JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
italiano

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Modellazione agli elementi finiti di un microambiente elettrico cellulare

Published: May 18, 2021
doi:
10.3791/61928
, , , ,
1Department of Materials, Faculty of Science and Engineering,The University of Manchester, 2Department of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, Faculty of Science and Engineering,The University of Manchester, 3The Henry Royce Institute, Royce Hub Building,The University of Manchester

Summary

Questo documento presenta una strategia per la costruzione di modelli agli elementi finiti di materiali conduttivi fibrosi esposti a un campo elettrico (EF). I modelli possono essere utilizzati per stimare l’input elettrico che le cellule seminate in tali materiali ricevono e valutare l’impatto della modifica delle proprietà, della struttura o dell’orientamento del materiale costitutivo dell’impalcatura.

Abstract

Studi clinici dimostrano che la stimolazione elettrica (ES) è una potenziale terapia per la guarigione e la rigenerazione di vari tessuti. Comprendere i meccanismi di risposta cellulare quando esposti a campi elettrici può quindi guidare l’ottimizzazione delle applicazioni cliniche. Gli esperimenti in vitro mirano ad aiutare a scoprirli, offrendo il vantaggio di intervalli di input e output più ampi che possono essere valutati eticamente ed efficacemente. Tuttavia, i progressi negli esperimenti in vitro sono difficili da riprodurre direttamente in contesti clinici. Principalmente, ciò è dovuto al fatto che i dispositivi ES utilizzati in vitro differiscono significativamente da quelli adatti all’uso da parte del paziente e il percorso dagli elettrodi alle cellule bersaglio è diverso. Tradurre i risultati in vitro in procedure in vivo non è quindi semplice. Sottolineiamo che la struttura e le proprietà fisiche del microambiente cellulare svolgono un ruolo determinante nelle effettive condizioni di test sperimentali e suggeriamo che le misure di distribuzione della carica possono essere utilizzate per colmare il divario tra in vitro e in vivo. Considerando questo, mostriamo come la modellazione agli elementi finiti (FEM) in silico possa essere utilizzata per descrivere il microambiente cellulare e i cambiamenti generati dall’esposizione al campo elettrico (EF). Evidenziamo come l’EF si accoppia con la struttura geometrica per determinare la distribuzione della carica. Mostriamo quindi l’impatto degli input dipendenti dal tempo sul movimento della carica. Infine, dimostriamo la rilevanza della nostra nuova metodologia modello in silico utilizzando due casi di studio: (i) scaffold in vitro fibroso Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) e (ii) collagene in vivo in matrice extracellulare (ECM).

Introduction

ES è l’uso di EF con l’obiettivo di controllare cellule e tessuti biologici. Il suo meccanismo si basa sullo stimolo fisico trasdotto alla cellula quando le biomolecole all’interno e intorno ad essa sono esposte a un gradiente di tensione generato esternamente. Le particelle cariche sono impegnate in un moto organizzato governato dalla legge di Coulomb, generando forze di trascinamento sulle particelle non cariche. Il flusso di fluido risultante e la distribuzione della carica alterano le attività e le funzioni cellulari come adesione, contrazione, migrazione, orientamento, differenziazione e proliferazione1 mentre la cellula tenta di adattarsi al cambiamento delle condizioni microambiente.

Poiché gli EF sono controllabili, non invasivi, non farmacologici e hanno dimostrato di avere un impatto efficace sul comportamento cellulare essenziale, l’ES è uno strumento prezioso per l’ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa. È stato utilizzato con successo per guidare lo sviluppo neurale2,scheletrico3,muscolo cardiaco4,osso5 e pelle6. Inoltre, poiché migliora la ionoforesi7, viene utilizzato come trattamento alternativo o complementare a quelli farmacologici convenzionali. La sua efficienza nella gestione del dolore è ancora dibattuto in quanto si attendono studi clinici di qualità superiore8,9,10. Tuttavia, non sono stati segnalati effetti avversi e ha il potenziale per migliorare il benessere deipazienti 11,12,13,14,15.

Mentre solo gli studi clinici possono dare un verdetto definitivo per l’efficacia di una procedura, i modelli in vitro e in silico sono tenuti a informare la progettazione di un trattamento ES prevedibile in quanto offrono un controllo più forte su una gamma più ampia di condizioni sperimentali. Gli usi clinici studiati di ES sono la rigenerazione ossea16,17,il recupero dei muscoli denervati18,19,la rigenerazione assonale dopo l’intervento chirurgico20,21,il sollievo dal dolore22,la guarigione delleferite 23,24,25 e la somministrazione di farmaci ionoforetici26. Affinché i dispositivi ES siano ampiamente introdotti su tutte le possibili applicazioni target, gli studi clinici devono ancora stabilire prove più forti per un trattamento efficiente. Anche in settori in cui sia gli studi in vivo sugli animali che sull’uomo riportano costantemente risultati positivi, il gran numero di metodi segnalati insieme a una guida troppo scarsa su come scegliere tra loro e l’alto prezzo di acquisizione scoraggia i medici dall’investire in dispositivi ES27. Per ovviare a questo, il tessuto bersaglio non può più essere trattato come una scatola nera (limite degli esperimenti in vivo) ma deve essere visto come una complessa sinergia di più sottosistemi (Figura 1).

Molteplici esperimenti ES sono stati condotti in vitro nel corso degli anni28,29,30,31,32,33,34. La maggior parte di questi caratterizza l’ES solo attraverso la caduta di tensione tra gli elettrodi divisa per la distanza tra loro – un’approssimazione approssimativa della grandezza del campo elettrico. Tuttavia, il campo elettrico stesso influenza solo le particelle cariche, non direttamente le cellule. Inoltre, quando più materiali sono interposti tra il dispositivo e le celle, l’approssimazione approssimativa potrebbe non reggere.

Una migliore caratterizzazione del segnale di ingresso richiede una visione chiara di come lo stimolo viene trasdotto alla cellula. I principali metodi di erogazione di ES sono l’accoppiamento diretto, capacitivo e induttivo35,36. I dispositivi per ciascun metodo differiscono per tipo di elettrodo (asta, planare o avvolgimento) e posizionamento rispetto al tessuto bersaglio (a contatto o isolato)35. I dispositivi utilizzati in vivo per trattamenti più lunghi devono essere indossabili, quindi gli elettrodi e la maggior parte delle volte la fonte di energia vengono impiantati o attaccati alla pelle come medicazioni per ferite o cerotti elettroattivi. Il gradiente di tensione generato sposta le particelle cariche nell’area di trattamento.

Poiché influisce sul flusso di particelle cariche risultante nelle vicinanze delle celle, la struttura dell’impalcatura è della massima importanza nella progettazione dei protocolli ES. Diverse configurazioni di trasporto della carica si verificano se il materiale della piattaforma, la tecnica di sintesi, la struttura o l’orientamento rispetto al gradiente di tensione cambiano. In vivo, la disponibilità e il movimento delle particelle cariche è influenzato non solo dalle cellule, ma anche dalla rete di collagene e dal fluido interstiziale che compone l’ECM di supporto. Gli scaffold ingegnerizzati sono sempre più utilizzati per ricreare al meglio i microambiente cellulari naturali in vitro1,35. Allo stesso tempo, l’ECM è un’impalcatura naturale complessa.

Gli scaffold artificiali sono a base di metalli, polimeri conduttori e carbonio, progettati con particolare attenzione al bilanciamento della biocompatibilità con le prestazioni elettrochimiche e la stabilità a lungo termine36. Un tipo di impalcatura versatile è il tappetino fibroso elettrofilato che offre una topografia su scala nanometrica controllabile. Questo può essere progettato per assomigliare all’ECM, fornendo così segnali meccanici simili che aiutano la rigenerazione di una vasta gamma di tessuti37. Per avere un impatto significativo su ES, i tappetini devono essere conduttivi in una certa misura. Tuttavia, i polimeri conduttivi sono difficili da elettrofilare e la miscelazione con supporti isolanti limita la conduttività delle fibre risultanti38. Una soluzione è la polimerizzazione di un monomero conduttivo sulla superficie di una fibra dielettrica, con conseguente buona resistenza meccanica e proprietà elettriche del prodotto finale38. Un esempio è il rivestimento di fibre elettrodrosse di seta con il semiconduttivo PEDOT-PSS39. La combinazione di segnali meccanici ed elettromagnetici accelera significativamente la crescita dei neuriti40,41,42. I neuriti seguono l’allineamento delle fibre degli scaffold e si allungano di più dopo l’esposizione a un EF parallelo alle fibre che a uno verticale43. Allo stesso modo, l’allineamento degli scaffold fibrosi all’EF promuove anche la maturazione miogenica33.

L’ECM è composto principalmente da proteine fibrose44, tra quelle di collagene di tipo I che sono il principale costituente in tutti i tessuti animali ad eccezione della cartilagine (ricca di collagene di tipo II)44. Il tropocollageno (TC), tripla conformazione elicoidale dei fili polipeptidici, è il motivo strutturale delle fibrille di collagene45. Le immagini al microscopio elettronico a trasmissione e alla microscopia a forza atomica delle fibrille di collagene mostrano un modello a bande D-periodico46 spiegato dal modello47 di Hodge & Petruska come matrici regolari di lacune TC e sovrapposizioni45. I tendini sono composti da una matrice fibrillare collagenosa allineata schermata da una matrice proteoglicanica altamente idrofila non collagenosa48,49. Decorin è un piccolo proteoglicano ricco di leucina (SLRP) in grado di legare le regioni gap delle fibrille di collagene e connettersi con altre SLLP attraverso le loro catene laterali glicosaminoglicano (GAG)49. Studi condotti sui tendini mostrano che le loro proprietà elettriche cambiano significativamente quando idratati50,51,meccanismo di trasporto della carica che cambia da protonico a ionico quando il livello di idratazione aumenta51. Ciò suggerisce che la conduzione elettrica lungo una fibrilla di collagene di tipo I potrebbe essere abilitata da un rivestimento Decorin-acqua, con regioni gap e sovrapposte con diverse conduttività elettriche e costanti dielettriche.

Poiché la ricreazione identica dell’ECM da parte di scaffold artificiali è improbabile, la sinergia che produce conoscenze tra in vivo e in vitro abilitata da risultati traducibili sembra essere in un vicolo cieco. La modellazione in silico non solo consente la traduzione tra i due, ma aggiunge anche importanti vantaggi nel caratterizzare i processi sconosciuti coinvolti nell’ES. Il confronto delle osservazioni in vivo con quelle in vitro può portare informazioni sulla forza di accoppiamento tra il tessuto bersaglio e il resto dell’organismo, ma non rivela gli attuali limiti di conoscenza. L’ignoto può essere esposto osservando la differenza tra ciò che ci si aspetta che accada in base alle conoscenze attuali e ciò che accade. Esperimenti in silico basati sulla modellizzazione matematica consentono di suddividere il processo in sottoprocessi noti e sconosciuti. In questo modo, i fenomeni non contabilizzato nel modello vengono alla luce quando le previsioni in silico vengono confrontate con esperimenti in vitro e in vivo.

La formazione e la verifica di ipotesi riguardanti i meccanismi sottostanti di come le cellule e i tessuti sono influenzati dai campi elettrici è ostacolata dal gran numero di parametri52 che devono essere testati separatamente. Per definire condizioni sperimentali rappresentative, il processo ES deve essere suddiviso in sottoprocessi (Figura 1) e devono essere identificati i segnali di ingresso dominanti che influenzano il comportamento delle cellule. I modelli che rappresentano gli effetti fisici fondamentali di ES sulle cellule descrivono il dominio che accoppia l’EF con la cella – quello delle particelle cariche53. Il comportamento delle particelle esterne alla cellula dipende dal microambiente e può essere studiato separatamente dalla cellula. Il segnale di ingresso dominante per la cella è il sottoinsieme delle uscite del dispositivo ES che causa il maggior grado di variabilità nella risposta cellulare. Il sottoinsieme più piccolo dei parametri sperimentali completi in grado di generare variazioni in tutti i segnali di ingresso delle celle dominanti può essere utilizzato per ridurre la dimensione dello spazio dei parametri e il numero di casi di test.

L’input del modello target biologico ES deve essere un sottoinsieme dei segnali di uscita prodotti dal dispositivo ES che sono utili per descrivere gli effetti fisici di ES sulle cellule. Un semplice bioreattore ad accoppiamento diretto ha la stessa struttura delle celle elettrochimiche elettrolitiche. I modelli di questi mostrano la distribuzione della densità di corrente primaria (che tiene conto della resistenza della soluzione), secondaria (che tiene conto anche delle reazioni faradiche) o terziaria (che tiene conto anche della diffusione degli ioni). Poiché la complessità si traduce in costi computazionali, il modello più semplice è più adatto per le esplorazioni spaziali dei parametri. Le simulazioni di compositi fibrosi motivate dalle proprietà dei materiali54 si concentrano sulle proprietà dei materiali sfusi come risultato di una complessa micro-architettura, quindi non possono descrivere gli effetti locali dell’esposizione ai raggi EF. I modelli esistenti in silico, motivati da ES, si concentrano sul campione biologico, sia esso una singola cellula immersa in un mezzo omogeneo55,56,57,o tessuti complessi con spazio extracellulare omogeneo58. La densità di carica e di corrente (Figura 2) può fungere da segnali di interfaccia tra i modelli del dispositivo ES e il campione biologico o tra diversi componenti del dispositivo ES. Il protocollo basato su FEM proposto utilizza le equazioni descritte nella Figura 2 ed è stato utilizzato per studiare come i parametri dipendenti dallo scaffold possono essere utilizzati per modulare questi due segnali, indipendentemente dall’EF generato da una configurazione di accoppiamento diretto. I risultati sottolineano che è necessario tenere conto delle proprietà elettriche dell’impalcatura o dell’ECM quando si studia come eS influisce sulle cellule bersaglio.

Protocol

1. Costruisci il modello in COMSOL Aprite COMSOL e selezionate Modello vuoto (Blank Model). Parametri: In Model Builder, fare clic con il pulsante destro del mouse su Definizioni globali, selezionare Parametrie aggiungere parametri in base alla Tabella 1. Materiali: Aggiungere materiali con proprietà secondo la Tabella 2. In Generatore di modelli in Definizioni globali, fate clic con il pulsante destro del mouse su Materiale (Material) e selezionate Materiale vuoto (Blank Material). Aggiungi proprietà materiale: nelle impostazioni del materiale appena aggiunto, espandere Proprietà materiale > Proprietà di base, selezionare Permittività relativa e premere il simbolo ‘+’ per aggiungere proprietà. Ripetete il passaggio per Conducibilità elettrica. Nel contenuto del materiale, compilare le proprietà correnti del materiale secondo la tabella 2. Definizione componente: nella scheda Home della barra multifunzione in alto, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Aggiungi componente e selezionare 3D. Un nuovo nodo componente verrà visualizzato in Model Builder. Geometria: nel Generatore di modelli, fare clic con il pulsante destro del mouse su Geometria, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Inserisci, fare doppio clic sul modello completo e selezionare la sequenza appropriata (SC / SNC / RC / RNC / RNCd). In alternativa, costruite la geometria da zero seguendo i passaggi subordinati.In Generatore modelli ( Model Builder), fate clic con il pulsante sinistro del mouse su Geometria (Geometry) sotto il nodo del componente corrente. Lo stesso nodo Geometria verrà indicato nei seguenti passaggi subordinati. Nella finestra Impostazioni, modificare l’unità Lunghezza in nm e assicurarsi che “Scala valori quando si cambia unità” sia deselezionato. Geometria dell’impalcatura Nel Model Builder, fare clic con il pulsante destro del mouse su Geometria e selezionare Blocca. Nella scheda Impostazioni, inserisci l’etichetta “Estensioni impalcatura”. Espandi Dimensioni e Forma e compila “Ws”, “Ls”, “Hs” per Larghezza, Profondità e Altezza. Espandete Posizione e impostate La base su Centro. Espandere Selezioni di entità risultanti, selezionare Nuovo e aggiungere “Selezione impalcatura”. Estensioni della sostanza circostante: in Model Builder, in Geometria, fare clic con il pulsante destro del mouse su Estensioni impalcatura e selezionare Duplicae quindi modificare la scheda Impostazioni. Modificare l’etichetta in “Estensioni multimediali”. Per ogni casella nella sezione Size e Shape, aggiungi “med_ratio *” prima del parametro esistente. Nelle selezioni delle entità risultanti, aggiungere Nuova selezione come “Selezione multimediale”. Geometria di una fibra (SC passa alla 1.6.6)Core (RC passa a 1.6.4.2) In Generatore modelli ,fate clic con il pulsante destro del mouse su Geometria ( Geometry) , selezionate Cilindro ( Cylinder) e modificate la scheda Impostazioni (Settings) come segue. Cambia l’etichetta in “Core”. Espandi Dimensioni e Forma e compila “Rc” e “Lf” per Raggio e Altezza. Espandere Posizione e inserire “-excess*Ws/2” e “-Lf/2” per x e y. Espandete Asse (Axis) e impostate il tipo di asse in asse y. Espandere Selezioni di entità risultanti e aggiungere “Selezione principale”. Cappotto (SNC salta a 1.6.5) Lastra (RC o RNC passare a 1.6.4.2.2; RNCd passare a 1.6.4.2.3) In Generatore modelli in Geometria ( Geometry) , fate clic con il pulsante destro del mouse su Estensioni scaffold (Scaffold extents) e selezionate Duplica (Duplicate). Assicuratevi che il duplicato (Estensioni Scaffold 1) venga subito dopo Core nella sequenza geometrica. Nella scheda Impostazioni, cambia l’etichetta in “Cappotto”. Nella scheda Impostazioni, espandere Selezioni di entità risultanti e creare “Selezione fibra”. Passare alla 1.6.5. Omogeneo Nel Generatore modelli (Model Builder) fate clic con il pulsante destro del mouse su Geometria (Geometry)e selezionate Cilindro (Cylinder) e modificate la relativa scheda Impostazioni (Settings) come segue. Cambia l’etichetta in “Cappotto”. Espandi Dimensioni e Forma e compila “Rf” e “Lf” per Raggio e Altezza. Espandere Posizione e inserire “-excess*Ws/2” e “-Lf/2” per x e y. Espandete Asse (Axis) e cambiate il tipo di asse in asse y (RC salta a 1.6.4.2.2.7). Espandi Livelli, compila “Rf-Rc” per Spessore e lascia solo “Strati sul lato” selezionata. Espandere Selezioni di entità risultanti e aggiungere “Selezione cappotto” o, per RC, “Selezione fibra” (RC passare a 1.6.5). In Generatore di modelli , fateclic con il pulsante destro del mouse su Geometria (Geometry) e selezionate Elimina entità (Delete Entities). Nella scheda Impostazioni, modificare Livello base geometrico in Dominio e scegliere Selezione cappotto per selezione. Rimuovere tutti i domini tranne il dominio 3 dalla casella di selezione (il nucleo del cilindro a più livelli). Espandete Selezioni di entità risultanti e selezionate Selezione cappotto (Coat Selection). Passare alla 1.6.5. Matrice periodica di due tipi In Model Builder , fateclic con il pulsante destro del mouse su Geometria (Geometry) e selezionate Cilindro (Cylinder). Fare clic con il pulsante destro del mouse sull’elemento appena creato e selezionare Duplica. Modifica la scheda Impostazioni come segue. Impostare Label su “Coat 1” / “Coat 2”. Impostare il raggio su Rf. Impostare l’altezza su “D*prop”/”D*(1-prop)”. Espandi la posizione e compila “-excess*Ws/2” sia per x che per “-Lf/2″/”-Lf/2+D*prop” su y. Espandete Asse (Axis) e impostate il tipo di asse in asse y. Espandi la sezione Livelli e compila “Rf-Rc”; Assicurati che sia selezionata solo la casella “Livelli sul lato”. Espandere Selezioni delle entità risultanti e creare “Selezione coat 1″/ “Selezione cappotto 2”. In Generatore di modelli , fateclic con il pulsante destro del mouse su Geometria (Geometry) e selezionate Elimina entità (Delete Entities). Nella scheda Impostazioni, impostate Livello base geometrico in Dominio e selezionate il cilindro 2 (cyl2) e il cilindro 3 (cyl3) dall’area grafica. Rimuovere tutti i domini tranne il dominio 3 dalla casella di selezione (il nucleo dei cilindri a strati). Espandete Selezioni di entità risultanti e create Selezione cappotto. In Model Builder ,fare clic con il pulsante destro del mouse su Geometria, espandere Trasforma e selezionare Matrice. Modifica la scheda Impostazioni come segue. Selezionare “Selezione cappotto” per gli oggetti di input. Impostare Tipo matrice su Lineare. Impostare Dimensioni su “Lf/D”. Impostare Spostamento sull’asse y su “D”. Geometria di un array di fibre orientato Core Array (RC passa a 1.6.5.2) In Model Builder ,fate clic con il pulsante destro del mouse su Geometria( Geometry ) , Espandi trasforma (Expand Transforms) e selezionate Ruota (Rotate). Nella scheda Impostazioni, attivare lo switch Oggetti input e selezionare Selezione core dall’elenco a discesa. Assicurarsi che la casella Mantieni oggetti di input non sia selezionata. Espandi Angolo di rotazione e compila “theta” per Rotazione. Espandere Selezioni di entità risultanti e creare “Selezione fibra”. In Generatore modelli fare clic con il pulsante destro del mouse su Geometria, Espandi trasforma e selezionare Matrice. Cambia l’etichetta in “Core Array”. Selezionare Selezione core nell’elenco a discesa per oggetti di input. Espandi Dimensione, cambia Tipo matrice in Lineare e compila “n_1*(theta45)” per Dimensione. Espandi Spostamento e inserisci “2*tes*Rc*cos(theta)”, “2*tes*Rc*sin(theta)” per x e y. Espandere Selezioni di entità risultanti e selezionare “Selezione fibra”. Coat Array (SNC passa alla 1.6.5.3) In Model Builder ,fate clic con il pulsante destro del mouse su Geometria( Geometry ) , Espandi trasforma (Expand Transforms) e selezionate Ruota (Rotate). Nella scheda Impostazioni attivare l’opzione Oggetti di input e selezionare Selezione cappotto dall’elenco a discesa. Assicurati che “Mantieni la casella degli oggetti di input” non sia selezionata. Espandi Angolo di rotazione e compila “theta” per Rotazione. Espandere Selezioni di entità risultanti e selezionare “Selezione fibra”. In Model Builder ,fare clic con il pulsante destro del mouse su Geometria, Espandi trasforma e selezionare Matrice. Cambia l’etichetta in “Coat Array”. Selezionare Selezione cappotto nell’elenco a discesa per oggetti di input. Espandi Dimensione, cambia Tipo matrice in Lineare e compila “n_1*(theta45)” per Dimensione. Espandi Spostamento e inserisci “2*tes*Rc*cos(theta)”, “2*tes*Rc*sin(theta)” per x e y. Espandere Selezioni di entità risultanti e selezionare “Selezione fibra”. Ponteggio tagliato Unisci fibre: in Generatore modelli fare clic con il pulsante destro del mouse su Geometria, Espandi booleani e partizioni e selezionare Unione. Cambia l’etichetta in “Fibre”. Attivare l’interruttore Oggetti di input e selezionare Selezione fibra dall’elenco a discesa. Assicurati che la casella “Mantieni oggetti di input” non sia selezionata. Assicurati che “Mantieni i confini interni” sia selezionata. Espandete Selezioni di entità risultanti e selezionate Selezione impalcatura dall’elenco a discesa. Esegui taglio: in Generatore modelli fare clic con il pulsante destro del mouse su Geometria, espandere Booleani e partizioni e selezionare Intersezione. Cambia l’etichetta in “Scaffold”. Attivare l’opzione Oggetti input e selezionare Selezione scaffold dall’elenco a discesa. Assicurati che la casella “Mantieni oggetti di input” non sia selezionata. Assicurati che “Mantieni i confini interni” sia selezionata. Geometria dell’insieme Definire la geometria della sostanza circostante. In Model Builder ,fare clic con il pulsante destro del mouse su Geometria, espandere Booleani e partizioni e selezionare Differenza. Passare alla scheda Impostazioni. Nell’elenco a discesa Oggetti da aggiungere selezionare Selezione multimediale. Nell’elenco a discesa Oggetti da sottrarre selezionare Selezione impalcatura. Assicurati che le caselle “Mantieni oggetti di input” e “Mantieni confini interni” siano entrambe selezionate. Elimina la casella Estensioni multimediali. In Generatore modelli , fateclic con il pulsante destro del mouse su Geometria (Geometry) e selezionate Elimina entità (Delete entities). Passare alla scheda Impostazioni. Selezionare Dominio dall’elenco a discesa Livello di ingresso Geometrico. Selezionare Selezione file multimediali dall’elenco a discesa Selezione. Rimuovere “dif1” dalla casella di selezione. Costruisci la geometria Nel nodo Geometria, assicuratevi che l’ultimo elemento prima del nodo Selezioni cumulative sia Unione forma e non Assieme modulo. Se necessario, fare clic con il pulsante destro del mouse su Assemblaggio modulo e modificare Azione in “Forma unione” nella scheda Impostazioni. In Generatore di modelli, fate clic con il pulsante sinistro del mouse su Geometria (Geometry) e selezionate Crea tutto (Build All). Materiali In Model Builder sotto il nodo Componente corrente, fate clic con il pulsante destro del mouse su Materiali (Materials) e selezionate Collegamento materiale (Material Link). Ripetere la sezione cinque volte per tutte le volte in cui vengono considerati molti materiali in base al livello di complessità. Associare i materiali per ciascun componente nel seguente ordine: sostanza circostante, cappotti, anime. Nella scheda Impostazioni, scegliere Media/Scaffold (per SC, SNC, RC)/Coat/Core Selection dall’elenco a discesa Selezione. Espandere le impostazioni di collegamento e scegliere il materiale appropriato dall’elenco a discesa. Mesh In Model Builder ,fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul nodo Mesh sotto il componente corrente. Nella scheda Impostazioni, selezionare Normale dall’elenco a discesa Dimensione elemento e fare clic con il pulsantesinistro del mouse su Crea tutto . Fisica: in Model Builder, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul componente corrente, selezionare Aggiungi fisica, espandere il modulo AC/DC nella scheda Aggiungi fisica, selezionare il modulo Correnti elettriche (ec) e fare clic su Aggiungi al componente. Condizioni al contorno: nella scheda Grafica, selezionate la vista xy. Ground: In Model Builder, fare clic con il pulsante destro del mouse sul nodo Correnti elettriche e selezionare Terra. Assicuratevi che l’interruttore di selezione per la selezione del limite sia attivo e fate clic con il pulsante sinistro del mouse sulla faccia della sostanza circostante più alta parallela al piano xz per aggiungere il limite 5 nella casella selezione limite. Terminale: Nel Model Builder,fare clic con il pulsante destro del mouse sul nodo Correnti elettriche e selezionare Terminale. Assicurarsi che l’interruttore di selezione per la selezione del limite sia attivo e fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla faccia della sostanza circostante più bassa parallela al piano xz per aggiungere il limite 2 nella casella selezione limite. Espandere la sezione Terminale e selezionare Tensione nell’elenco a discesa Tipo di terminale; compilare V0 per Tensione. Aggiungere complessità se necessario: salvare il componente corrente e tornare al passaggio 1.4 per seguire un altro percorso di complessità (SC/SNC/RC/RNC/RNCd). 2. Esegui la simulazione Perfezionamento adattivo della mesh In Model Builder, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul nodo radice del modello e selezionare Aggiungi studio per aprire la scheda Aggiungi studio, selezionare Studio stazionario e fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante Aggiungi studio. Creare un passaggio di studio per ogni componente creato: in Nodo studio fare clic con il pulsante destro del mouse su Passo1: Studio stazionario e selezionare Duplica. Per ogni fase di studio modificare la scheda delle impostazioni con i dettagli del componente corrispondente. Espandere la selezione di fisica e variabili; nella colonna Risolvi per lasciare selezionata solo la componente corrente. Espandi Estensioni di studio e seleziona la casella di perfezionamento della mesh adattiva. Selezionate la geometria del componente corrente dall’elenco a discesa accanto a Adattamento in geometria. In Model Builder fare clic con il pulsante destro del mouse su Studio 1 e selezionare Calcola. Ciò genererà mesh adattate per tutte le geometrie dei componenti con il loro angolo di orientamento corrente. Impostare l’angolo di orientamento ed eseguire uno studio stazionario. In Generatore modelli, in Definizioni globali, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Parametri e modificare il parametro theta con l’angolo di orientamento della fibra desiderato per la simulazione. Per ogni componente, in Model Builder espandere il nodo del componente, fare clic con il pulsante destro del mouse su Geometria e selezionare Costruisci tutto. In Model Builder, fate clic con il pulsante destro del mouse sullo studio di perfezionamento della mesh adattiva e selezionate Calcola. In Model Builder fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul nodo radice del modello e selezionare Aggiungi studio per aprire la scheda Aggiungi studio, selezionare Studio stazionario e fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante Aggiungi studio. In Model Builder, sotto lo studio appena aggiunto, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Passaggio 1, espandere la selezione mesh e, per ogni componente, selezionare le mesh generate nello studio di perfezionamento adattivo della mesh. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante Calcola. Imposta l’angolo di orientamento, il segnale di ingresso ed esegui lo studio dipendente dal tempo. In Generatore modelli, in Definizioni globali, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Parametri e modificare il parametro theta con l’angolo di orientamento della fibra desiderato per la simulazione. In Model Builder, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul nodo radice del modello e selezionare Aggiungi studio per aprire la scheda Aggiungi studio. Seleziona Studio dipendente dal tempo, fai clic con il pulsante sinistro del mouse sul pulsante Aggiungi studio e modifica la scheda Impostazioni come segue. Impostare Times su “range(0, (2*pi/omega)/39,2*pi/omega)”. Espandere la selezione di fisica e variabili; lasciare selezionata solo la casella di controllo “Risolvi per”. Espandete Selezione mesh e selezionate una mesh per il componente di simulazione. Modificate le mesh degli altri componenti in Nessuna mesh. Espandi Estensioni di studio e seleziona la casella di perfezionamento della mesh adattiva; selezionate la geometria del componente di simulazione dall’elenco a discesa. Definire la condizione al contorno dipendente dal tempo. Sotto il nodo del componente corrente fare clic con il pulsante destro del mouse su Definizioni e in Funzioni selezionare Forma d’onda. Nella scheda Impostazioni modificare il nome della funzione in “Input”. Espandi Parametri, imposta Tipo su Seno , Frequenza angolaresu “omega”, Ampiezza su V0. Per il componente di simulazione, sotto il nodo Correnti elettriche, selezionare Terminale e modificare tensione in “Input(t[1/s])”. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante Calcola. 3. Analisi Densità di carica Nel nodo Generatore modelli fare clic con il pulsante destro del mouse sul nodo Risultati, selezionare Gruppo plot 3D e modificare Impostazioni. Modificare l’etichetta in “Densità di carica”. Espandere Dati e selezionare il set di dati dello studio parametrico nell’elenco a discesa Set di dati. Espandi Legenda colori e seleziona “Mostra legende” e “Mostra valori massimi e minimi”. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Densità di carica nel nodo Risultati nel Generatore di modelli e selezionare Volume; procedere alla modifica della scheda Impostazioni. Espandi Dati e seleziona “Da genitore” dall’elenco a discesa Set di dati. Espandere Espressione e compilare “ec.rhoq” nella casella Espressione. Espandi Intervallo e seleziona la casella Intervallo colori manuale. Impostare minimo su “-0,03” e massimo su “0,03”. Espandi Colorazione e stile, imposta Colorazione su Tabella colori, Tabella colori su Onda, seleziona Casella legenda colore, seleziona Simmetrizza intervallo di colori. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Volume in Model Builder e selezionare Filtro. Nella scheda Impostazioni compilare “abs(ec.rhoq)>0.012” nell’espressione Logica per l’inclusione. Fate clic con il pulsante sinistro del mouse sul pulsante Stampa (Plot) per visualizzare i risultati nell’area grafica. Densità di corrente In Generatore modelli fare clic con il pulsante destro del mouse sul nodo Risultati, selezionare Gruppo di stampa 3D e modificare la scheda Impostazioni. Cambia l’etichetta in “Densità di corrente”. Espandere Dati e selezionare il set di dati dello studio parametrico nell’elenco a discesa Set di dati. Espandi Legenda colori, seleziona “Mostra legende” e “Mostra valori massimi e minimi”. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Densità corrente nel nodo Risultati in Model Builder e selezionare Volume freccia; procedere alla modifica della scheda Impostazioni. Espandi Dati e seleziona “Da genitore” dall’elenco a discesa Set di dati. Espandere Espressione e compilare “ec. Jx”, “ec. Jy”, “ec. Jz” nelle caselle Espressione rispettivamente per i componenti x, y e z. Espandere Posizionamento freccia e compilare 20 per tutte le coordinate numero di punti. Espandi Colorazione e stile, imposta Lunghezza freccia su Normalizzato, Base freccia su Centro, seleziona Fattore di scala e impostalo su 85. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Volume freccia in Model Builder e selezionare Espressione colore. Nella scheda Impostazioni compilare “ec.normJ” nella casella Espressione. Espandi Colorazione e stile, imposta tabella colori su Traffico, seleziona Legenda colore e Inverti tabella colori. Fate clic sul pulsante Stampa (Plot) per visualizzare i risultati nell’area grafica.

Representative Results

Il modello proposto descrive le caratteristiche di un tappetino composito con fibre parallele, immerso in una sostanza conduttiva ed esposto a un gradiente di potenziale elettrico generato esternamente. Le simulazioni mostrano che tenere conto dei diversi componenti di un’impalcatura è importante su una microscala ed esplorare come il cambiamento nell’angolo di allineamento (segnale di ingresso) delle fibre all’EF possa generare variabilità nella densità di corrente e carica (segnali di uscita) in prossimità delle fibre. Vengono presentati cinque diversi stadi di complessità geometrica, ognuno dei quali ha un effetto sul risultato della simulazione: lastra conduttiva liscia (SC), lastra liscia con fibre incorporate non conduttive (SNC), composito conduttivo ruvido (RC), composito ruvido con fibre incorporate non conduttive (RNC), composito ruvido con fibre incorporate non conduttive e due tipi di rivestimento periodico (RNCd) (Figura 3). La sezione 1.5 del protocollo presenta i passaggi per importare le geometrie in un progetto e la sezione 1.6 mostra come costruirle passo dopo passo. I primi due modelli non spiegano la morfologia della superficie. SC e RC non spiegano le proprietà dielettriche del nucleo della fibra. L’RNC è il modello proposto per gli scaffold artificiali nanofibrosi, mentre l’RNCd è il modello proposto per un segmento ECM. La minimizzazione dei costi computazionali è stata ottenuta riducendo la geometria del dispositivo ES a un volume di unità modello che rappresenta il microambiente. Mentre la larghezza e la lunghezza di un dispositivo ES e di un’impalcatura possono essere facilmente dell’ordine di pochi centimetri, il diametro delle fibre contenenti è solitamente inferiore a un micron. Qui, utilizziamo un taglio di impalcatura paragonabile al diametro della fibra per ridurre il costo computazionale indotto dalle proporzioni ed evidenziare l’effetto della natura fibrosa dell’impalcatura sul microambiente elettrico. Il resto del dispositivo ES viene sostituito con condizioni al contorno del potenziale elettrico scelte in modo che un’approssimazione approssimativa per la grandezza del campo elettrico sia 100 V / m, un parametro di stimolazione frequentemente riportato. Inoltre, si presume che un volume unitario con cinque fibre parallele – come quello utilizzato nelle simulazioni, presentato in Figura 3 – sia rappresentativo di un intero tappeto fibroso planare. Tre tipi di fibre possono essere distinti in un array 1D: centrale interno (con il piano di simmetria longitudinale dell’impalcatura che li divide a metà), interno transitorio (con superficie laterale circondata da altre fibre ma con lati asimmetrici) ed esterno (sul bordo dell’impalcatura). Cinque è il numero minimo di fibre richiesto per includere tutti e tre i tipi definiti. La dimensione dell’elemento mesh del modello richiede un’attenzione particolare in quanto può influire sui risultati della simulazione e quindi non riuscire a esporre effetti importanti ( Figura4). Questa è una regola generale del metodo degli elementi finiti e un’implicazione del teorema di campionamento di Nyquist-Shannon. Più velocemente i segnali di simulazione essenziali fluttuano nello spazio, più piccoli devono essere gli elementi della mesh per produrre una rappresentazione fedele del fenomeno. D’altra parte, più piccolo è l’elemento, maggiore è il numero totale di blocchi di costruzione del modello e il costo computazionale. Il perfezionamento adattivo della mesh impostato nella sezione 2.1 è un metodo buono e facile per bilanciare gli obiettivi opposti diminuendo la dimensione dell’elemento solo dove e finché questa operazione produce un cambiamento significativo. Un modello troppo semplicistico può fallire presentando effetti importanti (Figura 5,6). Le simulazioni mostrano che tenere conto della morfologia superficiale e delle proprietà elettriche dei componenti dell’impalcatura non è ridondante nella previsione dei microambienti elettrici. Mentre la morfologia superficiale ha un impatto diretto sull’EF stazionario (confronta SC e SNC con RC, RNC e RNCd), un confronto tra le previsioni RC e RNC mostra che i nuclei di fibre non conduttive amplificano questo effetto. Dal punto di vista della modellazione di microambiente elettrici cellulari su scaffold nanofibrosi, i modelli SC, SNC e RC sono quindi sub-ottimali. Tuttavia, è buona norma aggiungere complessità in modo incrementale poiché i confronti tra le diverse fasi aiutano a indicare quali caratteristiche danno origine a effetti specifici. La complessità del modello influisce sulla variazione della densità di corrente e carica con l’allineamento della fibra all’EF. Il protocollo proposto aiuta a evidenziare l’effetto (Figura 5,6). Mentre il modello SC non mostra alcuna variazione nelle metriche proposte quando il suo allineamento al gradiente di potenziale elettrico viene modificato, le simulazioni del modello RNC prevedono un potente contrasto tra l’unità mat con fibre allineate all’EF e quella con fibre perpendicolari (Figura 7). Quando i nuclei non conduttivi ostacolano il flusso di corrente, formano dighe periodiche che portano a regioni alternate di alta e bassa densità di carica. I regimi ES dinamici possono essere simulati con studi dipendenti dal tempo. I video in file supplementari mostrano le previsioni fatte per una tensione di ingresso sinusoidale su un modello di scaffold artificiale completo (RNC), con fibre parallele o perpendicolari al gradiente di potenziale elettrico. Piccole correnti lungo le fibre perpendicolari all’EF appaiono quando la carica viene rilasciata dall’impalcatura quando la magnitudine EF diminuisce. Ciò dimostra che la stimolazione potrebbe verificarsi non solo mentre l’EF esterno è presente, ma anche subito dopo che è stato disconnesso – Vedi i file supplementari per i video. Figura 1: Diagramma gerarchico a blocchi della modellazione – vantaggi e limiti della modellazione con modelli in vivo e in silico. Blocca i colori contrassegnano i blocchi sullo stesso livello gerarchico. I blocchi di rango inferiore sono inclusi in quelli di rango superiore. Segni di colore del tratto di blocco possibilità di includere il blocco in un determinato tipo di modello – l’accoppiamento con altri blocchi di sistema non ha il giallo nel loro tratto, in quanto non sono componenti per modelli in vitro. I proiettili agiscono come valvole e significano controllabilità del blocco. Quando una valvola è ON, il segnale può passare attraverso tutti i percorsi freccia nei sottosistemi subordinati che hanno il colore della valvola nel loro tratto. Interpretazione del diagramma: il processo ES è composto dal dispositivo di stimolazione e dal bersaglio biologico, ciascuno con diversi sotto-processi deterministici o stocastici interconnessi che non possono essere separati in vivo o in vitro, quindi non hanno valvola rossa o gialla. I processi stocastici intervengono anche sull’interfaccia tra il dispositivo di simulazione e il campione biologico quando entrambi sono stimolati. Un modello in vitro disaccoppia il sistema di interesse (cioè il segmento cutaneo) dal resto dell’organismo. Pertanto, si possono osservare solo processi intrinseci del sistema di interesse sormontati da processi stocastici di diversa natura. Tuttavia, i diversi processi intrinseci coinvolti non possono essere stimolati e identificati separatamente. I modelli in silico sono parametrici per componenti noti – il loro comportamento dovrebbe essere di una certa forma – e non parametrici per l’ignoto – in quanto non vi è alcuna ragione meccanicistica per dare credito a una certa estrapolazione. Tutte le componenti in silico possono essere simulate separatamente o in diverse combinazioni, permettendo la rappresentazione di diverse ipotesi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: (A) Legge di Coulomb (B) Campo di potenziale elettrico e carica della sonda mobile (C) Corrente elettrica (D) Densità di carica (E) Densità di corrente (F) Equazione di continuità (G) Legge di conservazione della carica. (A) Le particelle stazionarie elettricamente cariche q e Q interagiscono elettrostaticamente attraverso la forza di Coulomb. (B1) Ogni particella carica Q genera un campo scalare chiamato potenziale elettrico in tutte le posizioni nello spazio: . Il lavoro massimo richiesto per spostare un’altra particella carica q dalla sua posizione è il prodotto tra la carica q e il potenziale elettrico generato da Q in posizione . Il campo potenziale elettrico generato da più particelle è la somma dei campi generati da ogni singola particella. (B2) Un campo stazionario con particelle generatori fisse q e Q, agisce con una particella di sonda con carica positiva qp. In risposta, qp si muove per ridurre al minimo il potenziale elettrico della sua posizione. Per descrivere il moto di qp, si può derivare e il campo elettrico dal campo potenziale elettrico: . (C) Più particelle mobili di sonda caricate positivamente rilasciate uniformemente in un campo elettrico stazionario seguono un movimento organizzato. Per tracciare la configurazione della carica senza tracciare ogni particella, si può specificare in ogni istante: (D) come lo spazio è occupato dalle particelle, assegnando una densità di carica a ciascun volume infinitesimale, secondo la legge di Gauss, e (E) come le particelle passano attraverso le superfici limite tra volumi infinitesimali vicini, assegnando una densità di corrente a ciascun confine secondo la legge di Ohm. (F) La carica e la densità di corrente evolvono in modo co-dipendente secondo l’equazione della continuità, poiché lo spostamento non uniforme delle particelle porta all’accumulo o alla perdita di particelle in un certo volume. (G) All’interno di un sistema isolato, prevale la legge di conservazione della carica e non vi è afflusso o deflusso di particelle cariche. Notazioni utilizzate:- q,Q,qp carica e nome della particella carica; – Norma euclidea del vettore di posizione; k – costante di Coulomb; – operatore di gradiente, εa – permittività assoluta del mezzo; σ – conduttività del mezzo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Cinque diversi livelli di complessità per un tappeto fibroso. SC- liscio con fibre incorporate conduttive, il modello più semplice, che non tiene conto della morfologia superficiale o delle diverse proprietà dei componenti costitutivi; SNC- liscio con fibre incorporate non conduttive; RC- ruvido con fibre conduttive incorporate, tenendo conto della morfologia superficiale ma non delle diverse proprietà dei componenti; RNC- ruvido con fibre incorporate non conduttive, modello completo proposto di scaffold artificiali nanofibrosi; RNCd- ruvido con fibre incorporate non conduttive rivestite con due materiali diversi, modello completo proposto per un foglio di fibre di collagene. Unità di lunghezza utilizzata: nanometri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Risultati di esempio del raffinamento della mesh adattiva e della densità di carica risultante dopo la simulazione. (A sinistra) Mesh generata automaticamente con elementi tetraedrici extra grossolani; (Destra) Mesh iniziale perfezionata in modo adattivo durante lo studio stazionario; sono necessari elementi più piccoli per un risultato accurato nelle aree in cui i segnali simulati hanno bruschi cambiamenti spaziali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: L’angolo di allineamento della fibra al gradiente potenziale elettrico influisce sulla forza EF nei mezzi di coltura cellulare circostanti quando viene ripresa una complessità sufficiente. SC, SNC, RC, RNC e RNCd sono i diversi livelli di complessità per il modello di tappeto fibroso presentato in Figura 3. L’asse verticale segna l’angolo di allineamento delle fibre al gradiente di potenziale elettrico. Elettrodi astratti presenti – lato inferiore con alto potenziale elettrico e lato superiore con basso potenziale elettrico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: L’angolo di allineamento della fibra al gradiente potenziale elettrico influisce sulla densità di carica spaziale nei mezzi di coltura cellulare circostanti quando viene ripresa una complessità sufficiente. SC, SNC, RC, RNC e RNCd sono i diversi livelli di complessità per il modello di tappeto fibroso presentato in Figura 3. L’asse verticale segna l’angolo di allineamento delle fibre al gradiente di potenziale elettrico. Elettrodi astratti presenti-lato inferiore con alto potenziale elettrico e lato superiore con basso potenziale elettrico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Il movimento di carica è influenzato dall’allineamento delle fibre dell’impalcatura rispetto all’EF. Entrambi i pannelli illustrano le previsioni del modello RNC a stato stazionario. Sul lato sinistro le fibre sono parallele all’EF, mentre sul lato destro sono perpendicolari. Il volume di colore da rosso chiaro a blu indica la densità di carica, mentre il volume freccia segna l’orientamento della densità corrente. Il colore delle frecce corrisponde alla norma di densità corrente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nome Espressione Descrizione Ws 10 * Rc * med_ratio Larghezza dell’impalcatura Ls 10 * Rc * med_ratio Lunghezza dell’impalcatura Hs 2 * Rf Altezza dell’impalcatura med_ratio 1.5 Rapporto tra i mezzi di coltura cellulare e l’impalcatura Rc 278,5 [nm] Raggio del nucleo della fibra r 1.5 Rapporto nucleo in fibra/rivestimento Rf Rc*r Fibra con raggio del mantello Theta 90[deg] Angolo di orientamento della fibra Se 1.3*(Ls*cos(theta)+Ws*sin(theta)) Lunghezza della fibra Tes 1 Rapporto tra il raggio del nucleo della fibra e la distanza tra le fibre n_1 2*(fix((Ws/(2*cos(theta))-Rf)/(2*tes*Rc))+3)*(cos(theta)!=0)+1*(cos(theta)==0) Numero massimo di fibre se theta<=45 n_2 2*(fix((Ls/(2*sin(theta))-Rf)/(2*tes*Rc))+3)*(sin(theta)!=0)+1*(sin(theta)==0) Numero massimo di fibre se theta>45 eccesso 1.2 +0.3*abs(sin(2*theta)) Primo offset relativo della fibra dall’impalcatura D Lf/5 · Periodicità del mantello puntello 0.46 Lunghezza della prima mano rispetto alla periodicità D E 100[mV/mm] Magnitudine del campo elettrico V0 E*Ls*med_ratio Tensione terminale omega 500 [Hz] Studio dipendente dal tempo Frequenza di tensione p_sigma 0.5 Conducibilità relativa del secondo rivestimento p_eps 1.5 Seconda costante dielettrica relativa del rivestimento Tabella 1: Parametri utilizzati per la simulazione Media culturali PEDOT:PSS 1 PEDOT: PSS 2 Collagene Idratato 1 Collagene Idratato 2 Fibroina di seta Collagene Secco Conducibilità elettrica (S/m) 1.7014 1,00E-01 p_sigma * 0,1 2,00E-05 p_sigma * 2e-5 1,00E-08 2,50E-08 Permittività relativa 80.1 2.2 p_eps * 2.2 9.89 p_eps * 9,89 7,81E+00 4.97 Tabella 2: Proprietà del materiale utilizzate nella simulazione File supplementari. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Il protocollo proposto suggerisce una soluzione di modellazione uniforme per scaffold naturali e artificiali e sottolinea la necessità di considerare la nanostruttura degli scaffold fibrosi quando si ispezionano gli effetti di EF sulle cellule seminate su tali materiali. Sebbene un’approssimazione grossolana per l’intensità EF (differenza di potenziale dell’elettrodo divisa per la distanza tra gli elettrodi) ci porterebbe ad aspettarci un’intensità di campo di 100 mV / mm, le simulazioni prevedono intensità di campo stazionarie fino al 30% più alte in diverse aree del tappetino (Figura 5). Questo risultato dovrebbe essere di interesse nella progettazione dell’esperimento ES e nell’interpretazione dei dati, poiché la morte cellulare può essere causata da EF troppo forti. L’esposizione del microambiente elettrico consentirebbe una correlazione diretta tra ES e sviluppo cellulare. Mentre diversi studi presentano analisi morfologiche dettagliate degli scaffold utilizzati33,43,59,non indagano l’interazione tra la struttura, le proprietà elettriche dei materiali e l’EF. Questo protocollo può consentire questo collegamento, in quanto parametri come il raggio della fibra, lo spessore dello strato di rivestimento, la distanza tra le fibre e le proprietà elettriche dei materiali componenti possono essere modificati in base a ciascun esperimento modificando le definizioni globali ai passaggi 1.2 e 1.3. Pertanto, è possibile eseguire previsioni personalizzate di carica e densità di corrente 3D risolte spazialmente per regimi ES sia statici che dinamici.

L’ottimizzazione della progettazione di scaffold può essere mirata attraverso i modelli RNC e RNCd con esplorazioni ad ampio intervallo di parametri, ridimensionando le morfologie proposte o parti di esse. In alternativa, altre configurazioni di scaffold possono essere studiate con il protocollo proposto modificando i tipi di Array da Lineare a Tridimensionale nella sezione 1.6.5 e adattando la Geometria dello Scaffold nella sezione 1.6.2. Tuttavia, l’ottimizzazione dell’impalcatura non può essere eseguita senza un obiettivo. Mentre ai fini dell’ingegneria tissutale l’obiettivo principale è il destino cellulare, un quadro più chiaro su quali stimoli sono i suoi principali determinanti è essenziale se si desidera il suo controllo affidabile. La densità di carica e di corrente sono buoni descrittori dei microambienti elettrici cellulari in quanto mostrano l’interazione tra l’EF e le proprietà elettriche dei diversi materiali componenti di scaffold complessi come l’ECM. Il protocollo mostra come calcolare le previsioni per tali metriche data una geometria di scaffold nanofibrosa ed evidenzia l’importanza dell’angolo di allineamento delle fibre con l’EF. Le previsioni di carica e densità di corrente potrebbero quindi essere collegate allo sviluppo cellulare e quindi i regimi di scaffold ed ES potrebbero quindi essere ottimizzati per compiti specifici.

È interessante notare che uno studio mostra che l’esposizione a EF ha generato stress meccanico più del doppio in forza in film compositi con nanofibre perpendicolari all’EF esterno rispetto ai film con allineamento parallelo60. Lo stress meccanico riportato potrebbe essere il risultato di forze di Coulomb che agiscono tra fibre cariche, previste dalle simulazioni di modelli approssimativi (RC, RNC, RNCd) (Figura 6). Mentre queste simulazioni potrebbero essere utili per indagare questa ipotesi, va notato che i risultati sperimentali riportati sono stati ottenuti in un sistema con accoppiamento capacitivo e la simulazione presenta l’accoppiamento diretto.

Un fattore limitante verso i futuri possibili usi del protocollo per stimare un segnale di ingresso cellulare è l’incertezza dei parametri. I parametri geometrici incerti sono lo spessore dello strato di rivestimento e la distanza tra i nuclei di fibra. Il primo potrebbe essere dedotto trovando il valore che porta a un’impedenza di massa che può essere convalidata sperimentalmente. Il secondo può essere estratto da scansioni di materiali ad alta risoluzione. Anche i parametri che descrivono le proprietà fisiche dei materiali sono influenzati dall’incertezza. Tuttavia, la conduttività elettrica e la costante dielettrica dei materiali esemplificati differiscono molto più della precisione di misurazione sperimentale (Tabella 2). Pertanto, gli effetti segnalati sarebbero mantenuti nonostante errori di misurazione moderati.

I risultati mostrano come una complessità del modello insufficiente potrebbe nascondere informazioni rilevanti. È importante riconoscere che il protocollo simula una versione semplificata del fenomeno fisico in atto in quanto non tiene conto della diversa natura dei materiali coinvolti nel processo – conduttore (elettrodi), semiconduttore (rivestimento), dielettrico (nuclei di fibre) ed elettrolitico (sostanza circostante) – che sono in grado di influenzare il trasporto di carica. Questo problema può essere spiegato nelle future espansioni del modello aggiungendo ritardi di trasferimento di energia alle interfacce (cioè reazioni faradiche) e ritardi nel trasporto ionico all’interno dell’elettrolita. L’aggiunta di complessità dovrebbe tuttavia essere guidata dalla convalida sperimentale, poiché un modello semplice che riproduce la maggior parte di ciò che viene osservato è più utile di uno straordinariamente accurato che aggiunge poche informazioni in più ma è profondamente sensibile all’incertezza di molti parametri costitutivi.

Poiché l’obiettivo finale dell’ingegneria tissutale è quello di creare bioreattori che non solo imitino uno o due aspetti degli ambienti in vivo, ma replimentino e controllino tutti i segnali di sviluppo cellulare61,i modelli elettromagnetici e meccanici in silico e i modelli di trasferimento di calore tra i componenti del bioreattore dovranno essere combinati. In una successiva fase di modellazione, possono essere aggiunti anche fenomeni di accoppiamento tra quelle interazioni come il riscaldamento ohmico, il flusso del fluido elettrolitico, le deformazioni morfologiche dello scaffold in risposta alla stimolazione elettrica60 e la piezoelettricità62. Tuttavia, i modelli dovrebbero essere uniti solo dopo che ciascuno di essi è stato convalidato sperimentalmente. In questo modo, possiamo ottenere una migliore comprensione dell’influenza di ciascun componente nel microambiente cellulare e di come gli stimoli possono essere ottimizzati.

Se il modello proposto viene convalidato sperimentalmente, può essere combinato con modelli di cellule biologiche – Figura 1. I modelli di densità di carica e le modulazioni potrebbero influenzare asimmetricamente l’attività di specifiche pompe ioniche, l’attaccamento all’impatto alla fibra delle proteine che guidano l’adesione della membrana63 e quindi guidare la migrazione, i modelli di proliferazione e la morfogenesi64. Esplorare queste ipotesi è la via da seguire per comprendere i meccanismi alla base delle risposte dei tessuti e delle cellule all’ES.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal programma di dottorato Wellcome Trust di 4 anni in Biologia quantitativa e biofisica

Materials

Comsol multiphysics 5.2 AC/DC module COMSOL – FEM modelling software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, S., Mehta, A. S., Zhao, M. Biomedical applications of electrical stimulation. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (14), 2681-2699 (2020).
  2. Gordon, T. Electrical Stimulation to Enhance Axon Regeneration After Peripheral Nerve Injuries in Animal Models and Humans. Neurotherapeutics. 13 (2), 295-310 (2016).
  3. Pedrotty, D. M., et al. Engineering skeletal myoblasts: Roles of three-dimensional culture and electrical stimulation. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 288, 1620-1626 (2005).
  4. Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
  5. Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  6. Du, S., et al. Bioinspired hybrid patches with self-adhesive hydrogel and piezoelectric nanogenerator for promoting skin wound healing. Nano Research. 13 (9), 2525-2533 (2020).
  7. Gratieri, T., Santer, V., Kalia, Y. N. Basic principles and current status of transcorneal and transscleral iontophoresis. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (9), 1091-1102 (2017).
  8. Kroeling, P., Gross, A., et al. Electrotherapy for neck pain. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2013 (8), (2013).
  9. Hurlow, A., et al. Transcutaneous electric nerve stimulation (TENS) for cancer pain in adults. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2012 (3), (2012).
  10. Claydon, L. S., Chesterton, L. S., Barlas, P., Sim, J. Dose-specific effects of transcutaneous electrical nerve stimulation (TENS) on experimental pain: A systematic review. Clinical Journal of Pain. 27 (7), 635-647 (2011).
  11. Sbruzzi, G., Silveira, S. A., Silva, D. V., Coronel, C. C., Plentz, R. D. M. Estimulação elétrica nervosa transcutânea no pós-operatório de cirurgia torácica: Revisão sistemática e metanálise de estudos randomizados. Brazilian Journal of Cardiovascular Surgery. 27 (1), 75-87 (2012).
  12. Jin, D. M., Xu, Y., Geng, D. F., Yan, T. b. Effect of transcutaneous electrical nerve stimulation on symptomatic diabetic peripheral neuropathy: A meta-analysis of randomized controlled trials. Diabetes Research and Clinical Practice. 89 (1), 10-15 (2010).
  13. Bjordal, J. M., et al. Short-term efficacy of physical interventions in osteoarthritic knee pain. A systematic review and meta-analysis of randomised placebo-controlled trials. BMC Musculoskeletal Disorders. 8 (1), 51 (2007).
  14. Johnson, M., Martinson, M. Efficacy of electrical nerve stimulation for chronic musculoskeletal pain: A meta-analysis of randomized controlled trials. Pain. 130 (1-2), 157-165 (2007).
  15. Johnson, M. I. Transcutaneous Electrical Nerve Stimulation (TENS). eLS. , 1-13 (2012).
  16. Griffin, M., Bayat, A. Electrical stimulation in bone healing: critical analysis by evaluating levels of evidence. Eplasty. 11, (2011).
  17. Mollon, B., Da Silva, V., Busse, J. W., Einhorn, T. A., Bhandari, M. Electrical stimulation for long-bone fracture-healing: A meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of Bone and Joint Surgery – Series A. 90 (11), 2322-2330 (2008).
  18. Eberstein, A., Eberstein, S. Electrical stimulation of denervated muscle: Is it worthwhile. Medicine and Science in Sports and Exercise. 28 (12), 1463-1469 (1996).
  19. Mödlin, M., et al. Electrical stimulation of denervated muscles: First results of a clinical study. Artificial Organs. 29 (3), 203-206 (2005).
  20. Gordon, T., Amirjani, N., Edwards, D. C., Chan, K. M. Brief post-surgical electrical stimulation accelerates axon regeneration and muscle reinnervation without affecting the functional measures in carpal tunnel syndrome patients. Experimental Neurology. 223 (1), 192-202 (2010).
  21. Chan, K. M., Curran, M. W. T., Gordon, T. The use of brief post-surgical low frequency electrical stimulation to enhance nerve regeneration in clinical practice. Journal of Physiology. 594 (13), 3553-3559 (2016).
  22. Vance, C. G. T., Dailey, D. L., Rakel, B. A., Sluka, K. A. Using TENS for pain control: the state of the evidence. Pain management. 4 (3), 197-209 (2014).
  23. Peters, E. J., Lavery, L. A., Armstrong, D. G., Fleischli, J. G. Electric stimulation as an adjunct to heal diabetic foot ulcers: A randomized clinical trial. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 82 (6), 721-725 (2001).
  24. Lundeberg, T. C. M., Eriksson, S. V., Malm, M. Electrical nerve stimulation improves healing of diabetic ulcers. Annals of Plastic Surgery. 29 (4), 328-331 (1992).
  25. Houghton, P. E., et al. Electrical Stimulation Therapy Increases Rate of Healing of Pressure Ulcers in Community-Dwelling People With Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 91 (5), 669-678 (2010).
  26. Bikbova, G., Bikbov, M. Standard corneal collagen crosslinking versus transepithelial iontophoresis-assisted corneal crosslinking, 24 months follow-up: randomized control trial. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 600-606 (2016).
  27. Bhavsar, M. B., et al. Electrical stimulation-based bone fracture treatment, if it works so well why do not more surgeons use it. European Journal of Trauma and Emergency Surgery. 46 (2), 245-264 (2020).
  28. Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. Journal of Cell Biology. 98 (1), (1984).
  29. Hammerick, K. E., Longaker, M. T., Prinz, F. B. In vitro effects of direct current electric fields on adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 397 (1), 12-17 (2010).
  30. Shao, S., et al. Osteoblast function on electrically conductive electrospun PLA/MWCNTs nanofibers. Biomaterials. 32 (11), 2821-2833 (2011).
  31. Forciniti, L., Ybarra Iii, J., Zaman, M. H., Schmidt, C. E. Schwann cell response on polypyrrole substrates upon electrical stimulation. Acta Biomaterialia. , (2014).
  32. Kumar, A., Nune, K. C., Misra, R. D. K. Electric field-mediated growth of osteoblasts-the significant impact of dynamic flow of medium. Biomaterials Science. 4 (1), 136-144 (2016).
  33. Hyun Ko, U., et al. Promotion of Myogenic Maturation by Timely Application of Electric Field Along the Topographical Alignment. Tissue Engineering Part A. 24 (10), 752-760 (2018).
  34. Lynch, K., Skalli, O., Sabri, F. Growing Neural PC-12 Cell on Crosslinked Silica Aerogels Increases Neurite Extension in the Presence of an Electric Field. Journal of Functional Biomaterials. 9 (2), 30 (2018).
  35. Balint, R., Cassidy, N. J., Cartmell, S. H. Electrical stimulation: A novel tool for tissue engineering. Tissue Engineering – Part B: Reviews. 19 (1), 48-57 (2013).
  36. Chen, C., Bai, X., Ding, Y., Lee, I. S. Electrical stimulation as a novel tool for regulating cell behavior in tissue engineering. Biomaterials Research. 23 (1), (2019).
  37. Purushothaman, A. E., Thakur, K., Kandasubramanian, B. Development of highly porous, Electrostatic force assisted nanofiber fabrication for biological applications. International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials. 69 (8), 477-504 (2020).
  38. Yanılmaz, M., Sarac, A. S. A review: Effect of conductive polymers on the conductivities of electrospun mats. Textile Research Journal. 84 (12), 1325-1342 (2014).
  39. Tsukada, S., Nakashima, H., Torimitsu, K. Conductive polymer combined silk fiber bundle for bioelectrical signal recording. PLoS ONE. 7 (4), 33689 (2012).
  40. Nguyen, H. T., et al. Electric field stimulation through a biodegradable polypyrrole-co- polycaprolactone substrate enhances neural cell growth. Journal of Biomedical Materials Research – Part A. 102 (8), 2554-2564 (2014).
  41. Song, J., et al. Polymerizing pyrrole coated poly (l-lactic acid-co-ε-caprolactone) (PLCL) conductive nanofibrous conduit combined with electric stimulation for long-range peripheral nerve regeneration. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).
  42. Lee, J. Y., Bashur, C. A., Goldstein, A. S., Schmidt, C. E. Polypyrrole-coated electrospun PLGA nanofibers for neural tissue applications. Biomaterials. 30 (26), 4325-4335 (2009).
  43. Du, L., et al. Combined effects of electrospun nanofibrous scaffold and electrical field on the neuronal outgrowth. Materials Letters. 256, (2019).
  44. Theocharis, A. D., Skandalis, S. S., Gialeli, C., Karamanos, N. K. Extracellular matrix structure. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 4-27 (2016).
  45. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annual Review of Biochemistry. 78, 929-958 (2009).
  46. Fang, M., et al. Type i collagen D-spacing in fibril bundles of dermis, tendon, and bone: Bridging between nano- and micro-level tissue hierarchy. ACS Nano. 6 (11), 9503-9514 (2012).
  47. PETRUSKA, J. A., HODGE, A. J. a Subunit Model for the Tropocollagen Macromolecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica. 51 (5), 871-876 (1964).
  48. Kastelic, J., Galeski, A., Baer, E. The multicomposite structure of tendon. Connective Tissue Research. 6 (1), 11-23 (1978).
  49. Thorpe, C. T., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. The role of the non-collagenous matrix in tendon function. International Journal of Experimental Pathology. 94 (4), 248-259 (2013).
  50. Chapman, G. E., McLauchlan, K. A. The hydration structure of collagen. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 173 (31), 223-234 (1969).
  51. Bardelmeyer, G. H. Electrical conduction in hydrated collagen. I. Conductivity mechanisms. Biopolymers. 12 (10), 2289-2302 (1973).
  52. Budde, K., et al. Requirements for Documenting Electrical Cell Stimulation Experiments for Replicability and Numerical Modeling. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 1082-1088 (2019).
  53. Zhao, S., Mehta, A. S., Zhao, M. Biomedical applications of electrical stimulation. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (14), 2681-2699 (2020).
  54. Zhang, T., Yi, Y. B. Monte Carlo simulations of effective electrical conductivity in short-fiber composites. Journal of Applied Physics. 103 (1), 14910 (2008).
  55. Meny, I., Burais, N., Buret, F., Nicolas, L. Finite element modeling of cell exposed to harmonic and transient electric fields. 12th Biennial IEEE Conference on Electromagnetic Field Computation, CEFC 2006. 43 (4), 310 (2006).
  56. Schoenbach, K. H., et al. Ultrashort electrical pulses open a new gateway into biological cells. Proceedings of the IEEE. 92 (7), 1122-1136 (2004).
  57. Gowrishankar, T. R., Smith, K. C., Weaver, J. C. Transport-based biophysical system models of cells for quantitatively describing responses to electric fields. Proceedings of the IEEE. 101 (2), 505-517 (2013).
  58. Pietak, A., Levin, M. Exploring instructive physiological signaling with the bioelectric tissue simulation engine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).
  59. Babaie, A., et al. Synergistic effects of conductive PVA/PEDOT electrospun scaffolds and electrical stimulation for more effective neural tissue engineering. European Polymer Journal. 140, 110051 (2020).
  60. Zhou, J., Fukawa, T., Kimura, M. Directional electromechanical properties of PEDOT/PSS films containing aligned electrospun nanofibers. Polymer Journal. 43 (10), 849-854 (2011).
  61. Castro, N., et al. Physically Active Bioreactors for Tissue Engineering Applications. Advanced Biosystems. 4 (10), 1-29 (2020).
  62. Ribeiro, S., Gomes, A. C., Etxebarria, I., Lanceros-Méndez, S., Ribeiro, C. Electroactive biomaterial surface engineering effects on muscle cells differentiation. Materials Science and Engineering. , (2018).
  63. Marzocchi, M., et al. Physical and Electrochemical Properties of PEDOT:PSS as a Tool for Controlling Cell Growth. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (32), 17993-18003 (2015).
  64. Leronni, A., Bardella, L., Dorfmann, L., Pietak, A., Levin, M. On the coupling of mechanics with bioelectricity and its role in morphogenesis. Journal of the Royal Society Interface. 17 (167), 20200177 (2020).

Tags

Finite Element ModelingCellular Electric MicroenvironmentExtracellular MatrixElectrical StimulationCOMSOLMaterial PropertiesElectrical ConductivityRelative Permittivity3D ModelingParameter OptimizationElectric Current ModuleBoundary Conditions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Verdes, M., Disney, C., Phamornnak, C., Margetts, L., Cartmell, S. Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment. J. Vis. Exp. (171), e61928, doi:10.3791/61928 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image