Elektroporatie-gemedieerde RNA Interferentie Methode in Odonata

OPMERKING: Het algemene schema van de protocollen wordt weergegeven in figuur 1. 1. Voorbereiding van larven van libellen of damselflies. Verzamel larven in het veld met behulp van een handnet.OPMERKING: I. senegalensis larven klampen zich vaak vast aan waterplanten die op het wateroppervlak drijven, terwijl P. zonata larven vaak tussen bladstrooisel op de bodem blijven. In Tsukuba City zijn de laatste instar larven van I. senegalensis vooral te vinden van maart tot juni, en die van P. zonata van mei tot juni. I. senegalensis larven kunnen worden gekweekt uit eieren in het laboratorium14, maar de larven verzameld in het veld hebben het duidelijk hogere slagingspercentage van volwassen opkomst. Identificatie van soorten door beperking fragmentlengte polymorfisme (RFLP) van PCR-versterkte producten.LET OP: Deze stap is alleen nodig als de soort moeilijk te identificeren is aan de verschijning van de larven, zoals in I. senegalensis. Houd een van de staartkieuwen van een larve met tangen. Vervolgens valt de larve van zijn staartkieuw zelf (waardoor autotomie).OPMERKING: Larven van Zygopteran jonkvrouwen hebben meestal drie staartkieuwen(figuur 1A). Wanneer ze worden aangevallen door een roofdier, kunnen ze opstijgen hun eigen caudal kieuwen om te ontsnappen. Als de caudale kieuw niet beschikbaar is, wordt een deel van het been ontleed. Doe één caudale kieuw in 100 μL PBS-oplossing [0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na2HPO4en 0,02% KH2PO4 (w/v)] en homogeniseren met een mixerhand met behulp van een statiegeldplaag. Draai het mengsel gedurende 10 seconden naar beneden bij 5.000 x g en onderdeel 0,5 μL van de supernatant aan PCR-versterking met behulp van DNA polymerase en primers om het interne getranscribeerde spacer 1 (ITS1) gebied van het nucleaire DNA te versterken.OPMERKING: Voer de PCR uit volgens het protocol van de fabrikant. De combinatie van ITS-F0 (5′- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3′) en 5.8S-AS1 (5′- GCC GGC CCT CAG CCA G -3′) primers kunnen its1-regio versterken in bijna alle Odonata-soorten19. Incubeer het mengsel van 1 μL PCR-versterkt product, 0,3 μL 10x M Buffer, 0,1 μL DraI beperkingsenzym en 1,6 μL water bij 37 °C gedurende 1 uur.LET OP: Selecteer de beste beperkingsenzymen, afhankelijk van de combinatie van soorten. Als er geen beperking enzymen geschikt voor de identificatie van soorten, bevestigen door DNA-sequencing. Laad 2 μL van de producten met ladingskleurstof op 2% agarose gel en voer elektroforese uit.OPMERKING: Het is moeilijk om soorten te identificeren bij het gebruik van 1% of 1,5% agarose gel. Controleer het elektroforesepatroon om de soort te identificeren (figuur 2).OPMERKING: RFLP-patronen zijn van soort en populatieafhankelijk. In Tsukuba bevolking, I. asiatica heeft een belangrijke band van 400-500 bp, terwijl I. senegalensis heeft een belangrijke band van ongeveer 200 bp en een extra band van minder dan 100 bp (een pijlpunt in figuur 2). De ITS1-regio bestaat in meerdere kopieën in het genoom, en in Ischnura soorten, microsatelliet polymorfisme binnen de ITS1 regio is vaak aanwezig in hetzelfde individu, die het patroon van RFLPs. Achter de verzamelde larven in het laboratorium tot gebruik voor RNAi. Plaats elke larve afzonderlijk in elke put van een 12-put plaat met ongeveer 3 mL water.OPMERKING: I. senegalensis larven moeten individueel worden gehouden omdat ze elkaar vaak kannibaliseren, terwijl P. zonata larven in een groep kunnen worden gehouden omdat ze zelden kannibaliseren. Voer I. senegalensis larven met Artemia pekelgarnalen elke dag en P. zonata larven met bloedwormen en/of Tubifex wormen ten minste twee keer per week totdat ze groeien tot de geschikte ontwikkelingsfase voor RNAi.OPMERKING: Frequente voeding is van cruciaal belang om het slagingspercentage van volwassen opkomst te verhogen. Verander het water zodra het vuil wordt met uitwerpselen of restjes.OPMERKING: Frequente waterverandering is ook belangrijk om het slagingspercentage van volwassen opkomst te verhogen. Beoordeel de juiste ontwikkelingsfase voor RNAi.LET OP: De uiteindelijke instar larven van I. senegalensis kan worden ingedeeld in vijf ontwikkelingsstadia14,20. De eerste fase (fase A, voordat de vleugels beginnen uit te breiden) of de tweede fase (fase B) van de uiteindelijke instarlarven is geschikt voor RNAi-experimenten, bij het overwegen van het heldere fenotype van RNAi na volwassen opkomst (zie Discussie). In P. zonatawerden in deze studie de laatste instarlarven voor vleugeluitbreiding (overeenkomend met fase A van I. senegalensis) gebruikt. 2. Bereiding van dsRNA/siRNA-oplossing en injectienaalden voor RNAi. OPMERKING: Selecteer klein storend RNA (siRNA) (stap 2.1) of dubbelstrengs RNA (dsRNA) (stap 2.2) als oplossing voor RNAi. Bereiding van de siRNA-oplossing Ontwerp siRNA met siDirect programma versie 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21, volgens de richtlijnen eerder gemeld in Lepidopteran insecten22. Verkrijgen commercieel gesynthetiseerd siRNA.OPMERKING: De sequenties van siRNA gericht op MCO2 gen van I. senegalensis gebruikt in deze studie waren als volgt: 5′- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AAU -3′ voor sense streng en 5′- UAU UGA UAA CAA AAA GUG CUC -3′ voor antisense streng. Als een negatieve controle, de sequenties van siRNA gericht op verbeterde groene fluorescerende eiwit (EGFP)gen waren als volgt: 5′- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3′ voor zintuiglijke streng en 5′- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3′ voor antisense streng11. Verdun het siRNA tot 100 μM met injectiebuffer [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg(CH3COO)2, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]22. Bewaar op -80 °C tot gebruik. Voorbereiding van dsRNA-oplossing. Selecteer een 300-400 bp regio voor dsRNA met primer3 programma versie 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 en ontwerp de primer sets. Verkrijg commercieel gesynthetiseerde primersets.OPMERKING: Voor de productie van sjablonen voor dsRNA-synthese waren de primersets die in deze studie werden gebruikt als volgt: (5′- GCC TGT CAG CTT CTT CTT CC -3′ voor voorwaartse primer en 5′- GGT GTC CGG CGG ACA ACT AT -3′ voor reverse primer) voor MCO2-genen van I. senegalensis (IsMCO2, toetreding nr. LC589180) en (5′- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3′ voor forward primer en 5′- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3′ for reverse primer) voor MCO2 genen van P. zonata (PzMCO2, toetreding nr. LC589179). Als een negatieve controle, de primer set voor dsRNA targeting β-lactamase (bla) gen op het klonen vector waren (5′- CTA TGT GGCG GTA TTA T -3′ voor voorwaartse primer en 5′- CAG AAG TGG TGG TGC AGC AAC T -3 ‘ voor omgekeerde primer). Haal RNA uit Odonata-larven met behulp van een commercieel verkrijgbaar RNA-extractiekit en voer cDNA-synthese uit met behulp van omgekeerde transcriptase volgens het protocol van de fabrikant.LET OP: cDNA-bibliotheek die is voorbereid op RNA-sequencing-analyse kan ook worden gebruikt. Versterk de doelsequenties met behulp van de gesynthetiseerde cDNA en de ontworpen primer set en kloon ze in het klonen vector met behulp van een commerciële ligase volgens het protocol van de fabrikant. Zet de plasmide om in E. coli competente cellen en pak een enkele kolonie op na nachtelijke incubatie. PCR-versterken van de insert regio met behulp van primers op de vector. Bevestig de gekloonde sequentie door Sanger sequencing. PCR-amplificeren van de insert met behulp van vector primers met de T7 polymerase promotor sequentie24, 25.OPMERKING: In deze studie werden de volgende primers gebruikt: T7-F (5′ – TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T – 3′) en T7-R (5′- TAA TAC GAC CCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T – 3’) 25. Zuiver het PCR-product met behulp van de PCR-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant, ontwijk het DNA met 50 μL gedestilleerd water en concentreer de eluted DNA-oplossing op ongeveer 10 μL met behulp van een centrifugale verdamper. Synthetiseer dsRNA door in vitro transcriptie volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik in totaal 1000 ng template DNA en elute synthesized dsRNA met 100 μL elution buffer. Meet de concentratie van dsRNA met behulp van een spectrofotometer en bevestig de kwaliteit van dsRNA door elektroforese op een 1,5% agarose gel.LET OP: Een enkele band kan worden gezien wanneer dsRNA synthese succesvol is. Verdun dsRNA tot 1000 ng/μL met elutiebuffer en bewaar tot gebruik bij -20 °C. Bereiding van injectienaalden Trek een glazen capillaire met behulp van een glazen naald trekker. Plaats de punt van de getrokken capillaire op een dubbelzijdige plakband en breek de punt van de capillaire met tangen. Zet de capillaire op een injector.LET OP: Het is gemakkelijker om met de capillaire om te gaan als je nitrilhandschoenen draagt. Laad siRNA/dsRNA-oplossing op de voorbereide capillaire.OPMERKING: Gebruik de capillaire niet herhaaldelijk, omdat het puntje van de geïnjecteerde capillaire kan verstopt raken met vuil omdat de larven verzameld in het veld leefden in de modder. 3. siRNA/dsRNA-injectie LET OP: De procedure is iets anders voor damselflies (stap 3.1) en libellen (stap 3.2). Injectie aan een Zygopteran (moederzelf) larve (b.v., I. senegalensis). Verdoven een larve bedekt met een nat papier op gemalen ijs gedurende 50-70 seconden (Figuur 3A-C).OPMERKING: Duur van ijskoude anesthesie is afhankelijk van de toestand van de larve; als de larve begint te bewegen na 70 seconden ijskoude anesthesie, wordt nog eens 70 seconden ijskoude anesthesie aangebracht. Voor larven die zich zelden bewegen (bijvoorbeeld P. zonata),is deze procedure niet essentieel. Bevestig twee pinnen aan beide zijden van de prothorax en bevestig de larve op een vaste standaard (bijvoorbeeld een stuk piepschuim) (Figuur 3D).LET OP: Pas de positie en het aantal pinnen aan, afhankelijk van de plaats van injectie. Strek het intersegmentale membraan tussen de 7e en 8e buiksegment voor RNAi in de buik of tussen de prothorax en synthorax (gesmolten mesothorax en metathorax) voor RNAi in de thorax met behulp van handen en tangen. Houd het intersegmentale membraan met de hand uitgerekt. Plaats de punt van de voorbereide capillaire in het uitgerekte intersegmentale membraan(figuur 3D, 3F). Injecteer 1 μL siRNA/dsRNA-oplossing. Injectie aan een Anisopteran (libelle) larve (bijv. P. zonata). Veeg het water van het larveoppervlak met een papieren handdoek. Bevestig indien nodig twee pinnen aan beide zijden van de prothorax en bevestig de larve op een vaste standaard (bijvoorbeeld een stuk piepschuim) (Figuur 3H).LET OP: Pas de positie en het aantal pinnen aan, afhankelijk van de plaats van injectie. In het geval van P. zonatais het niet essentieel om de larven bij deze stap met pinnen te fixeren. Strek het intersegmentale membraan tussen het 4e en 5e buiksegment met de hand. Maak een klein gaatje met een fijne naald in het intersegmentale membraan tussen het 4e en 5e buiksegment.OPMERKING: Deze procedure is noodzakelijk voor veel Anisopteran (libelle) soorten omdat het intersegmentale membraan te moeilijk is om een glascapillaire direct in te voegen. Steek de punt van de voorbereide capillaire in het voorbereide gat(figuur 3I).OPMERKING: Zoals aangegeven in figuur 3Hkomt een deel van de rugzijde van de larven overeen met de ventrale kant van de volwassene, zodat het fenotype ventrally verschijnt wanneer het wordt behandeld zoals weergegeven in figuur 3H-J. Injecteer 1 μL siRNA/dsRNA-oplossing. 4. in vivo elektroporatie Voeg indien nodig meer pinnen toe om de larve aan een vaste standaard te bevestigen (bijvoorbeeld een stuk piepschuim). Breng na de injectie van de siRNA/dsRNA-oplossing twee druppels ultrasone gel op het larvenoppervlak aan met tangen. Plaats elektroden op de ultrasone gel, met de positieve elektrode aan de zijkant geïnjecteerd met de siRNA / dsRNA oplossing en een negatieve elektrode aan de andere kant(Figuur 3E, 3G, 3J).OPMERKING: Raak de opperhuid van de larve niet direct aan om het brandende effect van elektroporatie te voorkomen. Genereer 10-keer elektroporatie pulsen (280 ms/s per stuk) met behulp van een elektroporator.OPMERKING: Pas de spanning van elektroporatie aan, afhankelijk van de soort, stadia en weefsels. In deze studie werd 25 V toegepast op I. senegalensis en 45 V naar P. zonata. Veeg de resterende gel op het oppervlak af met een papieren handdoek. Houd de behandelde larven ongeveer een dag op een natte papieren handdoek rustend voor herstel en breng ze op de volgende dag over naar een opfoedcase. 5. Site-specifieke fenotypische analyse Houd I. senegalensis individueel in een petrischaaltje (5 cm in diameter) met ongeveer 10 mL water en een stuk papieren handdoek, en bewaar P. zonata in een plastic kooi met een wegwerp niet-geweven gaas (eclosion kooi14). Voor I. senegalensis, nadat de larven stoppen met eten, verplaats ze individueel in een plastic kooi met een wegwerp niet-geweven gaas.LET OP: Stop niet twee of meer larven in dezelfde kooi. Anders zullen ze elkaar kunnennibaliseren onmiddellijk nadat ze volwassen zijn geworden. Na de opkomst van de volwassene, observeren en fotograferen van het fenotype rond het gebied waar de positieve elektrode werd geplaatst voor elektroporatie.LET OP: Het fenotype verschijnt alleen in patches. Fenotypes zijn vaak moeilijk onmiddellijk na het ontstaan te herkennen als gevolg van onvolledige pigmentatie. Om de efficiëntie van RNAi (bijvoorbeeld kwantitatieve RT-PCR) te onderzoeken, ontleden als het fenotype zichtbaar is, het gebied en vergelijk het met de regio zonder het fenotype.OPMERKING: De niveaus van RNAi fenotype, namelijk grootte en locatie van de cuticula ontkleuring, vertonen vaak aanzienlijke variatie tussen individuen (zie figuur 4). Houd de voorgekomen volwassenen in 100% EtOH voor toekomstige analyses.OPMERKING: Lichaamskleur van Odonata-soorten vervaagt snel na de dood, dus het is belangrijk om ze op te slaan in ethanol voordat ze sterven. Ethanol verkleurt soms de insecten, in dergelijke gevallen dat de insecten worden ingevroren voordat ze sterven.