طريقة تدخل الحمض النووي الريبي بوساطة كهربائية في أودوناتا
Summary
نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتدخل الحمض النووي الريبي بوساطة كهربائية في حشرات النظام Odonata (اليعسوب وdamselflies) باستخدام السد الأزرق الذيل(Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) واليعسوب المقشود pied(Pseudothemis zonata: التشهير: Anisoptera).
Abstract
اليعسوب وdamelflies (النظام Odonata) تمثل واحدة من أكثر الحشرات الأجداد مع التحول ، والتي تغير بيئتها ، مورفولوجيا ، والسلوك بشكل كبير من اليرقات المائية إلى البالغين الأرضيين / الجويين دون مرحلة الجراء. يتمتع البالغون في أودوناتا برؤية لونية متطورة ويظهرون تنوعًا ملحوظًا في ألوان الجسم وأنماطه عبر الجنسين والمراحل والأنواع. في حين أجريت العديد من الدراسات الإيكولوجية والسلوكية على أودوناتا، كانت الدراسات الوراثية الجزيئية نادرة أساسا بسبب صعوبة في تطبيق التحليل الوظيفي الجيني على أودوناتا. على سبيل المثال، تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) أقل فعالية في أودوناتا، كما ورد في Lepidoptera. للتغلب على هذه المشكلة، أنشأنا بنجاح طريقة RNAi جنبا إلى جنب مع في الكهربائية في الجسم الحي. هنا نقدم بروتوكول مفصل بما في ذلك شريط فيديو لطريقة RNAi بوساطة كهربائية على النحو التالي: إعداد اليرقات ، وتحديد الأنواع ، وإعداد محلول dsRNA / siRNA وإبر الحقن ، والتخدير البارد لليرقات ، وحقن dsRNA / siRNA ، في electroporation الجسم الحي ، والتربية الفردية حتى ظهور البالغين. طريقة RNAi بوساطة كهربائية قابلة للتطبيق على كل من damselflies (Zygoptera) واليعسوب (أدنى أمر Anisoptera). في هذا البروتوكول، نقدم أساليب سد أزرق الذيل Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) كمثال على الأنواع damselfly واليعسوب المكاشطة الزائفة Pseudothemis zonata (قذفة) كمثال آخر من أنواع اليعسوب. كأمثلة تمثيلية، نعرض نتائج RNAi التي تستهدف تخليق الميلانين جين multicopper أوكسيديز 2. هذه الطريقة RNAi سوف تسهل فهم مختلف وظائف الجينات المشاركة في التحول، morphogenesis، تشكيل نمط اللون، وغيرها من السمات البيولوجية من أودوناتا. وعلاوة على ذلك، قد يكون هذا البروتوكول قابلاً للتطبيق عموماً على الكائنات غير النموذجية التي تكون فيها RNAi أقل فعالية في قمع الجينات بسبب عدم الكفاءة وانخفاض البينة.
Introduction
اليعسوب وdamelflies (النظام Odonata) هي من بين أكثر المجموعات الأجداد من الحشرات التي تظهر “التحول”1،2. بواسطة التحول، فإنها تغير بيئتها، مورفولوجيا، والسلوك بشكل كبير من اليرقات المائية إلى الأرض / الجوية البالغين3. إن البالغين في أودوناتا يتمتعون برؤية لونية متطورة ويمثلون تنوعًا ملحوظًا في ألوان الجسم وأنماطه عبر الجنسين والمراحل والأنواع3و4و5. في حين أن العديد من الدراسات الإيكولوجية والسلوكية على أودوناتا قد أجريت6,7, وقد أعاقت الدراسات الوراثية الجزيئية أساسا من صعوبة في تطبيق التحليل الوظيفي الجيني إلى أودوناتا.
تدخل الحمض النووي الريبي التقليدية (RNAi) طريقة, التي مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA (dsRNA) يتم حقن لقمع وظيفة الجين من مصلحة8, تبين أن تكون غير فعالة في الحشرات أودوناتا9, كما ذكرت في الحشرات Lepidopteran10. من ناحية أخرى ، وقد اقترحت تقارير سابقة أن RNAi بوساطة كهربائية فعالة في أنواع Lepidopteran ، وخاصة في أنسجة البشرة11،12،13. وجدنا مؤخرا أن RNAi بوساطة الكهربائية يعمل بشكل فعال في اليعسوب نانوفيا الأقزام صغيرة (تقذف: Anisoptera)9، ولكن N. pygmaea هو نوع نادر نسبيا ، وبالتالي ليست مناسبة للدراسات الجينية الجزيئية.
تصنف معظم أنواع أودوناتا إلى أي من الجيرات اثنين، Zygoptera (damselflies) أو Anisoptera (اليعسوب الحقيقي)3. هنا ركزنا على السد الأزرق الذيل Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; الشكل 1أ) باعتبارها من الأنواع Zygopteran ممثل وpied اليعسوب المكشط Pseudothemis zonata (قذفة ؛ الشكل 1B) باعتبارها تمثل الأنواع Anisopteran. النوعان من الأنواع هي من بين الأنواع الأكثر شيوعا أودوناتا في البرك الطبيعية والحضرية في اليابان، بما في ذلك تلك الموجودة في مدينة تسوكوبا، ويمكننا جمع العديد من يرقات النوعين في هذا المجال. في الآونة الأخيرة أنشأنا نظام تربية المختبرات لليرقات الفردية من I. senegalensis، والتي مكنت من الرصد المستمر للتنمية وmorphogenesis من يرقات أودوناتا في التفاصيل14.
في هذا التقرير، ونحن نقدم طريقة المكرر وبروتوكول الفيديو لرنابي بوساطة الكهربائية في I. senegalensis وP. zonata. في اليابان، I. السنغال وآسياتيكا Ischnura، والتي هي قريبة وراثيا ، وغالبا ما توجد sympatrically15، وأنها من الصعب التمييز في اليرقات16. كما أننا نصف كيف يمكن تمييز نوعين من الاشنورا من خلال تعدد الأشكال في طول جزء القيد (RFLP).
لتقييم فعالية RNAi بوساطة كهربائية، نختار جين أوكسيديز 2 متعدد الأكوز (MCO2؛ المعروف أيضا باسم laccase2)كمورث هدف تمثيلي، على حساب النمط الظاهري المرئي للون بشرة شحوب عند الضربة القاضية للتعبير الجيني9. ومن المعروف أن MCO2 ضروري لتعتمق البشرة في مجموعة متنوعة من أنواع الحشرات17،18.
Protocol
Representative Results
Discussion
فتك العلاج RNAi
وجدنا أن فتاك علاج RNAi يعتمد بقوة على تاريخ تربية وحالة يرقات أودوناتا. اليرقات بعد وقت قصير من جمع في هذا المجال هي صحية عموما وتظهر معدلات وفيات منخفضة بعد العلاج RNAi بوساطة الكهربائية. وعلى النقيض من ذلك، تميل اليرقات التي تربى في المختبر لفترة طويلة من الزمن (مثل شهر واحد) إلى المعاناة من انخفاض معدلات نجاح ظهور البالغين. في I. senegalensis، بدلا من اليرقات التي تم جمعها في الحقل ، يمكن استخدام اليرقات التي تربى في المختبر من البيض14، ولكن معدلات نجاح RNAi باستخدام اليرقات التي يتم تربيتها في المختبر تميل إلى أن تكون أقل بكثير (توفي العديد من الأفراد أثناء التحول) من أولئك الذين يستخدمون اليرقات التي تم جمعها في الميدان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تغذية اليرقات المتكررة وتربية المياه النظيفة أمران مهمان لزيادة معدلات نجاح ظهور البالغين والحد من فتك معالجة الرنابي.
كفاءة العلاج RNAi
كما هو موضح أعلاه، فإن مستويات النمط الظاهري RNAi، أي حجم وموقع إزالة الألوان، غالبا ما أظهرت تباينا كبيرا بين الأفراد الذين تعرضوا لنفس المعاملة RNAi (على سبيل المثال، الشكل 4)،ولكن مستويات بينترترانس الظاهري يبدو أن تختلف بشكل ملحوظ بين الأنواع أودوناتا. وكانت مناطق الظاهرة الملحوظة أكبر وأكثر بروزا في I. senegalensis (الأرقام 4-5)مما كانت عليه في P. zonata (الشكل 6) وN. pygmaea9. قد يكون هذا الفرق بسبب سمك بشرة على سطح اليرقات ، مع الأخذ في الاعتبار أن بشرة I. senegalensis أرق من بشرة P. zonata و N. pygmaea). بقدر ما درسنا، لم يتم التعرف على أي فرق واضح بين آثار سيرنا وDSRNA(الشكل 4، الجدول 1).
مرحلة التطوير المناسبة لـ RNAi
تجدر الإشارة إلى أن التدريج المناسب لليرقات مهم لأداء RNAi بكفاءة. وقد تسبب تثبيط تصبغ الكبار من قبل MCO2 RNAi قبل المرحلة D (ما يقرب من 3 أيام قبل ظهور الكبار)، وهو ما يتفق مع التقرير السابق على N. pygmaea9. وكانت الأنماط الظاهرية RNAi التي لوحظت عند حقنها في المرحلتين C و D أقل وضوحا من تلك التي عولجت في المرحلتين A و B، والتي تشير إلى أن المرحلتين C و D قد تكون متأخرة جدا لقمع التعبير الجيني بشكل كاف. التوقيت المناسب لعلاج RNAi يعتمد على توقيت التعبير الجيني، والمورثات MCO2 معارض التعبير العالي عابرة خلال ظهور الكبار9، كما هو الحال في الحشرات الأخرى17،18. في stinkbug Plautia ستالي، لوحظ ضربة قاضية RNAi من الجين MCO2 من اليوم 4 فصاعدا بعد الحقن27، وهو ما يتفق مع النتائج الحالية.
أظهرت دراستنا السابقة حول I. senegalensis أنه بعد المرحلة B ، تظهر أيام لظهور البالغين اختلافًا صغيرًا نسبيًا بين غالبية يرقات instar النهائية ، مما يشير إلى أن المرحلة B قد تتوافق مع بداية العملية نحو ظهور البالغين ، وبعد ذلك تمضي العمليات التنموية للتحول بطريقة مسبوقة ومنسقة14. وكثيراً ما لوحظت تشوهات مورفولوجية ناجمة عن الجروح عندما كانت اليرقات تعالج في المرحلتين C وD(الشكل 7B, 7C). ومن المرجح أن يكون هذا مرتبطا مع تطور دراماتيكي من التحول خلال هذه المراحل, مما يشير إلى أن العلاج RNAi ينبغي تجنبها من المرحلة C وعلى. وباختصار، نوصي بأن تستخدم يرقات إنستار النهائية في المرحلة A أو B (أو في المرحلة قبل أن تتوسع أجنحة اليرقات بشكل كبير) لإجراء تجارب RNAi.
فائدة وتفوق أسلوب RNAi بوساطة الكهربة
وRNAi التقليدية هي طريقة تجريبية بسيطة وقوية ، ولكن بعض أنساب الحشرات مثل الفراشات10، المن28 واليعسوب9 معرض منخفضة كفاءة RNAi ، والتي إنشاء تحليل وظيفة الجينات هو تحد كبير. في هذه الدراسة، وجدنا أن RNAi بوساطة كهربائية يمكن أن تحفز على قمع الجينات المحلية في اليعسوب مع كفاءة 100٪ تقريبا، على الأقل في البشرة، إذا عولجت في مراحل النمو المناسبة(الجدول 1). في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق خروج المغلوب للجينات المستندة إلى CRISPR / Cas9 بنجاح على مجموعة متنوعة من الحشرات ، مما يوفر أداة جينية جزيئية قوية للكائنات غير النموذجية29. هنا ، ومع ذلك ، فإننا نشير إلى أن CRISPR / Cas9 هو بالتأكيد كبيرة ولكن الأسلوب RNAi بوساطة كهربائية قد تكون متفوقة على CRISPR / Cas9 في بعض النواحي.
أولاً، في طريقة RNAi بوساطة كهربائية، منطقة الجسم حيث تظهر الأنماط الظاهرية RNAi يمكن التحكم فيها بسهولة تجريبياً من قبل موضع القطب الموجب عند electroporation. وبالإضافة إلى ذلك، بما أن المنطقة التي يتم فيها قمع التعبير الجيني محدودة في جميع أنحاء المنطقة التي تم فيها وضع القطب الموجب، يمكن مقارنة الأنماط الظاهرية RNAi بسهولة مع الأنماط الظاهرية للتحكم جنبًا إلى جنب في نفس الفرد. ثانيا ، بالمقارنة مع CRISPR / Cas9 الطريقة التي حقن البيض يجب أن تكون تربى على مرحلة البلوغ لمراقبة ظاهرية خروج المغلوب ، و RNAi بوساطة الكهربائية متفوقة في أن الجينات ضرب الظاهري يمكن عادة أن يلاحظ في وقت أقصر بكثير. على سبيل المثال، يستغرق ثلاثة إلى أربعة أشهر ل. سنغالنسنسيس سنة إلى سنتين لP. zonata من البيض إلى البالغين14،30. ومع ذلك ، من أجل مراقبة الأنماط الظاهرية RNAi داخل البشرة البالغة ، يستغرق الأمر أقل من شهر واحد من حقن DSRNA إلى يرقات instar النهائية في المرحلة B إلى ظهور البالغين لكل من I. senegalensis و P. zonata (الشكل 7). ثالثاً، إن طريقة RNAi التي يتم بوساطة كهربائية تنطوي على حقن DSRNA في يرقات كبيرة، وهو أسهل من الحقن المجهري في البيض الصغير المطلوب لطريقة CRISPR/Cas9. وبالإضافة إلى ذلك، فإن RNAi بوساطة كهربائية ينطبق على أنواع الحشرات التي يصعب جمع بيضها الذي وضع حديثاً. على سبيل المثال، تضع الإناث من P. zonata البيض على النباتات العائمة على سطح الماء أثناء الطيران، وبالتالي فإنه من الصعب جمع بيضهم في كل من الحقل وفي المختبر. وبالتالي، نتوقع أن يكون هذا البروتوكول قابلاً للتطبيق بشكل عام على الكائنات غير النموذجية التي لا تعمل فيها الطريقة التقليدية لـ RNAi بكفاءة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مينورو مورياما على المشورة الفنية والدعم، وبن هيروتا وريوتارو سوزوكي لجمع يرقات أودوناتا، وميسا شينيا للتعليقات المفيدة على المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI أرقام منحة JP18J21561 إلى GO وJP18H02491، JP18H04893، JP19H03287، وJ20H04936 إلى RF.
Materials
| 12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
| Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
| Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
| Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
| Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
| Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
| DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
| DraI | Takara Bio | 1037A | |
| Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
| Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
| Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
| Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
| Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
| Hand net | HOGA | IS33-3B | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
| Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
| KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
| KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
| KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
| Laboratory Jack (150×150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
| LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
| Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
| MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
| Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
| Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
| Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
| Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
| pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
| Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
| Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |
References
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Wipfler, B., et al. Evolutionary history of Polyneoptera and its implications for our understanding of early winged insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (8), 3024-3029 (2019).
- Corbet, P. S. . Dragonflies Behavior and Ecology of Odonata. , (1999).
- Futahashi, R. Color vision and color formation in dragonflies. Current Opinion in Insect Science. 17, 32-39 (2016).
- Futahashi, R. Diversity of UV reflection patterns in Odonata. Frontiers in Ecology and Evolution. 8 (201), (2020).
- Córdoba-Aguilar, A. . Dragonflies and damselflies. Model organisms for ecological and evolutionary research. , (2008).
- Bybee, S., et al. Odonata (dragonflies and damselflies) as a bridge between ecology and evolutionary genomics. Frontiers in Zoology. 13 (46), (2016).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castelles, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference the red flour beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. 92, 52059 (2014).
- Okude, G., et al. Electroporation-mediated RNA interference reveals a role of multicopper oxidase 2 gene in dragonfly’s cuticular pigmentation. Applied Entomology and Zoology. 53 (3), 379-387 (2017).
- Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57, 231-245 (2011).
- Ando, T., Fujiwara, H. Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects. Development. 140, 454-458 (2013).
- Nishikawa, H., et al. A genetic mechanism for female-limited Batesian mimicry in Papilio butterfly. Nature Genetics. 47 (4), 405-409 (2015).
- Osanai-Futahashi, M., et al. Positional cloning of a Bombyx pink-eyed white egg locus reveals the major role of cardinal in ommochrome synthesis. Heredity. 116 (2), 135-145 (2016).
- Okude, G., Futahashi, R., Tanahashi, M., Fukatsu, T. Laboratory rearing system for Ischnura senegalensis (Insecta: Odonata) enables detailed description of dragonfly’s larval development and morphogenesis. Zoological Science. 34 (5), 386-397 (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. . Dragonflies of Japan (3rd edition). , (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. . The Handbook of Japanese Aquatic Insects. Volume 3: Dragonfly larvae. , (2019).
- Arakane, Y., Noh, M. Y., Asano, T., Kramer, K. J. Tyrosine metabolism for insect cuticle pigmentation and sclerotization. Extracellular Composite Matrices in Arthropods. , 165-220 (2016).
- Asano, T., et al. Mini-review an insect-specific system for terrestrialization: Laccase-mediated cuticle formation. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 108, 61-70 (2019).
- Futahashi, R., Okude, G., Sugimura, M., Ugai, S. Interspecific hybrids in Japanese Odonata. Tombo. 60, 1-49 (2018).
- Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Interspecific crossing between blue-tailed damselflies Ischnura elegans and I. senegalensis in the laboratory. Entomological Science. 23 (2), 165-172 (2020).
- Naito, Y., Yoshimura, J., Morishita, S., Ui-Tei, K. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 10, 392 (2009).
- Yamaguchi, J., Mizoguchi, T., Fujiwara, H. siRNAs induce efficient RNAi response in Bombyx mori embryos. PLoS ONE. 6 (9), e25469 (2011).
- Untergasser, A., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
- Futahashi, R. Whole-mount in situ hybridization of sectioned tissues of species hybrids to detect cis-regulatory changes in gene expression pattern. Methods in Molecular Biology. 772, 319-328 (2011).
- Matsuura, Y., Kikuchi, Y., Miura, T., Fukatsu, T. Ultrabithorax is essential for bacteriocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9376-9381 (2015).
- Henze, M. J., Lind, O., Wilts, B. D., Kelber, A. Pterin-pigmented nanospheres create the colours of the polymorphiic damselfly Ischnura elegans. Journal of The Royal Society Interface. 16, 20180785 (2019).
- Nishide, Y., et al. Diversity and function of multicopper oxidase genes in the stinkbug Plautia stali. Scientific Reports. 10 (1), 3464 (2020).
- Christiaens, O., Swevers, L., Smagghe, G. DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay. Peptides. 53, 307-314 (2014).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and prospects of CRISPR/Cas systems in insects and other arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Miyakawa, K. A study of the life-history of Pseudothemis zonata (Burm.) (Odonata, Libellulidae) II. Immature stage. Kontyû. 37 (4), 409-422 (1969).
