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Bioengineering

Construyendo un sistema de iluminación simple y versátil para experimentos optogenéticos

Published: January 12, 2021
doi:
10.3791/61914
, , , , , , , , , ,
1Department of Bioengineering,University of California, San Diego, 2University of California, San Diego, 3Department of Mathematical Computational, and Systems biology,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

Este protocolo describe cómo realizar experimentos optogenéticos para controlar la expresión génica con luz roja y roja lejana utilizando PhyB y PIF3. Se incluyen instrucciones paso a paso para construir un sistema de iluminación simple y flexible, que permite el control de la expresión génica u otra optogenética con una computadora.

Abstract

El control de los procesos biológicos utilizando la luz ha aumentado la precisión y la velocidad con la que los investigadores pueden manipular muchos procesos biológicos. El control óptico permite una capacidad sin precedentes para diseccionar la función y tiene el potencial de permitir nuevas terapias genéticas. Sin embargo, los experimentos optogenéticos requieren fuentes de luz adecuadas con control espacial, temporal o de intensidad, a menudo un cuello de botella para los investigadores. Aquí detallamos cómo construir un sistema de iluminación LED versátil y de bajo costo que sea fácilmente personalizable para diferentes herramientas optogenéticas disponibles. Este sistema es configurable para control manual o por ordenador con intensidad LED ajustable. Proporcionamos una guía ilustrada paso a paso para construir el circuito, hacerlo controlado por computadora y construir los LED. Para facilitar el montaje de este dispositivo, también discutimos algunas técnicas básicas de soldadura y explicamos los circuitos utilizados para controlar los LED. Usando nuestra interfaz de usuario de código abierto, los usuarios pueden automatizar la sincronización precisa y el pulso de luz en una computadora personal (PC) o una tableta económica. Esta automatización hace que el sistema sea útil para experimentos que utilizan LED para controlar genes, vías de señalización y otras actividades celulares que abarcan grandes escalas de tiempo. Para este protocolo, no se requiere experiencia previa en electrónica para construir todas las piezas necesarias o para usar el sistema de iluminación para realizar experimentos optogenéticos.

Introduction

Las herramientas optogenéticas se están volviendo omnipresentes y constantemente se desarrollan nuevas tecnologías para controlar ópticamente los procesos biológicos, como la expresión génica, la señalización celular y muchos más 1,2,3. La capacidad de controlar los procesos celulares con luz permite una cinética rápida, un control espacial estricto y una regulación dependiente de la dosis que puede controlarse mediante la intensidad de la luz y el tiempo de exposición. Para utilizar estas herramientas, es necesario un dispositivo para controlar estos parámetros. Recientemente hemos desarrollado un interruptor genético de mamíferos PhyB-PIF3 codificado genéticamente que activa y desactiva genes de forma reversible utilizando luz roja / roja lejana, respectivamente4. Este sistema se probó en varias líneas celulares de mamíferos y permitió la inducción sin precedentes de la expresión génica incluso con cantidades muy pequeñas de luz, incluidos pulsos de luz. Los investigadores que desean utilizar el interruptor PhyB y herramientas similares 5,6 solicitan con frecuencia información sobre métodos para controlar la intensidad y la duración de la iluminación. Por lo tanto, desarrollamos este protocolo con instrucciones paso a paso para permitir una adopción más amplia de estas herramientas para la optogenética.

Antes del uso generalizado de LED, se utilizaban fuentes de luz de banda ancha con filtros para estudiar proteínas sensibles a la luz como los fitocromos7. Recientemente, se han publicado algunos sistemas de iluminación LED junto con herramientas optogenéticas 8,9,10,11,12, pero esos protocolos pueden requerir una experiencia significativa en electrónica / software, requieren equipos especializados (por ejemplo, impresoras 3D, máquinas de corte por láser o fotomáscaras) o no proporcionan las instrucciones paso a paso que algunos investigadores necesitarían implementar para sus necesidades de investigación. Si bien el control independiente de pozos individuales en una placa de pocillos múltiples puede ser útil, a menudo es innecesario cuando los investigadores solo necesitan comparar varias muestras diferentes en luz clara y oscura o roja versus luz roja lejana. Además, muchos sistemas comerciales existentes son caros, con una capacidad de personalización limitada. Sin embargo, los LED descritos en este protocolo son rentables, brillantes y se pueden montar de muchas maneras; Por lo tanto, se pueden utilizar para iluminar varios tipos diferentes de muestras. Con el protocolo y el software proporcionado, los LED que van desde ultravioleta (UV) hasta NIR se pueden usar y controlar con software para realizar experimentos optogenéticos utilizando UVR8 13,14, Dronpa 15,16, dominios LOV 17,18, Opsinas de función escalonada 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, fitocromos bacterianos26,27,28,29 y otros sistemas sensibles a la luz 30,31,32.

Este protocolo constituye un tutorial para el montaje de los circuitos y otros equipos necesarios para controlar diferentes parámetros para la estimulación de la luz, así como las herramientas moleculares / celulares para ejecutar un experimento optogenético. Además, reportamos plásmidos optimizados de Kyriakakis et al.4 que son más pequeños y más estables para la clonación. A través de este protocolo, los biólogos sin experiencia en electrónica y óptica pueden construir sistemas de iluminación que sean flexibles y robustos. De manera paso a paso, mostramos cómo construir sistemas LED, eliminando el cuello de botella técnico para la adopción más amplia de herramientas optogenéticas. Este sistema se puede utilizar fácilmente en la mayoría de las incubadoras de cultivo celular, incluso si no contienen puertos de cable. Por ejemplo, hemos mantenido el sistema LED en una incubadora humidificada deCO2 continuamente durante más de 6 meses sin disminución en el rendimiento. También explicamos cómo conectar el sistema LED a una computadora e interconectarlo con el software de código abierto que proporcionamos en GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). La construcción de un sistema utilizando este protocolo proporciona a los investigadores el conocimiento básico para depurar posibles problemas, reemplazar piezas y mejorar / ampliar las funcionalidades.

Descripción general del sistema

La construcción del sistema de iluminación implica (1) construir el circuito electrónico, (2) construir los periféricos (cable de alimentación, interruptor de alimentación, etc.), (3) construir los LED, (4) ensamblar todos estos componentes y (5) instalar el software para controlar los LED con una interfaz de usuario (Figura 1A). Una vez completado, el sistema de iluminación puede controlar hasta cuatro LED de forma independiente con una interfaz de usuario (Figura 1B). La interfaz de usuario permite que cada LED pulse a intervalos de tiempo especificados y se apague después de un tiempo especificado. También hay un retardo de inicio para comenzar los programas de iluminación a una hora específica. Los potenciómetros (POT) regulan la intensidad de cada LED de forma independiente o se pueden usar para el control manual de LED sin una computadora. Los cables a los LED pueden tener cualquier longitud personalizada, lo que les permite colocarse fácilmente en una incubadora o espacio de laboratorio. Debido a la alta potencia de estos LED, se pueden usar para iluminar un área grande con un solo LED a distancia.

Descripción del controlador LED

Para alimentar y controlar la intensidad de los LED, este protocolo seguirá los pasos para construir un “controlador LED”. Cada LED tiene un rango de voltajes en los que opera (Figura 1C). Durante el funcionamiento, el voltaje de salida del regulador, que controla la intensidad de la luz, puede ser sintonizado por un potenciómetro. El POT varía la resistencia, ajustando el voltaje / brillo de salida. La sintonización con un POT de 1kΩ (1 kilo-ohmio) da lo que llamamos el “circuito de alto voltaje” y tiene un rango de 1.35 V a 2.9 V. Dado que 2.9 V es demasiado alto para operar los LED de menor voltaje (Figura 1C), mostramos una sola modificación (Resistencia 3 o “R3” Figura suplementaria 1A) que limita el rango para que coincida con los LED de bajo voltaje. R3 sirve para disminuir el voltaje máximo aplicado a los LEDs a 1.85 V (ensamblaje detallado en la Figura Suplementaria 8) cuando está en paralelo con el potenciómetro. Al usar voltaje para controlar el brillo en lugar de la corriente, el sistema es más flexible para LED con diferentes voltajes de funcionamiento. La Figura 1C contiene una lista de los LED de alto y bajo voltaje para guiar la selección óptima del circuito. Este diseño mantiene el voltaje mínimo lo suficientemente bajo como para que el LED esté completamente apagado cuando el potenciómetro está apagado y no permite que el voltaje supere el voltaje de funcionamiento típico del LED. Para la optogenética PhyB, utilizamos LED de color rojo intenso y rojo lejano, que utilizan el circuito de bajo voltaje.

Descripción del sistema de control informático LED

El sistema de iluminación LED se puede utilizar para una iluminación constante sin una computadora o microcontrolador. Sin embargo, para los programas pulsantes y para controlar la sincronización individual del LED, se debe instalar un microcontrolador. Para usar un microcontrolador para controlar los LED, se requiere un transistor para conectar el microcontrolador al circuito. Este transistor detecta el voltaje del microcontrolador y cambia de ser conductor o aislante. Para controlar el “encendido” y el “apagado”, utilizamos lo que se denomina un “transistor de tipo de conmutación NPN” (2N2222) como una derivación controlable a través de R2 (Figura suplementaria 1A). Cuando el voltaje del microcontrolador se aplica a la base del transistor, el transistor se vuelve conductor y hace que el voltaje del LED sea bajo, apagando el LED. Por lo tanto, los estados de encendido y apagado del LED y el transistor son controlados directamente por el microcontrolador, que es controlado por el software instalado en la PC.

Para hacer el sistema de iluminación, se requieren los siguientes pasos: Construir el circuito eléctrico; construir la fuente de alimentación, el interruptor de alimentación manual, los POT y la conexión del microcontrolador; construir los LEDs; acomodar una caja negra para adaptarse al sistema de iluminación; conectar todo el cableado y los dispositivos; instalar el software de control LED, estimular las células con luz; Medir la expresión génica mediante un ensayo de luciferasa dual.

Protocol

1. Construye el circuito eléctrico NOTA: El protocolo para construir un circuito único para un LED disponible se describe aquí. Las instrucciones para ampliar esto hasta cuatro LED se incluyen en la información complementaria. Encienda el absorbedor de humos y el soldador. Agregue agua a la esponja de limpieza, tenga la soldadura a mano.PRECAUCIÓN: Asegúrese de tomar precauciones de seguridad para eliminar el humo y prevenir quemaduras. Comience a soldar los componentes del circuito a la placa de circuito impreso (placa PCB) en el orden que se muestra en los paneles suplementarios.NOTA: Use una pequeña cantidad de soldadura en la punta del soldador para calentar primero el metal del componente y la placa PCB y derrita la soldadura adicional directamente sobre los componentes; El flujo puede ayudar mucho. Cables y componentes de puente de soldadura (Figura complementaria 2 y Figura complementaria 3).Para los cables de puente (el cableado aislado que conecta dos puntos en la placa de circuito), use dos piezas de cables naranjas [7.6 mm (0.3 pulgadas)] y amarillos [12 mm (0.4 pulgadas)] del kit de puente. Sujete la placa PCB a las “manos de ayuda” e inserte los cables de puente en los siguientes orificios, doble los terminales 45 grados y agregue flujo (Figura 2, Figura complementaria 2 y Figura complementaria 3): a1 y a3 → tierra (-) (naranja), a7 → fuente de alimentación (+) #7 (amarillo), d2 → d6 (amarillo). Suelde y luego recorta la parte posterior de los cables. Inserte el regulador de voltaje LM317T en los siguientes orificios, doble los pines y agregue flujo (Figura 2 y Figura complementaria 4): Adj → e5, Vout → e6, Vin → e7. Suelde primero los terminales izquierdo y derecho, recórtalos, luego suelda y recorta el terminal central. Para ajustar el rango de bajo voltaje del circuito, inserte una resistencia de 820 Ω hasta el final en los orificios, suelde y recorte c2 → c5 (Figura 2 y Figura complementaria 5). Para habilitar el control del LED por el microcontrolador, inserte el transistor en b3–b5 (Figura 2 y Figura 6 suplementaria): Colector → b3, Base → b4, Emisor → b5.NOTA: Tenga en cuenta la orientación del transistor para insertar correctamente; compruebe las especificaciones para encontrar la designación Recopilador, Base y Emisor. Suelde los conectores de cable a cable para el POT, LED, microcontrolador y fuente de alimentación.NOTA: Preste atención al color de los cables de los conectores de cable a cable y si utiliza un conector de cable a cable hembra o macho.Determine si se requiere un circuito de “bajo voltaje” o un circuito de “alto voltaje” para el LED deseado (Figura 1C).NOTA: Si el LED está en la lista de “bajo voltaje”, se requiere una resistencia en paralelo con el POT. Para el circuito de “bajo voltaje” o “alto voltaje”, coloque el cable de un conector hembra de cable a cable a través del orificio a5 (Figura suplementaria 7). No suelde en su lugar todavía si hace el circuito de bajo voltaje.NOTA: Gire los extremos de alambre desnudos para que los pequeños pelos de alambre no se desprendan. Si el alambre parece demasiado grueso para empujar a través del orificio sin deshilacharse, corte de 2 a 6 hebras y luego gírelas de nuevo (Figura suplementaria 7B-D). Si está haciendo el circuito de “alto voltaje”, vaya al paso 1.4.5. Si fabrica el circuito de “bajo voltaje”, empuje una resistencia de 560Ω a través del mismo orificio (a5) y suelde con el cable conector de cable a cable. Conecte el otro extremo de la resistencia a tierra (Figura suplementaria 7G). Inserte el otro extremo del conector hembra de cable a cable soldado en un orificio a5 que lo conecta a tierra y suelde (Figura suplementaria 8A, B). Para la conexión del microcontrolador, inserte un extremo de un conector macho de cable a cable en el orificio a4 y el otro en un orificio conectado a tierra (Figura suplementaria 9A-C). Para la conexión LED, inserte un extremo de un conector hembra de cable a cable en el orificio a2 y el otro extremo en un orificio conectado a tierra (Figura suplementaria 9D, E). 2. Construya la fuente de alimentación, el interruptor de alimentación manual, los POT, y la conexión del microcontrolador Construya la fuente de alimentación.Suelde un puente naranja [7,6 mm (0,3 pulgadas)] desde a29 hasta el suelo (Figura suplementaria 10). Suelde un conector hembra de cable a cable de a30 a la fuente de alimentación (+) (Figura suplementaria 11A-C). Suelde un conector macho de cable a cable de c29 a c30 (Figura suplementaria 11D-F). Corte el conector de un cable de alimentación, exponga los cables y pelarlos (Figura suplementaria 12A-C). Agregue fundente a los cables antes de soldar con un bolígrafo fundente (Figura complementaria 3G). Coloque un tubo retráctil de 3,18 mm (1/8 de pulgada) alrededor de un conector macho de cable a cable y una pieza más gruesa de 4,76 mm (3/16 pulgada) sobre el cable de la fuente de alimentación (Figura suplementaria 12D). Gire los cables de la fuente de alimentación y del conector macho de cable a cable y suelde (Figura suplementaria 12E, 13A, B). Coloque el tubo retráctil de diámetro más pequeño de 3,18 mm (1/8 de pulgada) sobre las conexiones y encogerlas con una pistola de calor (Figura suplementaria 13C, D). Coloque un tubo retráctil de mayor diámetro de 4,76 mm (3/16 pulgadas) sobre el tubo retráctil más pequeño de 3,18 mm (1/8 de pulgada) y vuelva a calentar (Figura suplementaria 13E, F). Construya el interruptor de encendido manual.Coloque el tubo retráctil 3,18 mm (1/8 de pulgada) sobre los cables del interruptor (Figura suplementaria 14A). Gire y suelde los cables de un conector macho de cable a cable (Figura suplementaria 14B, C). Coloque el tubo retráctil 3,18 mm (1/8 de pulgada) sobre secciones soldadas y encoja con una pistola de calor (Figura suplementaria 14D,E). Conecte el conector macho de cable a cable al POT.Coloque el cable negro del conector cable a cable alrededor del terminal central del POT (Figura suplementaria 15B). Gire el cable que está firmemente enrollado alrededor del terminal y suéldelo (Figura suplementaria 15C).NOTA: Los alicates de precisión pequeños pueden ayudar a hacer un giro cerrado. Repita con la conexión del cable rojo al terminal, como en la Figura suplementaria 15D. Use alicates para romper la lengüeta metálica cerca de la flecha roja (Figura suplementaria 15E, F). Construya la conexión del microcontrolador (solo necesaria para LED controlados por computadora).Si fabrica un controlador LED para más de un LED, corte los cables negros de todos menos un conector hembra de cable a cable (Figura suplementaria 16A). Engarce los extremos de los conectores de cable a cable, como se muestra (Figura suplementaria 16B-D). Empuje los extremos engarzados a través del conector rectangular (Figura suplementaria 16E). 3. Construye los LEDs Pele los extremos del alambre (~5 mm) y aplique el fundente con un bolígrafo fundente como en la Figura suplementaria 3G.NOTA: Para soldar eficientemente los cables en la base del LED, se debe agregar flujo a los contactos en la base del LED y los cables. Estañar el alambre calentando el alambre desde abajo y agregando soldadura desde la parte superior (Figura suplementaria 17B). Utilice la pluma de fundente para colocar el fundente en el contacto superficial de la base del LED (Figura complementaria 17C). Coloque una cantidad generosa de soldadura en una punta de soldadura grande (~4–5 mm) (Figura suplementaria 17D), utilícela para calentar la base del LED en el contacto (Figura suplementaria 17E). Después de unos segundos, arrastre la soldadura por el contacto (Figura suplementaria 17F). Repita los pasos 3.3–3.4 en el otro contacto (Figura suplementaria 17G).PRECAUCIÓN: La base LED puede calentarse mucho durante la soldadura. Coloque la base del LED sobre una superficie que no se derrita ni se queme. Sujete el cable negro en el contacto “C+” (el cátodo) utilizando las pinzas para el cabello (Figura suplementaria 18A). Coloque una cantidad generosa de soldadura en la punta de soldadura grande (Figura suplementaria 18B) y presiónela hacia abajo en el cable hasta que la soldadura en la base del LED se derrita (Figura suplementaria 18C). Sujete el alambre (Figura suplementaria 18D) y retire el soldador mientras mantiene el cable en su lugar (Figura suplementaria 18E). Coloque una pequeña cantidad de pasta de soldadura en las almohadillas para las conexiones LED (Figura suplementaria 19A, B) y coloque el LED sobre las almohadillas con pinzas (Figura suplementaria 19C).NOTA: Si la colocación está un poco desviada, está bien; Entrará en su lugar una vez que la pasta de soldadura se derrita. Sostenga el cable rojo en el “A+” (ánodo) y enganchelo con una pinza para el cabello (Figura suplementaria 20A-C). Coloque una cantidad generosa de soldadura en la punta de soldadura grande (Figura suplementaria 20D) y presiónela hacia abajo sobre el cable hasta que la soldadura en la base del LED y la pasta de soldadura debajo del LED se derritan (Figura suplementaria 20E).NOTA: Después de que la pasta de soldadura se derrite, el color se vuelve plateado (Figura suplementaria 20H, I). Elija la longitud del cable necesario para la configuración deseada. Pelar los cables LED y un conector macho de cable a cable (Figura complementaria 21A) y luego agregar flujo como en la Figura suplementaria 3G. Coloque el tubo retráctil sobre los cables. Utilice un tubo retráctil de 3,18 mm (1/8 de pulgada) sobre los conectores de cable a cable y un tubo retráctil de 4,76 mm (3/16 pulgadas) sobre el cable (Figura complementaria 21B). Sujete el conector de cable a cable con una “mano de ayuda” y gire el extremo del conector con el cable (Figura suplementaria 21C) y suéldelos. Repita con el otro cable (Figura suplementaria 21D,E). Coloque los tubos retráctiles de 3,18 mm (1/8 de pulgada) sobre la soldadura y encoja (Figura suplementaria 21F-G). Coloque el tubo retráctil de 4,76 mm (3/16 pulgadas) sobre el tubo retráctil de 3,18 mm (1/8 de pulgada) y retráctil (Figura complementaria 21H–I). Sujete los cables LED de las “manos que ayudan” con cinta adhesiva debajo (Figura complementaria 22A). Mezclar epoxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante y extender sobre la parte superior del LED soldado (Figura complementaria 22B). Dejar toda la noche para curar. Si se monta con un cierre táctil, corte un trozo pequeño del cierre táctil (Figura complementaria 23A) y presiónelo contra la parte posterior del LED durante 30 s. Utilice una herramienta giratoria de alta velocidad para hacer una muesca en la tapa de una caja negra (Figura suplementaria 23C-E). Construya un montaje para un solo LED a través de una película de privacidad.Usando la broca de pala, perfore un orificio de 1,75 cm (11/16 pulgadas) a través de la parte superior de una caja negra donde se colocará el LED (Figura complementaria 24A). Usando una herramienta giratoria de alta velocidad, haga una muesca en un lado del orificio para dejar espacio para el cable LED, como se muestra en la Figura suplementaria 24A. Corte un trozo de película de privacidad (25–30 mm) y péguelo con cinta adhesiva en el interior de la caja negra que cubre el orificio por el que se iluminará el LED (Figura complementaria 24A). Coloque el LED fuera de la caja negra en la parte superior del orificio con película de privacidad y cinta adhesiva en su lugar con cinta aislante (Figura complementaria 24B-E). 4. Acomode una caja negra para adaptarse al sistema de iluminación Para un sistema de cuatro LED, perfore cuatro orificios de 0,83 cm (21/64 pulgadas) en la tapa a 3,81 cm (1,5 pulgadas) de distancia donde se conectarán los potenciómetros (Figura complementaria 25). Con una herramienta giratoria de alta velocidad, corte un orificio rectangular de 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 pulgadas x 0,75 pulgadas) en la esquina superior izquierda (Figura complementaria 25). Usando la broca de pala, perfore un orificio de 1,75 cm (11/16 pulgadas) en la caja negra (Figura complementaria 26). Lime los orificios e inserte la arandela en el orificio perforado (Figura complementaria 26). Para los LED controlados por computadora, lije el área donde el microcontrolador estará pegado en una caja negra, así como la parte inferior del soporte del microcontrolador. Coloque el microcontrolador en el soporte antes de asegurarlo en la caja negra y luego epoxi en su lugar (Figura complementaria 27A). Use papel de lija para lijar la parte inferior de dos clips y el área en una caja negra donde se colocará el circuito y asegure los clips dentro de la caja negra con el epoxi (Figura complementaria 27A). Fije la placa PCB en clips (Figura complementaria 27B). Empuje el interruptor de encendido a través del orificio cuadrado de la tapa hecho en la Figura Suplementaria 25 y encaje en su lugar (Figura Suplementaria 28A). Empuje los POTs a través de los orificios de la tapa, atornille en su lugar (Figura suplementaria 28A) y coloque la perilla en el POT (Figura suplementaria 28B). 5. Conecte todo el cableado y los dispositivos Etiquete los conectores de cable a cable (por ejemplo, LED, POT, COM) (figura complementaria 29A). Acople los conectores engarzados del paso 2.4 (Figura complementaria 16) al conector macho de cable a cable entre los dos conectores hembra (POT y LED) (Figuras suplementarias 7A y S37). Conecte los extremos engarzados al microcontrolador (Figura complementaria 30). Tire del cable USB a través de la arandela y conéctelo al microcontrolador. Tire de los cables de los LED a través de la arandela y conéctelos al conector hembra de cable a cable a la izquierda de la conexión del microcontrolador (figuras suplementarias 9D y 38). Tire del cable para la fuente de alimentación a través de la arandela y conéctelo al conector macho de cable a cable en el lado derecho de la placa PCB (Figura suplementaria 11D). Conecte el conector macho de cable a cable del interruptor de alimentación al conector hembra de cable a cable a la derecha de la placa PCB (Figura suplementaria 11A). Conecte los conectores macho de cable a cable de los POT de la tapa a los conectores hembra de cable a cable de la placa PCB (Figuras suplementarias 8 y 36).NOTA: No encienda el circuito sin los potenciómetros conectados. 6. Instale el software de control LED NOTA: Consulte las instrucciones detalladas de instalación de software en el archivo complementario en Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces Descargue e instale el software para programar el microcontrolador Descargue e instale el administrador de paquetes. Programa el microcontrolador. Descargue e instale el motor en tiempo de ejecución. Descargue la interfaz de usuario. 7. Estimula las células con luz Células HEK293 transfectivas.Placas HEK293 a 100k células por pocillo en una placa de 24 pocillos. Utilice la tabla de ejemplo para calcular los volúmenes de medios sin suero, polietilenimina (PEI) y ADN (Figura suplementaria 39) y transfecto utilizando el protocolo del fabricante. Estimular las células con luz.NOTA: Las células deben mantenerse en la oscuridad después de la transfección o manipularse utilizando una fuente de luz que no excite el sistema optogenético.Decida qué tipo de estimulación se utilizará en las células (luz continua, intensidad pulsante, etc.). Con los POTs apagados (en sentido contrario a las agujas del reloj), encienda la fuente de alimentación LED. Coloque un medidor de luz dentro de la caja negra donde se colocarán las celdas y coloque la tapa con el LED sobre el medidor. Ajuste la intensidad de la luz según sea necesario. Si utiliza el ordenador para controlar los LED, abra el software de la interfaz de usuario. Programe la interfaz de usuario (Figura 5A,B).En el panel superior izquierdo, seleccione el puerto COM para el microcontrolador y haga clic en Conectar. Utilice los paneles de la derecha para programar cada LED. Para luz continua, seleccione cualquier tiempo excepto cero en el “Tiempo encendido” y establezca el “Tiempo apagado” en cero. En el panel inferior derecho, programa el control de temporización principal.Para retrasar la iluminación, seleccione un retardo de inicio (HH:MM). Para apagar todos los LED después de un tiempo designado, seleccione un tiempo de ejecución (HH:MM). Inicie el programa de iluminación haciendo clic en el botón Ejecutar (Figura 5A). 8. Medir la expresión génica mediante un ensayo dual de luciferasa Preparar el reactivo de luciferasa mezclando 10 ml de tampón luciferasa con reactivo de luciferasa y alícuota en tubos de 1 ml para almacenar a -80 °C durante un máximo de 1 año. Prepare el tampón de lisis 5x en 1x para 100 μL para N + 2 pocillos. por ejemplo, para 30 muestras, 30 x 20 μL de tampón de lisis 5X y 30 x 80 μL de MQH2O. Preparar la solución de sustrato de Renilla: 20 μL de sustrato de Renilla por 1 ml de tampón de Renilla (esta cantidad es adecuada para 10 ensayos). Retire las células de la incubadora, aspire el medio, agregue 100 μL de 1x tampón de lisis por pocillo y colóquelo en un agitador a 100 RPM durante 15 min. Colocar a -20 °C durante al menos 1 h. Añadir 100 μL de reactivo luciferasa por muestra en un pocillo de una placa blanca de 96 pocillos. Configure el lector de placas para la luminiscencia. Utilizando el módulo luminómetro del lector de placas, configure la integración para 1 s. Agregue lisados descongelados en pocillos debajo del reactivo de luciferasa. Con una pipeta multicanal, mezclar 20 μL de muestra en el reactivo de luciferasa y medir la luminiscencia inmediatamente. Después de la meseta de lecturas, agregue 100 μL de solución de sustrato de Renilla y escanee nuevamente. Divida la señal de luciferasa por la señal de Renilla para tener en cuenta la eficiencia de la transfección. Compare las señales de luciferasa normalizadas para la eficiencia de la transfección (p. ej., compare la señal de las muestras iluminadas con luz roja y la luz roja lejana).

Representative Results

Una vez que se ensambla el circuito de alimentación, la fuente de alimentación, el interruptor de alimentación, los POT y un LED (hasta la Figura complementaria 21), se puede probar el circuito. Con todos los POTs en su lugar, el POT controlará la intensidad del LED. Una vez que se completa el montaje hasta la Figura Suplementaria 29, el sistema se puede utilizar manualmente para optogenética u otras aplicaciones. Toda la alimentación del sistema se puede controlar manualmente con el interruptor de encendido. La intensidad de cada LED se puede controlar de forma independiente utilizando el POT conectado a cada circuito. Después de instalar el software y programar el microcontrolador, la interfaz de usuario puede comunicarse con el microcontrolador. Con la interfaz de usuario, los LED se pueden controlar temporalmente de varias maneras: (1) cada LED se puede programar para que permanezca encendido durante un tiempo específico, (2) cada LED se puede programar para pulsar, (3) se puede programar un retraso de inicio global (por ejemplo, al transfectar y brillar la luz 24 h después) (Figura 6B), (4) el tiempo total para que el programa se ejecute después del retraso. Hay dos interfaces de usuario, una con botones más grandes que pueden controlar dos LED a la vez y otra que puede controlar cuatro LED (Figura 5A, B). La interfaz de usuario de dos LED está optimizada para tabletas y es suficiente para controlar los LED rojos y rojos lejanos para muchos experimentos. Para experimentos más grandes, la segunda interfaz de usuario se puede utilizar para controlar hasta cuatro LED. Al inducir la expresión génica, el resultado anticipado depende de varios parámetros. Estos incluyen el tiempo de inducción, los niveles de inducción (por ejemplo, la cantidad de luz o fármaco) y el número de copias de la construcción inducible en la célula. Para mostrar esto, transfectamos el interruptor del gen PhyB junto con diferentes cantidades de ADN reportero (pPK-202) (0.5%, 1%, 2%, 4% y 8% del ADN transfectado) (Figura 6A) e iluminado como se muestra en la Figura 6B. En muestras que contienen PhyB, pero ningún plásmido para producir ficocianobilina (PCB-cromóforo) (es decir, que no responde a la luz), la expresión / permeabilidad del gen de la luciferasa aumenta con la cantidad de ADN reportero (Figura 6C) (P rojo lejano < 0.0001, Regresión lineal seguida de una prueba de Wald), (Red P < 0.0001, Regresión lineal seguida de una prueba de Wald). Además, cuando todo el interruptor del gen PhyB, incluido el plásmido productor del cromóforo PCB (células sensibles a la luz), se ilumina para la luz roja lejana, la expresión de luciferasa también aumenta con el aumento de las cantidades de construcción del reportero en la mezcla de transfección (Figura 6C, D) (luz roja lejana P < 0.0001, regresión lineal seguida de una prueba de Wald). Del mismo modo, cuando las células sensibles a la luz se iluminan con luz roja, la expresión de luciferasa también aumenta con el aumento de la cantidad de reporteros (P < 0.0001, regresión lineal seguida de una prueba de Wald). Al comparar los niveles de inducción de las células tratadas con luz roja con las células tratadas con luz roja lejana, encontramos una pequeña disminución en la activación del pliegue con el aumento de la cantidad de reportero (Figura 6E) (P = 0.0141, Regresión lineal seguida de una prueba de Wald). Figura 1: Un circuito básico para un solo LED. (A) Un diagrama de flujo que muestra una visión general de los pasos necesarios para construir el sistema de iluminación LED. (B) El sistema de control de iluminación LED. (izquierda) Caja de control para regular la intensidad y el tiempo del LED. (medio) Una tableta de PC que ejecuta la interfaz de usuario para controlar los LED. (derecha) Una caja negra para montar LEDs y colocar celdas para estimulación óptica. (C) Tabla para determinar si el LED requiere un circuito de alto o bajo voltaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Instrucciones para soldar los componentes en su lugar. (A) Un ejemplo de las instrucciones de dibujos animados paso a paso para construir el circuito. (B,C) Instrucciones de ejemplo con imágenes del dispositivo que se está ensamblando. (D) Ejemplo de instrucciones para ensamblar múltiples circuitos simultáneamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Vistas de un sistema de control LED ensamblado. (A) Una vista exterior superior del sistema ensamblado. (B) Una vista interior de un sistema de iluminación LED ensamblado de cuatro LED. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Instrucciones para soldar por reflujo el LED en el disipador térmico. (A) La base del LED y un primer plano de un LED rojo intenso. (B) Colocación de pasta de soldadura en la base del LED. (C) Imagen de LED soldado. Las flechas rojas apuntan a las almohadillas de soldadura. En comparación con el gris antes de la soldadura (A), después de la soldadura, la soldadura parece metálica / brillante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Software para controlar experimentos optogenéticos. (A) Una interfaz de usuario de dos LED con botones grandes para un uso fácil con una tableta económica. (B) Una interfaz de usuario de cuatro LED. Ambas interfaces permiten un control LED independiente. Para pulsar, los LED se pueden programar para que se enciendan y apaguen para anchos de pulso específicos y duraciones específicas. El pulso también puede tener un retraso de inicio y un tiempo de ejecución total predeterminado. (C) La tableta de control LED montada en una incubadora de cultivo celular. (D) Ilustración del sistema del gen PhyB cuando se ilumina con luz roja lejana. La luz roja lejana mantiene el gen en el estado “apagado” u “oscuro”. (E) Ilustración del sistema del gen PhyB cuando se ilumina con luz roja. La luz roja induce la expresión génica al promover la interacción entre PhyB y PIF3. Esta interacción localiza el dominio de activación génica (AD) fusionado a PIF3 al promotor UAS, activando el gen reportero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Resultados anticipados utilizando el sistema LED para controlar PhyB. (A) Un plásmido que codifica PhyB+PIF3 de dos híbridos (pPK-351), un plásmido que codifica enzimas de síntesis de ficocianobilina (PCB-cromóforo) (pPK-352) y un plásmido reportero de luciferasa (pPK-202). (B) Cronología de los experimentos de inducción de luz para C-E. (C) Niveles de transcripción basales (también conocidos como fugas) con cantidades crecientes de ADN reportero. Las muestras de “fugas” no se transfectan con pPK-352 (es decir, no responden a la luz), sino que se iluminan con luz roja o roja lejana. Las muestras de interruptor de luz (LS) incluyen todos los plásmidos de interruptores de genes de luz y se iluminan con luz roja o roja lejana. (D) Niveles de inducción de luz en respuesta a la luz roja y roja lejana. (LS-Far-red light es el mismo dato en C y D.) (E) Inducción de plegado de luciferasa en células iluminadas con luz roja / luz roja lejana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  Haga clic aquí para descargar las Figuras suplementarias 1-39. Figura complementaria 1: Circuito de controlador electrónico para múltiples LED. (A) El diagrama de circuito para un solo sistema LED. (B) El diagrama de circuito para un sistema de cuatro LED. Figura complementaria 2: Colocación del circuito Interconexiones. (A) Sujete su placa PCB a sus manos amigas. (B) Posición de los puentes del circuito principal en los orificios pasantes de la imagen. (C) Diagrama de conectores de cable que mapean las coordenadas. Para los cuatro sistemas LED, dibuje líneas que dividan cada circuito como se muestra (líneas verticales negras). La figura complementaria 31-38 describe el ensamblaje de cuatro circuitos simultáneamente. Figura complementaria 3: Soldar los cables en la PCB. (A) Doblar los puentes para que hagan contacto directo con la PCB y permanezcan en su lugar mientras sueldan. (B) Otra vista de los cables doblados. (C) Cables después de la soldadura. (D) Alambres recortados en la PCB. (E) Aislamiento reducido después de calentar con soldadura. (F) Mover el aislamiento a su posición para cubrir el orificio pasante del suelo (flecha azul) (G) Agregar flujo a un extremo o terminal de alambre. Figura complementaria 4: Soldar el regulador de voltaje en su lugar. (A) Mapa de las coordenadas del regulador de voltaje. (B) Colocación del regulador de voltaje. (C) Cables reguladores de voltaje doblados. (D) Terminales reguladores de voltaje después de la soldadura. Figura complementaria 5: Soldar la resistencia R1 en su lugar. (A) Mapa de las coordenadas de la resistencia R1 (820Ω). (B) Tirar de la resistencia a través del cable usando alicates (C) La resistencia tirada cerca de PCB. (D) La resistencia soldada cerca de PCB. Figura suplementaria 6: Soldar el transistor en su lugar. (A) Mapa de las coordenadas y orientación del transistor. (B) Tenga en cuenta la orientación del transistor; la etiqueta de este modelo está orientada hacia el regulador de voltaje (LM317T). Verifique dos veces la especificación del transistor para asegurarse de que el “Emisor”, “Base” y “Colector” estén en los orificios correctos. (C) El transistor con los terminales doblados antes de soldar. Figura complementaria 7: Soldar el conector de cable a cable para el potenciómetro en su lugar (más una resistencia de 560Ω para el circuito de bajo voltaje). (A) Mapa de las coordenadas del conector de cable a cable (más el R3-560Ω si se construye el circuito de bajo voltaje, el conector de cable a cable se coloca en el orificio antes de la resistencia). (B) Un conector hembra de cable a cable. (C) Para facilitar el ajuste de la resistencia y el conector de cable a cable en el orificio pasante, se doblan de 3 a 5 hebras del cable trenzado. (D) Los hilos se cortan con cortadores de alambre lo más cerca posible del aislamiento. (E) Insertado cable rojo de un conector hembra de cable a cable a través del orificio pasante a5 (para el circuito de bajo voltaje inserte R3 a través del mismo orificio pasante). (F) Vista inferior de la resistencia y el conector de cable a cable antes de soldar. (G) Imagen de la resistencia R3 soldada conectada a tierra (F = Hembra). Figura complementaria 8: Soldar el conector de cable a cable para el potenciómetro a tierra. (A) Mapa de las coordenadas de la conexión a tierra para el conector de cable a cable del potenciómetro. (B) Vista superior del conector de cable a cable del potenciómetro en paralelo con R3 (F = Hembra). Figura complementaria 9: Soldar el microcontrolador y los conectores LED de cable a cable. (A) Mapa de las coordenadas del conector de cable a cable para conectar el 2N222A y la tierra al microcontrolador. (B) Conector macho soldado de cable a cable. (C) Vista superior de (B). (D) Mapa de las coordenadas del conector hembra de cable a cable para conectar la entrada del circuito y la tierra al LED. (E) Conector hembra soldado de cable a cable (F = Hembra, M = Macho). Figura complementaria 10: Soldadura del puente para el circuito de alimentación. (A) Mapa de las coordenadas del puente naranja para conectar la fuente de alimentación al suelo. (B) El jersey naranja soldado en su lugar. (C) La vista inferior del puente soldado en su lugar. Figura complementaria 11: Soldar el interruptor de alimentación y los conectores cable a cable de la fuente de alimentación. (A) Mapa de las coordenadas del conector hembra de cable a cable para conectar el interruptor de alimentación. (B) El conector hembra de cable a cable soldado en su lugar. (C) Otra opinión de (B). (D) Mapa de las coordenadas del conector macho de cable a cable para conectar la fuente de alimentación. (E) Conector macho soldado de cable a cable. (F) Otra visión de (E) (F = Mujer, M = Hombre). Figura complementaria 12: Conexión de la fuente de alimentación a un conector macho de cable a cable. (A) La fuente de alimentación no modificada. (B) Cortar los cables de suministro de energía. (C) Los cables de suministro de energía pelados y con exceso de aislamiento cortado. (D) Colocación de tubo retráctil alrededor de los cables de alimentación. Tubo que separa las dos conexiones (flechas rojas) y tubo para sujetar los cables separados (flecha amarilla). (E) Cables trenzados que conectan la fuente de alimentación al conector hembra de cable a cable. Figura complementaria 13: Soldadura y aislamiento de la conexión de la fuente de alimentación a un conector macho de cable a cable. (A) La conexión soldada entre la toma de tierra de la fuente de alimentación y un conector hembra de cable a cable. (B) La conexión soldada entre el terminal positivo de la fuente de alimentación y un conector hembra de cable a cable. (C) Tubo retráctil tirado sobre las conexiones individuales soldadas (flecha roja). (D) Ambas conexiones de fuente de alimentación soldadas y con tubo retráctil tratado térmicamente. (E) Colocación del tubo retráctil sobre conexiones individuales (flecha amarilla). (F) Fuente de alimentación completa. Figura complementaria 14: Soldar el interruptor de alimentación a un conector macho de cable a cable. (A) Interruptor de encendido con cables pelados y tubo retráctil colocado sobre los cables (flechas rojas). (B) Cables que conectan el interruptor y el conector macho de cable a cable trenzados antes de soldar. (C) Colocar el tubo retráctil sobre las conexiones soldadas. (D) Conexiones cubiertas con el tubo retráctil tratado térmicamente. (E) Un interruptor de alimentación ensamblado con un conector macho de cable a cable. Figura complementaria 15: Cableado de un potenciómetro a un conector macho de cable a cable. (A) Las partes del potenciómetro. (B) Un conector macho de cable a cable retorcido y doblado para enganchar alrededor del terminal central del potenciómetro. (C) Un conector macho de cable a cable retorcido alrededor del terminal central del potenciómetro. (D) Conexiones soldadas de cable a cable. (E) Flecha roja que apunta a la pestaña de metal antes de retirarla. (F) El potenciómetro después de la extracción de la lengüeta metálica. Figura complementaria 16: Cableado de la conexión del microcontrolador. (A) Cables para conectores hembra de alambre a cable pelados y cortados en preparación para el engarzado. (B) Colocación del engarce en el conector de cable a cable. (C) Engarzado del conector de cable a cable. (D) Conector de alambre a cable engarzado. (E) Conexión de microcontrolador completamente ensamblada. Figura complementaria 17: Cables de soldadura y LED en la base del LED Parte 1. (A) Materiales necesarios para soldar el LED a la base del LED. (B) Estañado de la punta del alambre pelado. (C) Aplicar flujo sobre el contacto de la base del LED. (D) Agregar soldadura a la punta de soldadura grande para estañar la base del LED. (E) Colocación de soldadura en el contacto para calentar la base del LED. (F) La base del LED después de arrastrar la punta de soldadura a través del contacto. (G) El mismo procedimiento en el otro contacto. Figura complementaria 18: Cables de soldadura y LED en la base del LED Parte 2. (A) Un alambre estañado enganchado al contacto usando una pinza para el cabello. Tenga en cuenta que el cable negro está soldado al cátodo “C-“. (B) Adición de una cantidad generosa de soldadura a la punta de soldadura. (C) La punta de soldadura presionando hacia abajo sobre el cable, derritiendo la soldadura en la base del LED y el cable. (D) Sujetar el cable para que permanezca en su lugar cuando se retire el soldador. (E) Mantener el alambre en su lugar hasta que la soldadura se endurezca. Figura complementaria 19: Cables de soldadura y LED en la base del LED Parte 3. (A) Usar una punta afilada para colocar pasta de soldadura en la base del LED para montar el LED. (B) La base LED con la pasta de soldadura en su lugar. (C) Colocación del LED en la base del LED de tal manera que los contactos del LED y la base del LED coincidan. Figura complementaria 20: Cables de soldadura y LED en la base del LED Parte 4. (A) El alambre negro todavía enganchado al contacto por la pinza para el cabello. (B,C) Usando una segunda pinza para el cabello, el cable rojo se mantiene en su lugar. Tenga en cuenta que el cable rojo está soldado al ánodo “A +”. (D) Adición de una cantidad generosa de soldadura a la punta de soldadura. (E) La punta de soldadura presionando hacia abajo sobre el cable, derritiendo la soldadura en la base del LED y el cable, así como la pasta de soldadura debajo del LED. (F) La base de LED caliente se enfría después de la soldadura. (G) La base del LED con los cables y el LED soldados. (H,I) Las flechas rojas apuntan a las almohadillas de soldadura. Después de la soldadura, la soldadura aparece metálica/brillante (en comparación con el gris antes de la soldadura (Figura suplementaria 16D)). Figura complementaria 21: Conexión del cable LED a un conector macho de cable a cable. (A) Cables pelados y conector macho de cable a cable junto al tubo retráctil cortado por la mitad (1/8 de pulgada y 3/16 de pulgada). (B) Colocación del tubo retráctil sobre los cables antes de soldar. (C) Alambres retorcidos juntos antes de soldar. (D) La conexión soldada del cable al conector de cable a cable. (E) Tanto los cables rojo como el negro soldados juntos. (F) Colocación del tubo retráctil de 1/8 de pulgada sobre la conexión soldada. (G) El tubo retráctil después de encogerse con la pistola de calor. (H) Colocación del tubo retráctil de 3/16 pulgadas sobre el tubo retráctil más pequeño. (I) La conexión soldada y sellada con el tubo retráctil. Figura complementaria 22: Fijación de los cables y LED a la base del LED con epoxi. (A) Usar un aplicador de madera para colocar epoxi en la base del LED. Se coloca una cinta debajo para atrapar cualquier epoxi que gotea. (B) El epoxi se extiende uniformemente sobre toda la superficie. (C) El LED se deja durante la noche para curar. Figura complementaria 23: Montaje de LEDs dentro de la tapa de una caja. (A) Un LED con una pieza de cierre táctil unida para facilitar el montaje. (B) LEDs de diferentes colores montados en el interior de una caja negra usando un cierre táctil. (C) Una muesca en la tapa de la caja negra hecha por una herramienta giratoria de alta velocidad para hacer espacio para el cable LED. (D) Una caja negra para estimular las celdas con sujetadores táctiles para montar el LED. (E) Colocación de un plato multipocillo dentro de la versión de cierre táctil de la caja LED. Figura complementaria 24: Montaje de LEDs fuera de la tapa de una caja. (A) Agujero perforado en la tapa de la caja negra con una muesca de la herramienta giratoria de alta velocidad para hacer espacio para el cable (flecha roja). (B) LED colocado en el orificio con el cable en la muesca, mantenido en su lugar con cinta aislante. (C) Se utilizan dos piezas más de cinta para asegurar el LED. La parte posterior del disipador de calor está expuesta para maximizar el intercambio de calor. (D) Película de privacidad pegada con cinta adhesiva sobre el orificio donde se colocará el LED. La flecha roja apunta a la película de privacidad. (E) Una caja negra para estimular las células con un LED montado fuera de la caja y con película de privacidad para difundir la iluminación. (F) Colocación de un plato multipocillo dentro de la versión LED externa + película de privacidad de la caja LED. Figura complementaria 25: Taladrar agujeros en la tapa de la caja para el interruptor de encendido y los potenciómetros. (A) Un dibujo CAD con dimensiones anotadas de la tapa de la caja. (B) La tapa de la caja con el potenciómetro y los orificios del interruptor de encendido. Figura complementaria 26: Preparación del orificio de salida del alambre. (A) Un dibujo CAD con dimensiones anotadas. (B) Imagen del orificio perforado con la broca. (C) Alisado del orificio de salida con una herramienta rotativa de alta velocidad o una herramienta de limado. (D) Colocación de arandelas en el orificio de salida. Figura complementaria 27: Colocación del microcontrolador y la PCB en la caja. (A) El soporte del microcontrolador (naranja) y los soportes de PCB dentro de la caja. (B) El microcontrolador y la PCB asegurados en la caja. Figura complementaria 28: Colocación de los potenciómetros y del interruptor de alimentación. (A) Una vista frontal de la tapa de una caja con un interruptor de encendido y cuatro POT. (B) Una vista frontal de la tapa de la caja con perillas de potenciómetro agregadas. (C) Una vista trasera de la tapa de la caja con los componentes adjuntos. Figura complementaria 29: El sistema de control LED ensamblado. (A) Una caja de control abierta con los cables etiquetados con una impresora de etiquetas y cremallera atados para la organización. (B) La caja una vez que esté completamente ensamblada con cada POT etiquetado junto con el PIN. Figura complementaria 30: Colocación del conector de alambre a cable engarzado. (A) Imagen de los conectores de alambre a cable engarzados para un sistema de cuatro microcontroladores LED. (B) Colocación del conector engarzado en los puertos del microcontrolador. Figura complementaria 31: Colocación de los cables puente. (A) Una placa de circuito con las coordenadas de los cables de puente rojo etiquetados. (B) Una placa de circuito con las coordenadas de los cables de puente amarillos etiquetados. Figura complementaria 32: Colocación de los cables de puente. Una placa de circuito que muestra las coordenadas de los cables de puente amarillos. Figura complementaria 33: Adición de los reguladores de tensión. Los reguladores de voltaje LM317T se agregan al circuito con sus coordenadas etiquetadas en los diagramas. Figura complementaria 34: Inserción de las resistencias 820Ω. Las resistencias R1 se agregan al circuito con sus coordenadas etiquetadas en los diagramas. Figura complementaria 35: Inserción de los transistores. Los transistores 2N2222A se agregan al circuito con sus coordenadas etiquetadas en los diagramas. Figura complementaria 36: Inserción de los conectores hembra de cable a cable y resistencias (opcional) para la conexión POT. Los cables y resistencias se agregan al circuito con sus coordenadas etiquetadas en los diagramas. (A) Inserte el cable rojo, seguido de la resistencia R2 (560Ω) (solo para el circuito de bajo voltaje). (B) Inserte el otro extremo de la resistencia en el orificio de tierra indicado. (C) Inserte los cables negros en los orificios marcados para conectarlos a tierra. Nota: R2 (560Ω) es paralelo al potenciómetro. Figura complementaria 37: Inserción de conectores macho de cable a cable para la conexión del microcontrolador y la fuente de alimentación. Los cables se agregan al circuito con sus coordenadas etiquetadas en los diagramas. (A) Inserte los cables rojos en los orificios indicados. (B) Inserte los alambres negros en los orificios marcados. Figura complementaria 38: Adición de conectores LED de cable a cable. (A) Conectores hembra de cable a cable con las coordenadas rojas del cable resaltadas. (B) Conector hembra de cable a cable con las coordenadas de cable negras resaltadas. Figura complementaria 39: Configuración de un experimento de cambio de genes PhyB-PIF3. (A) Una tabla de ejemplo de una mezcla maestra que contiene Renilla para el control interno. (B) Una tabla de ejemplo para configurar la mezcla de ADN para un ensayo informador de doble luciferasa de un experimento optogenético PhyB-PIF3. (C) Una tabla de ejemplo para configurar el reactivo de transfección de PEI y alícuota la mezcla en las células (gota). (D) Colocación del medidor de luz para ajustar el brillo del LED.

Discussion

El sistema LED descrito aquí se ha utilizado en nuestro laboratorio para optimizar, caracterizar y trabajar con varias herramientas optogenéticas. En Kyriakakis et al.4, probamos muchas combinaciones de interruptores genéticos PhyB-PIF en paralelo. Luego utilizamos este sistema para probar pulsos de luz a diferentes frecuencias para medir la cinética del cambio genético y la intensidad efectiva de la luz. Este sistema también fue utilizado para optimizar y caracterizar dos sistemas optogenéticos que utilizan luz azul para la estimulación 5,6. Dado que solo un LED necesitaba ser lo suficientemente brillante como para activar la mayoría de las herramientas optogenéticas, no siempre es necesario comprar un sistema con un gran número de LED sobre cada pozo. Esta configuración es económica, confiable, fácil de reconfigurar y no requiere experiencia eléctrica previa para seguir el protocolo de ensamblaje.

En las figuras suplementarias 31-38, describimos cómo incorporar hasta cuatro LED en el sistema. Si bien esto puede limitar algunos experimentos que requieren una gran cantidad de condiciones paralelas, se pueden agregar más LED reemplazando la fuente de alimentación de 9 voltios utilizada en este protocolo por una de mayor potencia. Del mismo modo, se pueden conectar varios LED de menor potencia en paralelo a cada circuito. En esta última disposición, algunos LED no se controlarán individualmente, pero esto puede ser útil cuando se requieren muchos LED para cubrir un área más grande. Una vez familiarizado con la electrónica de este sistema, hay muchas maneras de personalizarlo. Las estrategias adicionales para personalizar el sistema incluyen colocar el LED más lejos o más cerca de la muestra e iluminar a través de filtros / difusores para condiciones de iluminación homogéneas o para evitar el calentamiento como en (Figura complementaria 23) y Allen et al.5. Otra característica notable de nuestro diseño LED es que está encapsulado en epoxi y tiene un cierre táctil en la parte posterior; esto permite que el LED se coloque de forma segura y fácil prácticamente en cualquier lugar: en incubadoras, peceras, jaulas de animales, paredes, etc.

Muchos experimentos que utilizan la optogenética para controlar genes, vías de señalización y otras actividades celulares a menudo requieren pulsaciones, abarcan grandes escalas de tiempo o deben realizarse en una incubadora, por lo tanto, requieren automatización o manipulación remota sin un microscopio. Este sistema LED ha sido probado continuamente durante varios meses dentro de una incubadora humidificada deCO2 sin ningún problema. Además, con sistemas reversibles como los sistemas optogenéticos PhyB, el experimentador puede necesitar programar programas específicos de iluminación pulsante. En nuestro trabajo anterior4, utilizamos programas pulsantes para probar la dinámica de reversibilidad de un interruptor PhyB-PIF3 en células de mamíferos a través de la interfaz de usuario. Utilizando la metodología descrita en este manuscrito, programar un protocolo pulsante es fácil, proporcionando la flexibilidad y autonomía necesarias para muchos tipos de experimentos optogenéticos de una manera fácil de usar.

Los pasos más críticos en la construcción de este sistema incluyen armar el circuito eléctrico en la placa PCB y conectar los componentes, que se detallan en la sección 1 y la sección 2. Es esencial seguir cuidadosamente cada paso en estas secciones y verificar los números de estenopeicos línea por línea antes de soldar cada componente. La Sección 2 explica cómo configurar los componentes que se conectarán al circuito. Para que los componentes se conecten en la orientación correcta, es particularmente importante asegurarse de que los colores de los cables negros y rojos en los conectores de cable a cable coincidan. Es muy probable que pequeños descuidos en estas dos secciones afecten la funcionalidad del sistema. De hecho, el primer paso para solucionar este método será verificar que el circuito se construyó correctamente y que todas las conexiones están en su lugar. En segundo lugar, es de particular importancia verificar la calidad de la soldadura para conexiones sueltas y los cables para quemar los cables que pueden estar cortocircuitando el circuito. Un tercer paso sería asegurarse de que los LED funcionan correctamente, lo que se puede hacer utilizando una fuente de alimentación o una batería de 1,5 V recortando los dos terminales del LED con pinzas de cocodrilo. Otra consideración potencialmente crítica es evitar el calentamiento (cuando se usan los LED a alta potencia) o difundir la luz para una iluminación más amplia. Para abordar estas consideraciones, los LED se pueden montar fuera de una caja negra con “película de privacidad” en el interior, como se describe en la Figura complementaria 23 y Allen et al.5. Debido a la simplicidad de este sistema, desmontarlo para verificar, modificar, actualizar o reparar componentes modulares no es difícil.

Otro factor crítico para los sistemas de genes inducibles es considerar cuánta activación se requiere o cuánta fuga es aceptable para el sistema biológico que se está controlando. Como se muestra en la Figura 6, estos pueden variar con la cantidad de ADN del reportero. Además, la eficiencia de transfección y, por lo tanto, el número de copias de las construcciones del reportero en cada celda variarán. Puede ser ventajoso para algunos experimentos hacer una línea celular con una cantidad fija de componentes de interruptor de gen reportero o PhyB y detectar clones con el rango deseado de expresión inducida, como se hace comúnmente con los sistemas inducibles por fármacos. Debido al tamaño y la inestabilidad del plásmido lentiviral pPK-2304, también hicimos versiones plásmidas no lentivirales del interruptor PhyB en la columna vertebral pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) y pPK-352 (Addgene #157922).

Al construir este sistema de iluminación LED siguiendo este protocolo, los usuarios tienen todos los componentes necesarios para realizar una amplia gama de experimentos optogenéticos in vitro e in vivo. Combinado con las instrucciones para usar PhyB-PIF3 en células de mamíferos, este protocolo permitirá a los no ingenieros y biólogos, de manera flexible y efectiva, utilizar la optogenética basada en PhyB en una variedad de contextos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang y Molly Allen por probar diferentes versiones del sistema LED a medida que se desarrollaba. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Kavli para el Cerebro y la Mente en UC San Diego y el Instituto Salk, Fundación Nacional de Ciencias a través del Centro NSF para la Ciencia de la Información bajo la subvención CCF-0939370, la subvención NS060847 de los NIH y la subvención R21DC018237 de los NIH.

Materials

18AWG 2pin RED Black wire Amazon 15M-28AWG-2468 Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit.
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1K Ohm potentiometer Amazon 52161500 2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob.
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560 ohm 1/2watt 1% tolerance Amazon a14051600ux0301 Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W.
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820 ohm 1/2watt 1% tolerance Amazon TTL-A-8035-50Ea Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W).
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Cyan LED Digikey LXML-PE01-0070 LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
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Electrical tape – 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack Amazon 03429NA Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft.
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Farred LED 720nm Luxeon Star LEDs LXML-PF01 Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW
Farred LED 740nm Ushio EDC740D-1100-S5 Uses "STAR XP 3535" base
https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf
Farred LED 780nm Ushio EDC780D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf
Farred LED 810nm Ushio EDC810D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf
Farred LED 850nm Ushio EDC850D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf
Grommets Amazon Pico 6120D These are very common and there are many equivalents.
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LED base Luxeon Star LEDs LXB-RS20A Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs
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LED PCB fopr Ushio LEDs Adura LED solutions STAR XP 3535 Package LED Fits many other LEDs by Ushio
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Power switch Rocker Switch Amazon SIXQJZML These are very common and there are many equivalents.
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Red LED Digikey LXM3-PD01 LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
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Sandpaper Amazon B002NEV6GS 3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch.
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Solder for soldering wires and circuit components Amazon Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) These are very common and there are many equivalents.
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Solder-able Breadboard for building the circuit Amazon GK1007 Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007.
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Spade drill bit Amazon Irwin 88811 These are very common and there are many equivalents.
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Transistor Newark 2N2222A Can buy from many places.
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Voltage regulator Newark LM317T Equivilent to NTE956.
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Windows 10 tablet Amazon B08BYTT79Y Any Windows 10 PC will do.
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Cell Culture Reagents
Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 ATCC ATCC CRL-1573 Common Cell line.
https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 26140079 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose ThermoFisher 11965−092 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118
10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin ThermoFisher 15140122 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122
White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates ThermoFisher 07-200-589 White plates are preferred. Do not use clear plates.
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PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) PolySciences 24765-1 Can be replaced with another transfection reagent.
https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/
Name of Equipment
Diagonal Cutting Plier (110mm) Amazon Proskit 1PK-037S These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11
Dremil 3000 with cutting tool and grinder Amazon Dremel 3000 Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver.
https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3
Dremil cutting and grinding tool Amazon Dremel 200-1/15 Any similar Dremil will work.
https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Dremil grinding tip Amazon Dremel 84922 Silicon Carbide Grinding Stone.
https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922
EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT Amazon DS017 For removing solder/mistakes.
https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI
Helping Hand with Magnifying Glass Amazon SE MZ101B These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch
Pointed Nose Micro Pliers Amazon Hakko CHP PN-20-M Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose.
https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Small screw drivers Amazon Wiha 26197 These are very common and there are many equivalents.
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Soldering iron Amazon Yihua 939D+ Digital Soldering Station These are very common and there are many equivalents.
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TraceTech No-Clean Flux Pen Amazon 2507-N Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL.
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Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber Amazon WSA350 For soldering safety.
https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK
Wire strippers Amazon CSP-30-7 These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG
IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG Amazon IWS-3220M These are very common and there are many equivalents.
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