שיטת הפרעות RNA בתתיווך אלקטרופולציה באודונה

הערה: הערכה הכוללת של הפרוטוקולים מוצגת איור 1. 1. הכנת זחלים של שפיריות או עלמה. לאסוף זחלים בשדה באמצעות רשת יד.הערה: אני. זחלי סנגלנסיס נצמדים לעתים קרובות לצמחי מים צפים על פני המים, בעוד זחלי P. zonata לעתים קרובות להישאר בין המלטה עלים בתחתית. בעיר Tsukuba, הזחלים instar הסופי של I. סנגלנסיס נמצאים בעיקר ממרץ עד יוני, ואלה של P. zonata ממאי עד יוני. I. זחלי סנגלנסיס ניתן לגדל מביצים במעבדה14, אבל הזחלים שנאספו בתחום יש שיעור הצלחה גבוה יותר בבירור של הופעת מבוגרים. זיהוי מינים על ידי פולימורפיזם אורך שבר הגבלה (RFLP) של מוצרים מוגברים PCR.הערה: שלב זה נחוץ רק אם המין קשה לזהות מן המראה של הזחלים, כמו I. סנגלנסיס. החזק אחד הזימים caudal של זחל באמצעות מדפים. לאחר מכן, הזחל נופל מהגיל caudal שלה עצמו (גרימת אוטוטומיה).הערה: לזחלים של עלמה זיגופטרנית יש בדרך כלל שלושה זימים קאודאליים (איור 1A). כאשר הם מותקפים על ידי טורף, הם יכולים להוריד את הזימים caudal שלהם לברוח. אם הזימים הקוודאליים אינם זמינים, חלק מהרגל מנותחת. שים אחד caudal זימ לתוך 100 μL של פתרון PBS [0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.115% Na2HPO4, ו 0.02% KH2PO4 (w /v)] ו homogenize עם מערבל יד באמצעות עלה הפקדה. סובב כלפי מטה את התערובת ב- 5,000 x g למשך 10 שניות, ונושא 0.5 μL של הגברה על-טבעית ל- PCR באמצעות פולימראז DNA פריימרים כדי להגביר את המאריך הפנימי מתמלל 1 (ITS1) אזור של ה-DNA הגרעיני.הערה: בצע את ה- PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן. השילוב של ITS-F0 (5′- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3′) ו 5.8S-AS1 (5′- GCC GGC CCT CAG G -3′) פריימרים יכולים להגביר את אזור ITS1 כמעט בכל מיני אודונטה19. הדגירה את התערובת של 1 μL של מוצר PCR מוגברת, 0.3 μL של 10x M Buffer, 0.1 μL של אנזים הגבלת DraI, ו 1.6 μL של מים ב 37 °C (69 °F) עבור 1 שעות.הערה: בחר את אנזימי ההגבלה הטובים ביותר, בהתאם לשילוב של מינים. אם אין אנזימי הגבלה המתאימים לזיהוי מינים, אשר על ידי ריצוף DNA. לטעון 2 μL של המוצרים עם טעינת צבע על 2% ג’ל אגרוז ולהפעיל אלקטרופורזה.הערה: קשה לזהות מינים בעת שימוש 1% או 1.5% ג’ל אגרוז. בדוק את דפוס האלקטרופורזה כדי לזהות את המין (איור 2).הערה: תבניות RFLP הן תלויות מינים ואוכלוסייה. באוכלוסיית Tsukuba, I. asiatica יש להקה גדולה של 400-500 bp, ואילו I. senegalensis יש להקה גדולה של כ 200 bp ורצועה נוספת של פחות מ 100 bp (ראש חץ איור 2). אזור ITS1 קיים בעותקים מרובים בגנום, ובמין אישי, פולימורפיזם מיקרו-סטלי בתוך אזור ITS1 קיים לעתים קרובות באותו אדם, המשפיע על התבנית של RFLPs. מאחור את הזחלים שנאספו במעבדה עד לשימוש עבור RNAi. מניחים כל זחל בנפרד לתוך כל באר של צלחת 12 באר עם כ 3 מ”ל של מים.הערה: I. זחלי סנגלנסיס חייבים להישמר בנפרד כי הם לעתים קרובות קניבליזציה אחד את השני, בעוד P. זחלים זונטה יכול להישמר בקבוצה כי הם לעתים רחוקות קניבליזציה. להאכיל I. זחלי סנגלנסיס עם שרימפס מלח ארטמיה כל יום ו P. זונטה זחלים עם תולעי דם ו / או תולעי Tubifex לפחות פעמיים בשבוע עד שהם גדלים לשלב ההתפתחותי המתאים עבור RNAi.הערה: האכלה תכופה היא קריטית כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של הופעת מבוגרים. לשנות את המים ברגע שהוא הופך מלוכלך עם צואה או שאריות.הערה: שינוי מים תכופים חשוב גם כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של הופעת מבוגרים. שפטו את השלב ההתפתחותי המתאים עבור RNAi.הערה: הזחלים instar הסופי של I. סנגלנסיס ניתן לסווג לתוך חמישה שלביםהתפתחותיים 14,20. השלב הראשון (שלב א’, לפני שהכנפיים מתחילות להתרחב) או השלב השני (שלב ב’) של זחלי instar הסופיים מתאים לניסויי RNAi, כאשר בוחנים את הפנוטיפ הברור של RNAi לאחר הופעת מבוגרים (ראו דיון). ב P. zonata, הזחלים instar הסופי לפני הרחבת הכנף (המקביל לשלב A של I. סנגלנסיס) שימשו במחקר זה. 2. הכנת פתרון dsRNA / siRNA ומחטי הזרקה עבור RNAi. הערה: בחר RNA מפריע קטן (siRNA) (שלב 2.1) או RNA דו-תקע (dsRNA) (שלב 2.2) כפתרון עבור RNAi. הכנת פתרון siRNA עיצוב siRNA באמצעות siDirect תוכנית גירסה 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21,בעקבותההנחיות שדווחו בעבר חרקים Lepidopteran22. השג siRNA מסונתז מסחרית.הערה: הרצפים של siRNA מיקוד גן MCO2 של I. סנגלנסיס בשימוש במחקר זה היו כדלקמן: 5′- GCA CUU UCC UCC AUC AAU AUA -3′ עבור גדיל חוש ו 5′- UAU UGA UAA AAA AAA GUG CUC -3′ עבור גדיל antisense. כשליטה שלילית, הרצפים של siRNA מיקוד חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) הגן היו כדלקמן: 5 ‘- GCA UCA AGG AGG ACU ACA AGA -3′ עבור גדיל חוש ו 5′- UUG AAG UUC UUG AUG CCG -3′ עבור גדילantisense 11. לדלל את siRNA ל 100 מיקרומטר עם חיץ הזרקה [100 mM CH3COOK, 2 מ”ג מ”ג (CH3COO)2, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]22. יש לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הכנת פתרון dsRNA. בחר אזור 300-400 bp עבור dsRNA באמצעות תוכנית primer3 גירסה 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 ולעצב את ערכות פריימר. השג ערכות פריימר מסונתזות מסחרית.הערה: כדי לייצר תבניות עבור סינתזת dsRNA, ערכות פריימר בשימוש במחקר זה היו כדלקמן: (5′- GCC TGT CAG CTT CTT CC -3′ עבור פריימר קדימה ו 5′- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3′ עבור פריימר הפוך) עבור גנים MCO2 של I. senegalensis (IsMCO2, גישה לא. LC589180) ו (5′- CCG CAC ACA CTA TTA AA -3′ עבור פריימר קדימה ו 5′- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3′ עבור פריימר הפוך) עבור גנים MCO2 של P. zonata (PzMCO2, הצלחה לא. LC589179). כשליטה שלילית, ערכת פריימר עבור dsRNA מיקוד β-lactamase (בלה)גן על וקטור שיבוט היו (5′- CTA TGT GGC GCG GTA TTA T -3′ עבור פריימר קדימה ו 5′- CAG AAG TGG TCC TGC AAC T-3′ עבור פריימר הפוך). לחלץ RNA מן הזחלים Odonata באמצעות ערכת מיצוי RNA זמין מסחרית ולבצע סינתזה cDNA באמצעות תעתיק הפוך על פי פרוטוקול היצרן.הערה: ניתן להשתמש גם בספריית cDNA המוכנה לניתוח רצף RNA. הגבר את רצפי המטרה באמצעות cDNA מסונתז ואת ערכת פריימר מעוצב לשבט אותם לתוך וקטור שיבוט באמצעות רצועות מסחריות על פי פרוטוקול היצרן. להפוך את הפלסמיד לתאים מוסמכים E. coli ולאסוף מושבה אחת לאחר הדגירה לילה. PCR-הגבר את אזור ההוספה באמצעות פריימרים בווקטור. אשר את הרצף המשוכפל על-ידי רצף סנגר. PCR-להגביר את הכנס באמצעות פריימרים וקטוריים המכילים את רצף מקדם פולימראז T724, 25.הערה: במחקר זה, פריימרים הבאים שימשו: T7-F (5’ – TAA TAC GAC TCA CTA תג GGA GAC תג TCA TAT GGA T – 3 ‘) ו T7-R (5′- TAA TAC GAC TCA תג CTA GGA GGG GGG GGG ATC CGA T – 3’) 25. לטהר את המוצר PCR באמצעות ערכת טיהור PCR על פי פרוטוקול היצרן, לרחף את ה-DNA עם 50 μL של מים מזוקקים, ולרכז את פתרון ה-DNA אלוט כ 10 μL באמצעות אידוי צנטריפוגלי. לסנתז dsRNA על ידי תמלול במבחנה על פי פרוטוקול היצרן. השתמש בסך הכל של 1000 ננוגרם תבנית DNA ו dsRNA מסונתז elute עם 100 μL של מאגר אלוטיון. למדוד את הריכוז של dsRNA באמצעות ספקטרופוטומטר ולאשר את האיכות של dsRNA על ידי אלקטרופורזה על 1.5% ג’ל אגרוז.הערה: ניתן לראות רצועה אחת כאשר סינתזת dsRNA מצליחה. לדלל dsRNA ל 1000 ng/μL עם מאגר אלוטיון ולאחסן ב -20 °C (60 °F) עד השימוש. הכנת מחטי הזרקה משוך נימי זכוכית באמצעות מושך מחט זכוכית. מניחים את קצה נימי משך על סרט דבק דו צדדי ולשבור את קצה נימי עם מדפים. תן את נימי למזרק.הערה: קל יותר לטפל נימי אם אתה לובש כפפות ניטריל. טען תמיסת siRNA/dsRNA ל נימי מוכן.הערה: אין להשתמש בנימי שוב ושוב מכיוון שטיפ נימי מוזרק עלול להיות סתום בעפר מכיוון שהזחלים שנאספו בשדה חיו בבוץ. 3. הזרקת siRNA/dsRNA הערה: ההליך שונה במקצת עבור damselflies (שלב 3.1) שפיריות (שלב 3.2). הזרקה לזחל זיגופטרני (Damselfly) (למשל, I. סנגלנסיס). הרדמה של זחל מכוסה בנייר רטוב על קרח כתוש למשך 50-70 שניות (איור 3A-C).הערה: משך ההרדמה הקרה כקרח תלוי במצב הזחל; אם הזחל מתחיל לנוע לאחר 70 שניות של הרדמה קרה כקרח, מוחלות 70 שניות נוספות של הרדמה קרה כקרח. עבור זחלים כי לעתים רחוקות לנוע (למשל, P. zonata), הליך זה אינו חיוני. צרף שני פינים משני צידי הפרותורקס ותקן את הזחל לעמוד קבוע (למשל, חתיכת קלקר) (איור 3D).הערה: התאימו את המיקום ואת מספר הפינים, בהתאם למקום ההזרקה. למתוח את הממברנה הבין-מגזרית בין קטע הבטן 7 ו -8 עבור RNAi בבטן או בין פרותורקס וסינתורקס (mesothorax מותך metathorax) עבור RNAi בבית החזה באמצעות ידיים ומדפים. יש למתוח את הממברנה הבין-מגזרית ביד. הכנס את קצה נימי מוכן לתוך הממברנה הבין-מגזרית המתוחה (איור 3D, 3F). להזריק 1 μL של פתרון siRNA / dsRNA. הזרקה לזחל אניסופטראן (שפירית) (למשל, פ. זונטה). מנגבים את המים מפני הזחל במגבת נייר. במידת הצורך, צרפו שני סיכות משני צידי הפרותורקס וסדרו את הזחל לעמוד קבוע (למשל, חתיכת קלקר) (איור 3H).הערה: התאימו את המיקום ואת מספר הפינים, בהתאם למקום ההזרקה. במקרה של P. zonata, אין זה חיוני כדי לתקן את הזחלים עם סיכות בשלב זה. למתוח את הממברנה הבין-מגזרית בין קטע הבטן הרביעית וה-5 ביד. לעשות חור קטן עם מחט בסדר קרום בין מגזרי בין קטע 4 ו 5 קטע הבטן.הערה: הליך זה נחוץ עבור מינים רבים אניסופטראן (שפירית) כי הממברנה הבין-מגזרית קשה מדי להכניס נימי זכוכית ישירות. הכנס את קצה נימי מוכן לתוך החור המוכן (איור 3I).הערה: כפי שמוצג באיזור 3H, חלק מהצד הגבי של הזחלים תואם לצד הגחוני של המבוגר, כך שהפנוטיפ מופיע באופן גחוני כשמתייחסים אליו כפי שמוצג באיזור 3H-J. להזריק 1 μL של פתרון siRNA / dsRNA. 4. ב vivo אלקטרופורציה במידת הצורך, להוסיף סיכות נוספות כדי לתקן את הזחל לעמוד קבוע (למשל, חתיכת קלקר). בעקבות הזריקה של פתרון siRNA / dsRNA, להחיל שתי טיפות של ג’ל אולטרסאונד על פני השטח הזחל באמצעות מדפים. מניחים אלקטרודות על ג’ל אולטרסאונד, עם האלקטרודה החיובית בצד מוזרק עם פתרון siRNA / dsRNA ואלקטרודה שלילית בצד הנגדי (איור 3E, 3G, 3J).הערה: אין לגעת ישירות באפידרמיס של הזחל כדי למנוע את השפעת הצריבה של אלקטרופורציה. צור פולסים של 10 פעמים אלקטרופוזיה (280 ms/s כל אחד) באמצעות אלקטרופורטור.הערה: התאימו את המתח של אלקטרופורציה, בהתאם למינים, לשלבים ולרקמות. במחקר זה, 25 V הוחל על I. סנגלנסיס ו 45 V כדי P. zonata. לנגב את הג’ל הנותר על פני השטח עם מגבת נייר. שמור את הזחלים המטופלים נחים על מגבת נייר רטובה במשך יום אחד בערך להחלמה ולהעביר אותם למקרה גידול ביום שלמחר. 5. ניתוח פנוטיפי ספציפי לאתר שמור I. senegalensis בנפרד בצלחת פטרי (5 ס”מ קוטר) המכיל כ 10 מ”ל של מים פיסת מגבת נייר, ולשמור P. zonata בכלוב פלסטיק עם רשת חד פעמית לא ארוגים (כלוב אקלוסיה14). עבור I. senegalensis, לאחר שהזחלים מפסיקים לאכול, להעביר אותם בנפרד לתוך כלוב פלסטיק עם רשת חד פעמית לא ארוגה.הערה: אין לשים שני זחלים או יותר באותו כלוב. אחרת, הם יהיו קניבליזציה אחד את השני מיד לאחר שהם הופכים למבוגרים. לאחר הופעתו של המבוגר, להתבונן ולצלם את הפנוטיפ סביב האזור שבו האלקטרודה החיובית הונחה עבור אלקטרופורציה.הערה: הפנוטיפ מופיע רק במדבקות. פנוטיפים הם לעתים קרובות קשה לזהות מיד לאחר הופעתה עקב פיגמנטציה שלם. על מנת לבחון את היעילות של RNAi (למשל, כמותי RT-PCR), אם הפנוטיפ גלוי, לנתח את האזור ולהשוות אותו עם האזור ללא פנוטיפ.הערה: הרמות של פנוטיפ RNAi, כלומר גודל ומיקום של decolorization קוטיקל, לעתים קרובות להפגין שונות ניכרת בין אנשים (ראה איור 4). שמור את המבוגרים הגיחים ב 100% EtOH לניתוחים עתידיים.הערה: צבע הגוף של מינים Odonata נמוג במהירות לאחר המוות, ולכן חשוב לאחסן אותם באתנול לפני שהם מתים. אתנול לפעמים מביעות את החרקים, במקרים כאלה שהחרקים קפואים לפני שהם מתים.