليوسيدات المتنوعة / النيوكليوتيدات، بما في ذلك ATP، N6-ميثيل أمبير، AMP، GMP، uridine، السيتيدين، وswswuridine1،5،6،18، في النباتات وDrosophila. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الطريقة التي نبلغ عنها هنا في كائنات حية أخرى أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحتوي الكائنات الحية على العديد من النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات ، بما في ذلك تلك الكنسية والانحرافات. ومع ذلك ، فإن أصلها ونقاط النهاية الأيضية منها ، وخاصة النيوكليوسيدات المعدلة ، لا تزال غامضة. وعلاوة على ذلك، فإن الفهم الحالي لوظيفة وهوتوستاسيس من التمثيل الغذائي للنيوكليوسيدات/ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (KJQN202060)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31900907)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20190528)، والمركز الدولي للهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية (CRP/CHN20-04_EC) إلى M.C، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (LGZD202004) إلى X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
