Forniamo un protocollo dettagliato per l’interferenza dell’RNA mediato dall’elettroporazione negli insetti dell’ordine Odonata (libellule e damselflies) usando il damselfly dalla coda blu (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) e la libellula skimmer pied(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Libellule e damselflies (ordine Odonata) rappresentano uno degli insetti più ancestrali con metamorfosi, in cui cambiano drasticamente il loro habitat, morfologia e comportamento dalle larve acquatiche agli adulti terrestri / aerei senza stadio pupale. Gli adulti odonata hanno una visione del colore ben sviluppata e mostrano una notevole diversità nei colori e nei motivi del corpo tra sessi, stadi e specie. Mentre sono stati condotti molti studi ecologici e comportamentali sull’Odonata, gli studi genetici molecolari sono stati scarsi principalmente a causa della difficoltà di applicare l’analisi funzionale genica all’Odonata. Per esempio, l’interferenza dell’RNA (RNAi) è meno efficace nell’Odonata, come riportato nei Lepidotteri. Per superare questo problema, abbiamo stabilito con successo un metodo RNAi combinato con l’elettroporazione in vivo. Qui forniamo un protocollo dettagliato che include un video del metodo RNAi mediato dall’elettroporazione come segue: preparazione delle larve, identificazione delle specie, preparazione della soluzione di dsRNA / siRNA e aghi di iniezione, anestesia ghiacciata delle larve, iniezione di dsRNA / siRNA, elettroporazione in vivo e allevamento individuale fino all’emergere adulto. Il metodo RNAi mediato dall’elettroporazione è applicabile sia alle damselflies (sottordine Zygoptera) che alle libellule (sottordine Anisoptera). In questo protocollo, presentiamo i metodi per la damigella dalla coda blu Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) come esempio di specie damselfly e la libellula skimmer pied Pseudothemis zonata (Libellulidae) come un altro esempio di specie di libellula. Come esempi rappresentativi, mostriamo i risultati di RNAi che prendono di mira il gene di sintesi della melanina multicopper ossidasi 2. Questo metodo RNAi faciliterà la comprensione di varie funzioni geniche coinvolte nella metamorfosi, morfogenesi, formazione di modelli di colore e altre caratteristiche biologiche dell’Odonata. Inoltre, questo protocollo può essere generalmente applicabile agli organismi non modello in cui la RNAi è meno efficace nella soppressione genica a causa dell’inefficienza e della bassa penetranza.
Libellule e damselflies (l’ordine Odonata) sono tra i gruppi di insetti più ancestrali che mostrano “metamorfosi”1,2. Per metamorfosi, cambiano drasticamente il loro habitat, morfologia e comportamento dalle larve acquatiche agli adulti terrestri / aerei3. Gli adulti odonata hanno una visione del colore ben sviluppata e rappresentano una notevole diversità nei colori e nei motivi del corpo tra sessi, stadi especie 3,4,5. Mentre molti studi ecologici e comportamentali sull’Odonata sono staticondotti 6,7, gli studi genetici molecolari sono stati ostacolati principalmente dalla difficoltà di applicare l’analisi funzionale genica all’Odonata.
Il metodo convenzionale di interferenza dell’RNA (RNAi), in cui l’RNA a doppio filamento (dsRNA) viene iniettato per sopprimere la funzione del genedi interesse 8, si è rivelato inefficace negli insetti Odonata9,come riportato negli insetti Lepidopteran10. D’altra parte, rapporti precedenti hanno suggerito che l’RNAi mediato dall’elettroporazione è efficace nelle specie di lepidotteri, specialmente nei tessuti epidermici11,12,13. Recentemente abbiamo scoperto che l’RNAi mediato dall’elettroporazione funziona efficacemente nella piccola libellula Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, ma N. pygmaea è una specie relativamente rara e quindi non adatta per studi genetici molecolari.
La maggior parte delle specie di Odonata sono classificate in uno dei due sottordini, Zygoptera (damselflies) o Anisoptera (vere libellule)3. Qui ci siamo concentrati sulla damselfly dalla coda blu Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figura 1A) come specie rappresentativa degli Zigotteri e della libellula pied skimmer Pseudothemis zonata (Libellulidae; Figura 1B) come specie rappresentativa di Anisopteran. Le due specie sono tra le specie di Odonata più comuni negli stagni naturali e urbani in Giappone, comprese quelle della città di Tsukuba, e possiamo raccogliere molte larve delle due specie nel campo. Recentemente abbiamo istituito un sistema di allevamento in laboratorio per le singole larve di I. senegalensis,che ha permesso il monitoraggio continuo dello sviluppo e della morfogenesi delle larve di Odonata nel dettaglio14.
In questa relazione, forniamo un metodo raffinato e un protocollo video per l’RNAi mediato dall’elettroporazione in I. senegalensis e P. zonata. In Giappone, I. senegalensis e Ischnura asiatica, che sono geneticamente vicine, si trovano spesso sympatrically15e sono difficili da distinguere nelle larve16. Descriviamo anche come due specie di Ischnura possono essere distinte per polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP).
Per valutare l’efficacia del RNAi mediato dall’elettroporazione, selezioniamo il gene multicopper ossidasi 2 (MCO2; noto anche come laccasi2) come gene bersaglio rappresentativo, a causa del fenotipo visibile del colore della cuticola più pallide al knockdown dell’espressione genica9. MCO2 è noto per essere essenziale per oscurare l’epidermide in una varietà di specie diinsetti 17,18.
Letalità del trattamento RNAi
Abbiamo scoperto che la letalità del trattamento RNAi dipende fortemente dalla storia e dalle condizioni di allevamento delle larve di Odonata. Le larve subito dopo la raccolta sul campo sono generalmente sane e mostrano bassi tassi di mortalità dopo il trattamento RNAi mediato dall’elettroporazione. Al contrario, le larve allevate in laboratorio per un lungo periodo di tempo (ad esempio, un mese) tendono a soffrire di bassi tassi di successo di emergenza adulta. In I. senegalensis, invece delle larve raccolte sul campo, le larve allevate in laboratorio dalle uova possono essereutilizzate 14, ma i tassi di successo di RNAi utilizzando le larve allevate in laboratorio tendono ad essere notevolmente inferiori (molti individui sono morti durante la metamorfosi) rispetto a quelli che utilizzano le larve raccolte sul campo. Inoltre, l’alimentazione larvale frequente e l’allevamento di acqua pulita sono importanti per aumentare i tassi di successo dell’emergenza adulta e ridurre la letalità del trattamento RNAi.
Efficienza del trattamento RNAi
Come descritto sopra, i livelli di fenotipo RNAi, vale a dire le dimensioni e la posizione della decolorazione della cuticola, spesso presentavano notevoli variazioni tra gli individui sottoposti allo stesso trattamento RNAi (ad esempio, figura 4), ma i livelli della penetranza fenotipico sembrano essere notevolmente diversi tra le specie di Odonata. Le regioni fenotipiche osservate erano più grandi e più importanti in I. senegalensis (figure 4-5) che in P. zonata (Figura 6) e N. pygmaea9. Questa differenza può essere dovuta allo spessore della cuticola sulla superficie larvale, considerando che la cuticola di I. senegalensis è più sottile della cuticola di P. zonata e N. pygmaea). Per quanto esaminato, non è stata riconosciuta alcuna chiara differenza tra gli effetti del siRNA e dell’dsRNA(figura 4, tabella 1).
Fase di sviluppo appropriata per RNAi
Va notato che una corretta stadiazione larvale è importante per eseguire RNAi in modo efficiente. L’inibizione della pigmentazione adulta è stata causata da MCO2 RNAi prima dello stadio D (circa 3 giorni prima dell’emergere degli adulti), che è coerente con il precedente rapporto su N. pygmaea9. I fenotipi RNAi osservati quando iniettati nelle fasi C e D erano meno evidenti di quelli trattati nelle fasi A e B, il che indica che gli stadi C e D potrebbero essere troppo tardi per sopprimere sufficientemente l’espressione genica. La tempistica appropriata per il trattamento RNAi dipende dalla tempistica dell’espressione genica e il gene MCO2 mostra un’espressione transitoriamente elevata durante l’emergenzaadulta 9, come in altriinsetti 17,18. Nello stinkbug Plautia stali, il knockdown RNAi del gene MCO2 è stato osservato dal giorno 4 in poi dopo l’iniezione27, che è coerente con i risultati attuali.
Il nostro precedente studio su I. senegalensis ha mostrato che, dopo la fase B, i giorni di emergenza adulta mostrano variazioni relativamente piccole tra la maggior parte delle larve instar finali, suggerendo che lo stadio B può corrispondere all’inizio del processo verso l’emergere adulto, dopo di che i processi di sviluppo per la metamorfosi procedono in modo prefissato e coordinato14. Anomalie morfologiche causate da ferite sono state spesso osservate quando le larve sono state trattate con RNAi nelle fasi C e D(Figura 7B, 7C). Questo è probabile che sia associato a una progressione drammatica della metamorfosi durante queste fasi, suggerendo che il trattamento RNAi dovrebbe essere evitato dallo stadio C e oltre. In sintesi, si consiglia di utilizzare larve instar finali nella fase A o B (o nella fase prima che le ali larvali si espandano in modo significativo) per esperimenti RNAi.
Utilità e superiorità del metodo RNAi mediato dall’elettroporazione
Il RNAi convenzionale è un metodo sperimentale semplice e potente, ma alcune lignaggi di insetticome farfalle 10,afidi28 e libellule9 mostrano una bassa efficienza RNAi, per la quale la creazione dell’analisi della funzione genica è una sfida importante. In questo studio, la Corte ha riscontrato che la RNAi mediata dall’elettroporazione può indurre la soppressione genica locale nelle libellule con quasi il 100% di efficienza, almeno nell’epidermide, se trattata in fasi di sviluppo appropriate(tabella 1). Recentemente, i knockout genetici basati su CRISPR /Cas9 sono stati applicati con successo a una varietà di insetti, fornendo un potente strumento genetico molecolare per organismi non modello29. Qui, tuttavia, sottoseloiamo che CRISPR / Cas9 è certamente eccezionale, ma il metodo RNAi mediato dall’elettroporazione può essere superiore a CRISPR / Cas9 per alcuni aspetti.
In primo luogo, nel metodo RNAi mediato dall’elettroporazione, la regione corporea in cui compaiono i fenotipi RNAi può essere facilmente controllata sperimentalmente dalla posizione dell’elettrodo positivo all’elettroporazione. Inoltre, poiché la regione in cui l’espressione genica viene soppressa è limitata intorno alla regione in cui è stato posizionato l’elettrodo positivo, i fenotipi RNAi possono essere facilmente confrontati con i fenotipi di controllo fianco a fianco nello stesso individuo. In secondo luogo, rispetto al metodo CRISPR/Cas9 in cui le uova iniettate devono essere allevate fino all’età adulta per osservare i fenotipi knockout, l’RNAi mediato dall’elettroporazione è superiore in quanto i fenotipi gene knockdown possono di solito essere osservati in tempi molto più brevi. Ad esempio, ci vogliono dai tre ai quattro mesi per I. senegalensis e da uno a due anni per P. zonata dalle uova agliadulti 14,30. Tuttavia, per osservare i fenotipi RNAi all’interno dell’epidermide adulta, ci vuole meno di un mese dall’iniezione di dsRNA nelle larve finali instar nella fase B all’emergere adulto sia per I. senegalensis che per P. zonata (Figura 7). In terzo luogo, il metodo RNAi mediato dall’elettroporazione comporta l’iniezione di dsRNA in larve di grandi dimensioni, che è più facile della microiniezione in minuscole uova necessarie per il metodo CRISPR /Cas9. Inoltre, l’RNAi mediato dall’elettroporazione è applicabile alle specie di insetti le cui uova appena deposte sono difficili da raccogliere. Ad esempio, le femmine di P. zonata depongono le uova su piante galleggianti sulla superficie dell’acqua durante il volo, e quindi è difficile raccogliere le loro uova sia in campo che in laboratorio. Pertanto, ci aspettiamo che questo protocollo possa essere generalmente applicabile agli organismi non modello in cui il metodo RNAi convenzionale non funziona in modo efficiente.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Minoru Moriyama per la consulenza tecnica e i supporti, Bin Hirota e Ryutaro Suzuki per la raccolta delle larve di Odonata e Misa Shinya per i commenti utili sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 to GO e JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 e JP20H04936 to RF.
12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
DraI | Takara Bio | 1037A | |
Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
Hand net | HOGA | IS33-3B | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
Laboratory Jack (150×150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |