정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

이 프로토콜은 국립 보건 의학 센터의 지침을 따릅니다. 쥐에 수행 된 모든 실험 절차는 글로벌 건강 및 의학 동물 실험위원회에 대한 국립 센터에 의해 승인됩니다.참고: 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에설명되어 있습니다. 1. 지질 제제 표시된 농도의 유리 튜브에서 메탄올에 다음 지질을 녹입니다: 나트륨 팔미타트, 16 mg/mL; 나트륨 올레아테, 30 mg/mL; 콜레스테롤, 4 mg/mL. 지질 용액을 -30°C에 저장하고 사용하기 전에 샘플을 해동하십시오. 100 μg/mL 팔미타테, 100 μg/mL 올레아테, 20 μg/mL 콜레스테롤의 최종 농도를 얻는 데 필요한 용량으로 신선한 유리 튜브에서 1.1단계에서 제조된 지질 용액을 섞는다. 예를 들어, 배양 매체의 10mL를 준비할 때, 팔미타테 용액의 62.5 μL, 올레아테 용액33μL, 콜레스테롤 용액 50μL을 유리 튜브에 섞는다. 지질 용액(도2A 및 2B)을통해 질소 가스를 전달하여 메탄올을 증발시다. 질소 가스를 사용할 수 없는 경우 파이펫 보조를 사용하여 용액을 통해 공기를 전달합니다. 37°C(도2C)에서수조에서 유리튜브를 가열하여 남은 메탄올을 완전히 증발시다.참고: 제한된 공간에서 고농도의N2 가스를 사용하는 것은 잠재적으로 해로울 수 있습니다. 메탄올을 증발시키는 프로토콜에 사용되는 부피는 제한되어 있어 안전하다고 여겨지지만, 방을 적절히 환기시키고 잠재적으로 고농도의N2 가스의 라벨링 영역은 예기치 않은 가스 누출이 발생할 경우 중요합니다. 2. 중간 준비 Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)/F12 매체 (HEPES 및 글루타민)를 준비하십시오. 페니실린과 연쇄상 구균 황산염을 배지에 넣고 각각 50단위 및 50 μg/mL의 최종 농도를 가한다. 항생제를 함유하는 DMEM/F12 배지는 적어도 2개월 동안 4°C에서 저장될 수 있다. Dulbecco의 수정된 이글 매체(DMEM)/F12 매체(HEPES 및 글루타민)에 소 세럼 알부민(BSA)의 4%를 추가합니다. NaOH 용액을 사용하여 매체의 pH를 pH 7.4-7.8로 조정하여, 전형적으로 pH 7.6로 조정한다. 1단계에서 준비된 유리 튜브에 배지를 추가합니다. 최대 용해도가 있는 솔루션을 얻으려면 3-15mL 배지를 추가하는 것이 좋습니다. 초음파 처리로 지질을 완전히 녹입니다 (최적의 : 초음파 처리 20 분 이상). BSA와 지질이 용해된 후, 시료는 -80°C에 저장되고 2개월 이내에 사용해야 한다. 사용하기 직전에 해동하십시오. DMEM/F12에 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레니트 나트륨 및 에탄올 아민(ITS-X) 혼합물의 1/1,000을 추가합니다. 0.22 μm 필터(“배양 매체”로 지정)를 사용하여 혼합 배지를 필터링합니다. 사용하기 전에, 인간 줄기 세포 인자 (SCF) 및 인간 혈전포이에틴 (TPO)을 배양 배지에 각각 3 ng/mL의 최종 농도로 추가한다. 사이토카인과 ITS-X를 추가한 후 배지를 저장할 수 없습니다. 염색 버퍼: Ca-및 Mg 가성정제 식염수(PBS)에 10% FCS를 추가합니다. 이 용액은 2 주 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다. 해빙 미디어: DMEM/F12에 10% FCS를 추가합니다. 이 솔루션은 일회용입니다. Cytokine 스톡 솔루션: 20 μg/mL에서 PBS(Ca-및 Mg-free)에 각 인간 SCF 또는 인간 TPO를 용해합니다. 이 용액은 활동 손실없이 적어도 1 년 동안 -80 °C에서 저장할 수 있습니다. 해동후 후, 재고 용액을 4°C로 저장하고 1개월 이내에 사용하십시오.참고: BSA의 오염 물질의 변동을 피하기 위해 모든 구매 후 로트 검사합니다. BSA의 다른 배치와 동시에 문화 HSC및 아래에 설명된 바와 같이 7일째에 표현형 HSC 번호를 검사합니다. BSA 배치가 CD34+ 셀의 낮은 수 또는 빈도(예: 입력 셀의 절반 미만)를 표시하는 경우 이 일괄 처리를 사용하지 마십시오. 3. 인간의 골수 CD34+ 세포의 준비 인간 CD34+ 골수 세포를 구입하고 사용까지 액체 질소에 세포를 저장합니다. 대안적으로, 건강한 자원 봉사자 또는 신선한 코드 혈액 세포에서 골수 세포는 연구소 윤리위원회와 기증자동의에 의해 승인에 의해 사용될 수 있습니다. 37°C 수조에서 15mL 원물 튜브에서 해동 매체의 따뜻한 10mL. 2 분 이내에 37 °C 수조에서 바이알에서 냉동 된 세포를 해동하십시오. 오염물질을 제거하기 위해 70% 에탄올로 바이알을 닦은 후, 3.2단계에서 미리 따뜻진 배지를 함유한 15mL 원물관으로 세포를 이송한다. 15mL 튜브의 원심분리기는 실온에서 15분 동안 200 × g로 원심분리합니다. 펠릿을 그대로 유지하기 위해 수퍼중을 조심스럽게 흡인하십시오(< 50 μL의 중간 크기). 나머지 배지로 세포를 다시 중단하고 얼음에 1.5 mL 튜브로 옮기.참고: 눈 또는 상처받은 조직을 포함하여 점막에서 직접 인간 유래 견본에 노출은 알려지거나 알려지지 않은 병원체에 의하여 감염을 일으키는 원인이 될 수 있습니다; 따라서, 장갑과 안경은 인간의 세포를 취급할 때 추천됩니다. 구입한CD34+세포가 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV1)에 대해 음수를 테스트하더라도, 노출 발생률이 발생하면 제도적 지침에 따라 신중한 모니터링을 수행해야 한다. 인간 세포에 노출된 물질을 폐기할 때 제도적 지침을 따르십시오. 4. HSC 정렬 불소-공주 항체로 세포를 라벨. 염색 버퍼 50 μL과 안티 CD34-FITC의 10 μL, 안티 CD38-PerCP-Cy5.5의 2 μL, 안티 CD90-PE-Cy7의 5 μL, 및 안티 CD45RA-PE의 10 μL을 혼합합니다. 항체 혼합물에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 어둠 속에서 4 °C에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오. 항체를 세척하기 위해 염색 버퍼 1mL를 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 340 × g의 튜브를 원심분리합니다. 상부체를 폐기합니다. 염색 버퍼 + 0.1% 프로디듐 요오드의 0.5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 서스펜션을 40 μm 필터를 사용하여 5mL 튜브로 전송합니다. PI 내에서 페노티픽HSC를게이트 – CD34+CD38-CD90+CD45RA- FACS Aria-IIIu를 사용하여 분획과 배양 매체의 500 μL로 채워진 1.5 mL 튜브로 세포를 정렬(그림 3). 도 3에도시된 게이팅 전략을 사용하여 CD34+ 세포의 ~10%는 phenotypic HSC가 될 것으로 예상됩니다.참고: 게이팅 전략은 건강한개인(17)으로부터 CD34+CD38-분획에서 계보 마커 염색을 생략하면서 이전에 설명된 바와 같이 수행된다. 원심 분리기는 4°C에서 5분 동안 340 × g에서 정렬된 세포를 원심분리하고 상체를 폐기한다. 펠릿이 그대로 유지되도록 슈퍼네티드를 조심스럽게 흡인합니다. 정렬된 셀을 배양할 때까지 얼음 위에 보관합니다.참고: 스펙트럼 중복의 형광 보정은 첫 번째 실험 중에 수행해야 합니다. 5. 세포 배양 2단계에서 제조된 사이토카인을 함유한 배양 매체의 200 μL을 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮긴다. 매체의 증발을 피하려면 사용되지 않는 모든 우물을 PBS100-200 μL로 채웁니다. 60 세포 /μL에서 사이토카인없이 배양 매체에서 정렬 된 HSC를 다시 중단합니다. 각 우물에 알리쿼트 600 HSC/웰(셀 서스펜션 10μL). 셀 번호를 변경할 수 있습니다. 300개 미만의 세포는 더 큰 기술적 변화로 이어질 것이고, 따라서 조건당 더 많은 우물이 생물학적 차이를 검출하는 데 필요합니다. 단일 우물에서 1000 개 이상의 세포를 배양하는 것은 사이토카인 / 영양 부족 또는 불리한 사이토카인 / 케모킨의 축적으로 인해 피해야합니다. 5% CO2 및 1% O2 대기에서 37°C에서 가습된 다중 가스 인큐베이터에서 세포를 배양한다. 7일 간 문화의 경우 3~4일마다 미디어 볼륨의 절반을 교체하는 것이 좋습니다. 조심스럽게 파이프팅하여 미디어의 100 μL을 흡인하고 각 우물에 사이토카인을 포함하는 새로 준비 된 문화 매체의 100 μL을 추가합니다. 문화 매체는 37°C에서 미리 데워져야 합니다. 6. 유동 세포형을 이용한 마커 표현형 분석 참고: 7일간의 배양 후에 세포를 분석해야 하지만 배양 기간을 변경할 수 있습니다. 8채널 파이펫을 사용하여 170 μL의 매체를 폐기하십시오. 항체 혼합물로 세포를 라벨로 지정합니다. 안티 CD34-FITC의 0.5 μL, 안티 CD38-PerCP-Cy5.5의 0.1 μL, 안티 CD90-PE-Cy7의 0.25 μL, 안티 CD45RA-PE의 0.5 μL, 그리고 잘 당 얼룩 버퍼의 9 μL을 혼합한다. 혼합물의 10 μL을 96웰 플레이트에 넣고 어둠 속에서 4°C에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 항체를 세척하려면, 낮은 가속 및 중간 감속을 사용하여 400 × g에서 플레이트에 스테인딩 버퍼 100 μL을 추가하고 원심분리기를 400 × g로 첨가한다. 조심스럽게 우물의 바닥에 세포를 유지하기 위해 상체의 100 μL을 흡인 한 다음, 염색 버퍼 + 0.1 % v / v의 200 μL에서 세포를 재중단 + 1 % v/ v의 PI + 1 % v / v형 마이크로 스피어 (예 : 흐름 검사 플루오로스스). 유동 세포측정기 설정. 100 μL의 혼합 샘플 모드와 섭취 볼륨을 사용하여 빠른 모드에서 샘플에 대한 데이터를 수집합니다. FCS 형식으로 데이터를 내보내고 FlowJo와 같은 소프트웨어를 사용하여 분석합니다. 세포 수는 형광 마이크로스피어 비드 수를 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 연구원이 우물당 2000개의 구슬을 추가하고 비드 수가 700개인 경우 각 분획의 세포 수를 2000/700으로 곱하여 우물의 분획의 총 세포 수를 추정합니다.참고: 형광 마이크로스피어는 포름알데히드의 존재 때문에 배양된 세포에 독성이 있다. 이 분석 하는 동안 세포 죽음을 유도할 수 있습니다. 편견을 피하기 위해 지속적으로 분석된 우물(<50웰)의 수를 최소화합니다. 7. 인간 HSC의 이식 참고: 배양된 세포의 재인구 활성은 면역결핍마우스에 이식하여 검증된다. 모든 절차는 동물 실험 위원회 또는 해당 절차에 의해 승인되어야 합니다. 기증자로서, 8-12주 면역절제 NOD-SCID-Il2rg-null(NOG) 마우스의 충분한 수를 준비한다. NOG 마우스는 감염에 매우 취약하기 때문에 사육 케이지를 가능한 한 깨끗하게 유지하고 살균 된 식단과 물로 마우스를 공급하십시오. 5단계에서 설명된 바와 같이 이식을 위한 충분한 수의 HSC를 배양한다. 예를 들어, 5000 HSC(0일 상당)가 6명의 수혜자 마우스에 이식될 때, 96웰 플레이트(웰당 문화매체 200μL) 또는 24웰 플레이트(웰당 문화미디어 1mL)의 8웰에서 40개의 우물에서 문화35,000-40,000 HsC를 배양한다. 반미디어로 2주 동안 의전을 맺은 세포는 37°C에서 가습된 다중 가스 인큐베이터에서 3-4일마다 변화하며, 5%의 CO 2 및 1%O2를 갖는다. 문화권 지속 시간을 변경할 수 있습니다. 이식 전 6-24h에서 2.5 Gy에서 NOG 마우스를 조사한다. 1.5mL 튜브에서 배양 된 HSC를 수집합니다. 4°C에서 5분 동안 340 ×g의 튜브원심분리기. 200 μL당 5000 HSC(일0 상당)의 세포 밀도에서 멸균 얼음-차가운 염색 버퍼에서 수퍼나츠를 조심스럽게 흡인시키고 세포를 재중단합니다. 염색 버퍼를 소독하려면 0.22 μm 필터를 사용하여 필터링합니다. 이식하기 전에 세보플루란 또는 이소플루란 흡입으로 마우스를 마취시킵니다. 배양된 HSC(일00)를 이식하려면, 1mL 주사기 및 27게이지 바늘을 사용하여 7.1 단계에서 조사된 NOG 마우스의 꼬리 정맥 또는 레트로 궤도 부비동에 세포 현탁액의 200 μL을 주입한다. 새로 분리되거나 해동된 골수 HSC는 대조군으로 이식될 수 있다. 장갑은 각 절차 사이에 70 % v / v 에탄올로 살균해야합니다. 8. 말초 혈액에서 인간 유래 세포의 주파수 분석 인간 세포의 재수를 검사하기 위하여는, 이식 후에 1, 2 및 3 달에 말초 혈액을 수집합니다. 말초 혈액을 수집하기 전에 세보플루란 흡입으로 마우스를 마취시킵니다. 고원화 유리 모세관 튜브를 사용하여 복고풍 궤도 부비동에서 말초 혈액의 40-80 μL을 수집하고 1.5 mL 튜브에서 PBS + 헤파린 (1 U / mL)의 1 mL에서이 샘플을 일시 중단합니다. 4°C에서 3분 동안 340 × g의 혈액 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 버리고 실온에서 45 분 동안 PBS + 1.2 % w / v dextran (200 kDa)의 1 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다. 3 분 동안 340 × g에서 다른 1.5 mL 튜브 및 원심 분리기로 상체를 전송합니다. 적혈구 용해의 경우, 5 분 동안 0.17 M NH4Cl에서 세포를 다시 중단하십시오. 4°C에서 3분 동안 세포 현탁액 340 × g원심분리기. 항 마우스 Fc 블록의 0.3 μL을 포함하는 염색 버퍼의 50 μL에서 세포를 다시 중단합니다. 이 샘플을 4°C에서 5분 동안 배양합니다. 표면 마커 염색을 위해 다음 항체를 추가하십시오: 마우스 CD45-PE-Cy7의 0.3 μL, 0.3 μL 마우스 Ter-119-PE-Cy7, 인간 CD45-BV421의 0.3 μL, 인간 CD13-PE의 0.3 μL, 인간 CD33-PE의 1.2 μL, 인간 CD19-APC의 0.3 μL, 인간 CD3-APC-Cy7의 0.3 μL. 세포를 4°C에서 15분 동안 배양합니다. 염색 버퍼와 원심분리기 1mL로 한 번 340 × g에서 4°C에서 5분 간 세척하십시오. 상체를 버리고 염색 버퍼 + 0.1 % v /v의 PI의 200 μL에서 셀을 다시 중단하십시오. 셀 서스펜션을 96웰의 평평한 바닥 플레이트로 전송하고 혼합 샘플 모드와 100 μL의 섭취 량으로 빠른 모드에서 유동 사이토미터를 사용하여 데이터를 수집합니다. FlowJo와 같은 소프트웨어를 사용하여 분석을 위해 FCS 형식으로 데이터를 내보냅니다. 유동 세포계를 설정합니다. 믹스 샘플 모드와 100 μL의 섭취 량으로 빠른 모드에서 샘플에 대한 데이터를 수집합니다. FlowJo와 같은 소프트웨어를 사용하여 분석을 위해 FCS 형식으로 데이터를 내보냅니다.