光遺伝学的実験のための簡便で汎用性の高い照明システムの構築
Summary
このプロトコルは、PhyBおよびPIF3を使用して赤色および遠赤色光で遺伝子発現を制御するための光遺伝学的実験を実行する方法について説明しています。コンピュータで遺伝子発現やその他の光遺伝学の制御を可能にするシンプルで柔軟な照明システムを構築するためのステップバイステップの説明が含まれています。
Abstract
光を使用して生物学的プロセスを制御することで、研究者が多くの生物学的プロセスを操作できる精度と速度が向上しました。光学制御は、前例のない機能を解剖する能力を可能にし、新しい遺伝子治療を可能にする可能性を秘めています。ただし、光遺伝学的実験には、空間的、時間的、または強度制御を備えた適切な光源が必要であり、多くの場合、研究者にとってボトルネックになります。ここでは、利用可能なさまざまな光遺伝学的ツール用に簡単にカスタマイズできる低コストで用途の広いLED照明システムを構築する方法について詳しく説明します。このシステムは、調整可能なLED強度を備えた手動またはコンピュータ制御用に構成可能です。回路を構築し、コンピュータ制御にし、LEDを構築するための図解されたステップバイステップガイドを提供します。このデバイスの組み立てを容易にするために、いくつかの基本的なはんだ付け技術について説明し、LEDの制御に使用される回路についても説明します。オープンソースのユーザーインターフェイスを使用して、ユーザーはパーソナルコンピューター(PC)または安価なタブレットで光の正確なタイミングとパルスを自動化できます。この自動化により、LEDを用いて遺伝子やシグナル伝達経路など、大きな時間スケールにわたる細胞活動を制御する実験に有用です。このプロトコルでは、必要なすべての部品を構築したり、照明システムを使用して光遺伝学的実験を実行したりするために、エレクトロニクスに関する事前の専門知識は必要ありません。
Introduction
光遺伝学的ツールはユビキタスになりつつあり、遺伝子発現、細胞シグナル伝達などの生物学的プロセスを光学的に制御するための新しい技術が絶えず開発されています1,2,3。光で細胞プロセスを制御する能力は、光強度と露光時間によって制御できる高速動力学、厳密な空間制御、および線量依存的な調節を可能にします。これらのツールを使用するには、これらのパラメータを制御するデバイスが必要です。我々は最近、遺伝的にコードされたPhyB-PIF3哺乳類遺伝子スイッチを開発し、赤色光と遠赤色光を用いて遺伝子を可逆的に活性化および不活性化する4。このシステムは、いくつかの哺乳類細胞株でテストされ、光のパルスを含む非常に少量の光でも、比類のない遺伝子発現の誘導を可能にしました。PhyBスイッチおよび類似のツール5,6の使用を希望する研究者は、照明強度および持続時間を制御する方法に関する情報を頻繁に要求する。したがって、私たちは、光遺伝学のためのこれらのツールのより広い採用を可能にするために、段階的な指示でこのプロトコルを開発しました。
LEDが広く使用される前は、フィトクロム7などの光応答性タンパク質を研究するために、フィルター付きの広帯域光源が使用されていました。最近、いくつかのLED照明システムが光遺伝学的ツール8,9,10,11,12とともに公開されていますが、これらのプロトコルは、電子機器/ソフトウェアの重要な専門知識を必要とする場合、特殊な機器(3Dプリンター、レーザー切断機、フォトマスクなど)を必要とする場合、または一部の研究者が研究ニーズに合わせて展開する必要がある段階的な指示を提供しない場合があります。マルチウェルプレート内の個々のウェルの独立した制御は有用ですが、研究者が明暗または赤色光と遠赤色光で複数の異なるサンプルを比較するだけでよい場合は、多くの場合不要です。また、多くの既存の商用システムは高価であり、カスタマイズ機能は限られています。ただし、このプロトコルで説明されているLEDは、費用効果が高く、明るく、さまざまな方法で取り付けることができます。したがって、それらはいくつかの異なるタイプのサンプルを照らすために使用することができます。プロトコルと付属のソフトウェアを使用すると、紫外線(UV)からNIRまでのLEDをソフトウェアで使用および制御して、UVR813,14、Dronpa 15,16、LOVドメイン17,18、ステップファンクションオプシン19,20、CRY2 21,22、PhyB 4,23,24を使用した光遺伝学的実験を実行できます。、25、バクテリアフィトクロム26、27、28、29および他の光応答系30、31、32。
このプロトコルは、光刺激のさまざまなパラメータを制御するために必要な回路やその他のハードウェア、および光遺伝学的実験を実行するための分子/細胞ツールを組み立てるためのチュートリアルを構成します。さらに、Kyriakakisら4 から最適化されたプラスミドのうち、より小さく、クローニングに対してより安定なプラスミドを報告しています。このプロトコルを通じて、電子工学や光学の専門知識を持たない生物学者は、柔軟で堅牢な照明システムを構築できます。ステップバイステップで、LEDシステムを構築する方法を示し、光遺伝学的ツールのより広範な採用のための技術的なボトルネックを取り除きます。このシステムは、ワイヤーポートを備えていなくても、ほとんどの細胞培養インキュベーターで簡単に使用できます。たとえば、LEDシステムを加湿したCO2 インキュベーターに6か月以上連続して保管し、性能を低下させていません。また、LEDシステムをコンピュータに接続し、GitHub(https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces)で提供しているオープンソースソフトウェアとインターフェースする方法についても説明します。このプロトコルを使用してシステムを構築することで、研究者は潜在的な問題をデバッグし、部品を交換し、機能を改善/拡張するための基本的な知識を得ることができます。
システム概要
照明システムの構築には、(1)電子回路の構築、(2)周辺機器(電源コード、電源スイッチなど)の構築、(3)LEDの構築、(4)これらすべてのコンポーネントの組み立て、および(5)ユーザーインターフェイスでLEDを制御するソフトウェアのインストールが含まれます(図1A)。完成すると、照明システムはユーザーインターフェイスを使用して最大4つのLEDを個別に制御できます(図1B)。ユーザーインターフェイスにより、各LEDを指定された時間間隔でパルスし、指定された時間後にシャットオフすることができます。指定した時間に照明プログラムを開始するための開始遅延もあります。ポテンショメータ(POT)は、各LEDの強度を個別に調整するか、コンピュータなしで手動LED制御に使用できます。LEDへのワイヤは任意のカスタム長さにすることができ、インキュベーターまたはラボスペースに簡単に配置できます。これらのLEDは高出力であるため、離れた場所から1つのLEDで広い領域を照らすために使用できます。
LED ドライバの説明
LEDの強度に電力を供給して制御するために、このプロトコルは「LEDドライバ」を構築するための手順を実行します。各LEDには、動作する電圧範囲があります(図1C)。動作中、光強度を制御するレギュレータの出力電圧は、ポテンショメータによって調整できます。POTは抵抗を変化させ、出力電圧/輝度を調整します。1kΩ(1キロオーム)のPOTでチューニングすると、「高電圧回路」と呼ばれるものが得られ、範囲は1.35V〜2.9Vになります。 2.9Vは低電圧LEDを動作させるには高すぎるため(図1C)、低電圧LEDに一致するように範囲を制限する単一の変更(抵抗3または「R3」 補足図1A)を示します。R3は、ポテンショメータと並列に接続した場合、LEDに印加される最大電圧を1.85V( 補足図8に示すアセンブリ)に低下させる役割を果たします。電流の代わりに電圧を使用して輝度を制御することにより、システムは異なる動作電圧のLEDに対してより柔軟になります。 図1C には、最適な回路選択をガイドする高電圧LEDと低電圧LEDのリストが含まれています。この設計では、ポテンショメータがオフのときにLEDが完全にオフになり、電圧がLEDの標準動作電圧を超えることがないように、最小電圧を十分に低く保ちます。PhyBオプトジェネティクスには、低電圧回路を使用する深赤色および遠赤色LEDを使用します。
LEDコンピュータ制御システムの説明
LED照明システムは、コンピュータやマイクロコントローラなしで一定の照明に使用できます。ただし、パルスプログラムや個々のLEDタイミングの制御には、マイクロコントローラをインストールする必要があります。マイクロコントローラを使用してLEDを制御するには、マイクロコントローラを回路に接続するためのトランジスタが必要です。このトランジスタは、マイクロコントローラからの電圧を検出し、導電性または絶縁性から切り替わります。「オン」と「オフ」を制御するために、R2の両端で制御可能なシャントとして「NPNスイッチングタイプトランジスタ」(2N2222)と呼ばれるものを使用します(補足図1A)。マイクロコントローラからの電圧がトランジスタベースに印加されると、トランジスタは導電性になり、LED電圧を低くしてLEDをオフにします。したがって、LEDとトランジスタのオンとオフの状態は、PCにインストールされているソフトウェアによって制御されるマイクロコントローラによって直接制御されます。
照明システムを作るには、次の手順が必要です:電気回路を構築します。電源、手動電源スイッチ、POT、およびマイクロコントローラー接続を構築します。LEDを構築します。照明システムに適合するようにブラックボックスを収容します。すべての配線とデバイスを接続します。LED制御ソフトウェアをインストールし、細胞を光で刺激します。デュアルルシフェラーゼアッセイを使用して遺伝子発現を測定します。
Protocol
1.電気回路を構築します メモ: ここでは、使用可能な LED 用の単一回路を構築するためのプロトコルについて説明します。これを最大 4 つの LED に拡張する手順は、補足情報に含まれています。 吸煙剤とはんだごての電源を入れます。拭き取りスポンジに水を加え、はんだを手元に置いてください。注意: 煙を取り除き、火傷を防ぐために、安全対策を講じてください。 回路コンポーネントのプリント回路基板(PCBボード)へのはんだ付けを、補足パネルに示されている順序で開始します。注意: はんだごての先端に少量のはんだを使用して、最初にコンポーネントとPCBボードの金属を加熱し、追加のはんだをコンポーネントに直接溶かします。フラックスは大いに役立ちます。 はんだジャンパーワイヤとコンポーネント(補足図2および補足図3)。ジャンパ線(回路基板上の2点を接続する絶縁配線)には、ジャンパキットのオレンジ(7.6 mm(0.3 インチ))と黄色(12 mm(0.4インチ))の2本のワイヤを使用します。 PCBボードを「ヘルプハンド」にクリップし、ジャンパ線を次のピンホールに挿入し、端子を45度曲げて磁束を追加します(図2、補足図2、補足図3): a1およびa3→アース(-)(オレンジ)、a7→電源(+)#7(黄色)、d2→d6(黄色)。 ワイヤーの背面をはんだ付けしてからトリミングします。 LM317T電圧レギュレータを次のピンホールに挿入し、ピンを曲げて磁束を追加します(図2 および 補足図4)。 調整→e5、Vはe6→、Vは →e7です 。 最初に左右の端子をはんだ付けし、トリミングしてから、中央の端子をはんだ付けしてトリミングします。 回路の低電圧範囲を設定するには、820 Ω抵抗をピンホール、はんだ付け、およびc2→c5に完全に挿入します(図2 および 補足図5)。 マイクロコントローラによるLED制御を有効にするには、トランジスタをb3–b5に挿入します(図2 および 補足図6):コレクタ→b3、ベース→b4、エミッタ→b5。注意: 正しく挿入するトランジスタの向きに注意してください。仕様をチェックして、コレクタ、ベース、エミッタの指定を確認してください。 POT、LED、マイクロコントローラ、および電源用の電線対電線コネクタをはんだ付けします。メモ: 電線対電線コネクタの色、およびメス電線対電線コネクタを使用しているかどうかに注意してください。目的のLEDに「低電圧」回路と「高電圧」回路のどちらが必要かを判断します(図1C)。メモ: LEDが「低電圧」リストにある場合は、POTと並列の抵抗が必要です。 「低電圧」または「高電圧」回路の場合は、メスの電線対電線コネクタから穴a5にワイヤを配置します(補足図7)。低電圧回路を作成する場合は、まだ所定の位置にはんだ付けしないでください。注意: 小さなワイヤーの毛が剥がれ落ちないように、裸線の端をひねります。ワイヤーが太すぎてほつれずにピンホールを押し通せないと思われる場合は、2〜6本のストランドを切断してから、それらをねじり直します(補足図7B–D)。 「高電圧」回路を作成する場合は、手順1.4.5に進みます。「低電圧」回路を作成する場合は、560Ωの抵抗を同じ穴(a5)に押し込み、電線対電線コネクタのリード線ではんだ付けします。 抵抗のもう一方の端をグランドに接続します(補足図7G)。 はんだ付けされたメス電線対電線コネクタのもう一方の端をアースに接続するa5穴に挿入し、はんだ付けします(補足図8A、B)。 マイクロコントローラ接続の場合は、オス電線対電線コネクタの一方の端を穴a4に挿入し、もう一方の端をグランドに接続された穴に挿入します(補足図9A–C)。 LED接続の場合は、メス電線対電線コネクタの一方の端を穴a2に挿入し、もう一方の端をアースに接続された穴に挿入します(補足図9D、E)。 2.電源、手動電源スイッチ、POT、およびマイクロコントローラー接続を構築します 電源装置を構築します。オレンジ色の[7.6 mm(0.3インチ)]ジャンパをa29からはんだ付けします(補足図10)。 メスの電線対電線コネクタを a30 から電源装置(+)にはんだ付けします(補足図 11A–C)。 オスの電線対電線コネクタをc29からc30にはんだ付けします(補足図11D–F)。 コネクタを電源コードから切り離し、ワイヤを露出させて剥がします(補足図 12A–C)。 フラックスペンを使用してはんだ付けする前に、ワイヤにフラックスを追加します(補足図3G)。 オスの電線対電線コネクタの周りに3.18 mm(1/8インチ)のシュリンクチューブを配置し、電源ケーブルの上に4.76 mm(3/16インチ)の厚い部分を配置します(補足図12D)。 電源装置とオス電線対電線コネクタからのワイヤを一緒にねじり合わせてはんだ付けします(補足図12E、13A、B)。 直径の小さいシュリンクチューブを3.18 mm(1/8インチ)接続部の上に置き、ヒートガンで収縮させます(補足図13C、D)。 小さい方のシュリンクチューブ3.18 mm(1/8インチ)の上に、直径の大きい4.76 mm(3/16インチ)のシュリンクチューブを配置し、再度加熱します(補足図13E、F)。 手動電源スイッチを構築します。シュリンクチューブをスイッチのワイヤの上に3.18 mm(1/8インチ)配置します(補足図14A)。 オス電線対電線コネクタのワイヤをねじってはんだ付けします(補足図14B、C)。 シュリンクチューブをはんだ付けされたセクションの上に3.18 mm(1/8インチ)置き、ヒートガンで収縮させます(補足図14D、E)。 オス電線対電線コネクタをPOTに接続します。電線対電線コネクタの黒い線をPOTの中央の端子に巻き付けます(補足図15B)。 端子にしっかりとループしているワイヤをねじり、はんだ付けします(補足図15C)。注意: 小さな精密ペンチは、きつくねじるのに役立ちます。 補足図15Dのように、端子への赤い線接続で繰り返します。 ペンチを使用して、赤い矢印の近くにある金属製のタブを壊します(補足図15E、F)。 マイクロコントローラ接続を構築します(コンピュータ制御LEDにのみ必要)。複数のLED用のLEDドライバを作成する場合は、1つのメス電線対電線コネクタを除くすべての電線から黒い線を切り取ります(補足図16A)。 図のように電線対電線コネクタの端を圧着します(補足図16B–D)。 圧着された端を長方形のコネクタに通します(補足図16E)。 3. LED を構築する ワイヤーの端(~5 mm)を剥がし、 補足図3Gのようにフラックスペンを使用してフラックスを塗布します。メモ: ワイヤを LED ベースに効率的にはんだ付けするには、LED ベースの接点とワイヤにフラックスを追加する必要があります。 ワイヤーを下から加熱し、上からはんだを追加して、ワイヤーを錫メッキします(補足図17B)。 フラックスペンを使用して、フラックスをLEDベースの表面接点に配置します(補足図17C)。 大きなはんだ付けチップ(~4〜5 mm)にたっぷりのはんだを置き(補足図17D)、それを使用して接点のLEDベースを加熱します(補足図17E)。数秒後、はんだを接点全体にドラッグします(補足図17F)。他の接点で手順3.3〜3.4を繰り返します(補足図17G)。注意: LEDベースははんだ付け中に非常に熱くなることがあります。LEDベースは、溶けたり燃えたりしない面に置きます。 ヘアクリップを使用して、黒いワイヤーを接点「C +」(カソード)にクリップします(補足図18A)。 大きなはんだ付けチップにたっぷりのはんだを置き(補足図18B)、LEDベースのはんだが溶けるまでワイヤに押し下げます(補足図18C)。ワイヤを押したまま(補足図18D)、ワイヤーを所定の位置に保持しながらはんだごてを取り外します(補足図18E)。 LED接続用のパッドに少量のはんだペーストを置き(補足図19A、B)、鉗子を使用してパッドの上にLEDを配置します(補足図19C)。注:配置が少しずれている場合は問題ありません。はんだペーストが溶けると所定の位置に入ります。 赤いワイヤーを「A +」(アノード)に保持し、ヘアクリップでクリップします(補足図20A–C)。 大きなはんだ付けチップにたっぷりのはんだを置き(補足図20D)、LEDベースのはんだとLEDの下のはんだペーストが溶けるまでワイヤに押し下げます(補足図20E)。注意: はんだペーストが溶けると、色は銀色になります(補足図20H、I)。 目的のセットアップに必要なワイヤの長さを選択します。LEDワイヤとオスの電線対電線コネクタ(補足図21A)を剥がし、 補足図3Gのように磁束を追加します。 シュリンクチューブをワイヤーの上に置きます。電線対電線コネクタの上に3.18 mm(1/8インチ)のシュリンクチューブを使用し、ワイヤの上に4.76 mm(3/16インチ)のシュリンクチューブを使用します(補足図21B)。 電線対電線コネクタを「ヘルプハンド」でクリップし、コネクタの端をワイヤでねじって(補足図21C)、はんだ付けします。もう一方のワイヤで繰り返します(補足図21D、E)。 3.18 mm(1/8インチ)のシュリンクチューブをはんだの上に置き、シュリンクします(補足図21F–G)。 4.76 mm(3/16インチ)のシュリンクチューブを3.18 mm(1/8インチ)のシュリンクチューブの上に置き、収縮させます(補足図21H–I)。 LEDワイヤーの「ヘルプハンド」をその下にテープでクリップします(補足図22A)。 製造元の指示に従ってエポキシを混合し、はんだ付けされたLEDの上部に広げます(補足図22B)。治療するために一晩放置してください。 タッチファスナーを使用して取り付ける場合は、タッチファスナーの小片を切り取り(補足図23A)、LEDの背面に30秒間押し付けます。 高速回転工具を使用して、ブラックボックスの蓋に切り込みを入れます(補足図23C–E)。 プライバシーフィルムを通して単一のLEDの取り付けを構築します。スペードドリルビットを使用して、LEDを配置するブラックボックスの上部に1.75 cm(11/16インチ)の穴を開けます(補足図24A)。 高速回転工具を使用して、 補足図24Aに示すように、穴の片側に切り込みを入れてLEDワイヤ用のスペースを確保します。 プライバシーフィルム(25〜30 mm)を切り取り、LEDが照らす穴を覆うブラックボックスの内側にテープで貼り付けます(補足図24A)。 ブラックボックスの外側の穴の上に、プライバシーフィルムとテープを電気テープで固定してLEDを配置します(補足図24B–E)。 4.照明システムに適合するようにブラックボックスを収容します 4つのLEDシステムの場合、ポテンショメータを取り付ける蓋に3.81 cm(1.5インチ)離して0.83 cm(21/64インチ)の穴を4つ開けます(補足図25)。 高速回転工具を使用して、左上隅に1.19 cm x 1.90 cm(0.47インチ x 0.75インチ)の長方形の穴を開けます(補足図25)。 スペードドリルビットを使用して、ブラックボックスに1.75 cm(11/16インチ)の穴を開けます(補足図26)。 穴をやすりで開け、穴を開けた穴にグロメットを挿入します(補足図26)。 コンピュータ制御のLEDの場合、マイクロコントローラがブラックボックスに接着される領域と、マイクロコントローラホルダの底面をサンドペーパーします。 マイクロコントローラをホルダにスナップしてから、ホルダをブラックボックスに固定し、所定の位置にエポキシを取り付けます(補足図27A)。 サンドペーパーを使用して、2つのクリップの下部と回路が配置されるブラックボックス内の領域を研磨し、ブラックボックス内のクリップをエポキシで固定します(補足図27A)。 PCBボードをクリップに固定します(補足図27B)。 補足図25で作成した蓋の四角い穴に電源スイッチを押し込み、所定の位置にカチッとはめ込みます(補足図28A)。 POTを蓋の穴に押し込み、所定の位置にねじ込み(補足図28A)、ノブをPOTに置きます(補足図28B)。 5.すべての配線とデバイスを接続します 電線対電線コネクタ(LED、ポット、COMなど)にラベルを付けます(補足図29A)。 手順 2.4 (補足図 16) で作成した圧着コネクタを、2 つのメス コネクタ(POT および LED)の間のオス電線対電線コネクタに接続します (補足図 7A および S37)。 圧着端をマイクロコントローラに接続します(補足図30)。 USBケーブルをグロメットに通し、マイクロコントローラに接続します。 LEDのワイヤをグロメットに通し、マイクロコントローラ接続の左側にあるメスの電線対電線コネクタに接続します(補足図9Dおよび38)。 電源のワイヤをグロメットに通し、PCBボードの右側にあるオスの電線対電線コネクタに接続します(補足図11D)。 電源スイッチからのオス電線対電線コネクタをPCBボードの右側にあるメス電線対電線コネクタに接続します(補足図11A)。 蓋のPOTからのオス電線対電線コネクタをPCBボードのメス電線対電線コネクタに接続します(補足図8および36)。メモ: ポテンショメータが接続されていない状態で回路の電源を入れないでください。 6.LED制御ソフトウェアをインストールします 注意: Githubの補足ファイルにある詳細なソフトウェアインストール手順を参照してください。https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces マイクロコントローラをプログラミングするためのソフトウェアをダウンロードしてインストールします パッケージマネージャーをダウンロードしてインストールします。 マイクロコントローラをプログラムします。 ランタイム エンジンをダウンロードしてインストールします。 ユーザー インターフェイスをダウンロードします。 7.光で細胞を刺激する HEK293細胞をトランスフェクトします。HEK293細胞をウェルあたり100k細胞で24ウェルプレートにプレートします。 サンプル表を使用して、無血清培地、ポリエチレンイミン(PEI)、およびDNA量を計算し(補足図39)、製造元のプロトコルを使用してトランスフェクトします。 光で細胞を刺激する。注:トランスフェクション後は細胞を暗所に保管するか、光遺伝学的システムを励起しない光源を使用して取り扱う必要があります。細胞に使用する刺激の種類(連続光、パルス強度など)を決定します。 POTをオフ(反時計回り)にオフにして、LED電源をオンにします。 セルが配置されるブラックボックス内に露出計を置き、LED付きの蓋をメーターの上に置きます。必要に応じて光の強度を調整します。 コンピュータを使用してLEDを制御する場合は、ユーザーインターフェイスソフトウェアを開きます。 ユーザーインターフェイスをプログラムします(図5A、B)。左上のパネルで、マイクロコントローラのCOMポートを選択し、[ 接続]をクリックします。 右側のパネルを使用して、各LEDをプログラムします。連続光の場合は、「タイムオン」でゼロ以外の時間を選択し、「タイムオフ」をゼロに設定します。 右下のパネルで、メインタイミングコントロールをプログラムします。照明を遅らせるには、開始遅延(HH:MM)を選択します。 指定した時間が経過するとすべての LED をオフにするには、実行時間 (HH:MM) を選択します。 [実行]ボタンをクリックして照明プログラムを開始します(図5A)。 8. デュアルルシフェラーゼアッセイを用いた遺伝子発現の測定 10 mLのルシフェラーゼバッファーとルシフェラーゼ試薬を混合し、1 mLチューブに分注してルシフェラーゼ試薬を調製し、-80°Cで最長1年間保存します。 溶解バッファーを5xから1xに調製し、N + 2ウェルに対して100 μLにします。例えば、30サンプルの場合、30 x 20 μLの5X溶解バッファー、および30 x 80 μLのMQ H2O。 レニラ基質溶液を調製する:1 mLのレニラバッファーに対して20 μLのレニラ基質を調製する(この量は10アッセイに適している)。 インキュベーターから細胞を取り出し、培地を吸引し、ウェルあたり100 μLの1x溶解バッファーを加え、100 RPMで15分間シェーカーに入れます。 -20°Cに少なくとも1時間置きます。 サンプルあたり100 μLのルシフェラーゼ試薬を白い96ウェルプレートのウェルに加えます。 プレートリーダーを発光用にセットアップします。プレートリーダーのルミノメーターモジュールを使用して、積分を1秒に設定します。 解凍したライセートをルシフェラーゼ試薬の下のウェルに加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、20 μLのサンプルをルシフェラーゼ試薬に混合し、発光を直ちに測定します。 測定値がプラトーになったら、100 μLのRenilla基質溶液を加え、再度スキャンします。 ルシフェラーゼシグナルをRenillaシグナルで割って、トランスフェクション効率を考慮します。 トランスフェクション効率について正規化されたルシフェラーゼシグナルを比較します(例えば、赤色光照射サンプルと遠赤色光照射サンプルからのシグナルを比較します)。
Representative Results
電源回路、電源、電源スイッチ、POT、およびLEDが組み立てられたら( 補足図21まで)、回路をテストできます。すべてのPOTが配置されると、POTはLEDの強度を制御します。 補足図29までの組み立てが完了すると、システムはオプトジェネティクスやその他のアプリケーションに手動で使用できます。システム全体の電源は、電源スイッチで手動で制御できます。各LEDの輝度は、各回路に接続されたPOTを使用して個別に制御できます。 ソフトウェアをインストールしてマイクロコントローラをプログラミングすると、ユーザインタフェースはマイクロコントローラと通信できます。ユーザインタフェースを使用すると、LEDをいくつかの方法で時間的に制御できます:(1)各LEDは指定された時間オンのままになるようにプログラムできます、(2)各LEDはパルスするようにプログラムできます、(3)グローバル開始遅延(たとえば、24時間後にトランスフェクションしてライトを照らす場合)をプログラムできます(図6B)、(4)遅延後にプログラムを実行するための合計時間。2つのユーザーインターフェイスがあり、1つは一度に2つのLEDを制御できる大きなボタンを備え、もう1つは4つのLEDを制御できます(図5のA、B)。2つのLEDユーザーインターフェイスはタブレット用に最適化されており、多くの実験で赤と遠赤色のLEDを制御するのに十分です。 大規模な実験では、2番目のユーザーインターフェイスを使用して最大4つのLEDを制御できます。遺伝子発現を誘導する場合、予想される結果はいくつかのパラメータに依存します。これらには、誘導時間、誘導レベル(例えば、光または薬物の量)、および細胞内の誘導性構築物のコピー数が含まれる。これを示すために、PhyB遺伝子スイッチを異なる量のレポーターDNA(pPK-202)(トランスフェクトされたDNAの0.5%、1%、2%、4%、および8%)とともにトランスフェクトし(図6A)、図6Bに示すように照明しました。PhyBを含むが、フィコシアノビリン(PCB発色団)を産生するプラスミドがない(すなわち、光に反応しない)サンプルでは、ルシフェラーゼ遺伝子の発現/漏出はレポーターDNAの量とともに増加します(図6C)(遠赤色P < 0.0001、線形回帰とそれに続くワルド検定)、(赤色P < 0.0001、線形回帰とそれに続くワルド検定)。さらに、PCB発色団産生プラスミド(光感受性細胞)を含むPhyB遺伝子スイッチ全体を遠赤色光用に照射すると、トランスフェクションミックス中のレポーター構築物量の増加とともにルシフェラーゼ発現も増加します(図6C、D)(遠赤色光P < 0.0001、線形回帰とそれに続くワルド検定)。同様に、光感受性細胞が赤色光で照らされると、ルシフェラーゼ発現もレポーター量の増加とともに増加する(P < 0.0001、線形回帰とそれに続くワルド検定)。赤色光処理細胞と遠赤色光処理細胞の誘導レベルを比較すると、レポーター量の増加に伴うフォールド活性化のわずかな減少が見られました(図6E)(P = 0.0141、線形回帰とそれに続くワルド検定)。 図1:単一のLEDの基本回路。 (a)LED照明システムの構築に必要なステップの概要を示すフローチャート。(B)LED照明制御システム。(写真左)LEDの強度とタイミングを調整するためのコントロールボックス。(中)LEDを制御するためのユーザーインターフェイスを実行するPCタブレット。(右)LEDを取り付け、光刺激用のセルを配置するためのブラックボックス。(C)LEDに高電圧回路と低電圧回路のどちらが必要かを判断するための表。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:コンポーネントを所定の位置にはんだ付けする手順。 (A)回路を構築するためのステップバイステップの漫画の説明の例。(B,C)組み立てられるデバイスの写真を含む手順の例。(D)複数の回路を同時に組み立てるための指示例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:組み立てられたLED制御システムのビュー。 (A)組み立てられたシステムの上面外観。(B)組み立てられた4つのLED照明システムの内面図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:LEDをヒートシンクにリフローはんだ付けする手順 (A)LEDベースと深赤色LEDのクローズアップ。(B)LEDベースへのはんだペーストの配置。(C)はんだ付けLEDの写真。赤い矢印ははんだ付けパッドを指しています。はんだ付け前の灰色(A)と比較して、はんだ付け後、はんだは金属/光沢があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:光遺伝学的実験を制御するためのソフトウェア。 (A)安価なタブレットで簡単に使用できる大きなボタンを備えた2つのLEDユーザーインターフェイス。(B) 4 つの LED ユーザー インターフェイス。どちらのインターフェースでも、独立したLED制御が可能です。パルスの場合、LEDは特定のパルス幅と指定された期間だけオン/オフするようにプログラムできます。パルスは、開始遅延および所定の合計実行時間を有することもできる。(C)細胞培養インキュベーターに取り付けられたLEDコントロールタブレット。(D)遠赤色光で照らされたときのPhyB遺伝子システムの説明図。遠赤色光は、遺伝子を「オフ」または「暗い」状態に保ちます。(E)赤色光で照らされたときのPhyB遺伝子システムの図。赤色光は、PhyBとPIF3の間の相互作用を促進することにより、遺伝子発現を誘導します。この相互作用は、PIF3に融合した遺伝子活性化ドメイン(AD)をUASプロモーターに局在させ、レポーター遺伝子を活性化する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図6:LEDシステムを使用してPhyBを制御すると予想される結果。 (A)PhyB+PIF3ツーハイブリッドパートナー(pPK-351)をコードするプラスミド、フィコシアノビリン(PCB発色団)合成酵素をコードするプラスミド(pPK-352)、およびルシフェラーゼレポータープラスミド(pPK-202)。(B)C–Eの光誘導実験のタイムライン。 (C)レポーターDNAの量の増加に伴う基礎転写レベル(別名リーク性)。「リーク」サンプルはpPK-352でトランスフェクトされません(すなわち、光に反応しません)が、赤色または遠赤色の光で照らされます。ライトスイッチ(LS)サンプルには、すべての光遺伝子スイッチプラスミドが含まれ、赤色または遠赤色の光で照らされます。(D)赤色および遠赤色光に応答する光誘導レベル。(LS-遠赤色光はCとDで同じデータです。(E)赤色光/遠赤色光で照射された細胞におけるルシフェラーゼのフォールド誘導。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 補足図1-39をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図1:複数のLED用の電子ドライバ回路。 (A)単一のLEDシステムの回路図。(B)4つのLEDシステムの回路図。 補足図2:回路相互接続の配置。 (A)PCBボードを手伝いの手にクリップで留めます。(B)写真の貫通穴への主回路ジャンパの位置。(C)座標をマッピングするワイヤコネクタの図。4つのLEDシステムの場合、図のように各回路を分割する線を引きます(黒い縦線)。 補足図31–38 は、4つの回路の同時組み立てについて説明しています。 補足図3:PCBへのワイヤのはんだ付け。 (A)ジャンパーを曲げてPCBに直接接触し、はんだ付け中に所定の位置に留まるようにします。(B)曲がったワイヤーの別のビュー。(C)はんだ付け後のワイヤ。(D)PCB上のトリミングされたワイヤ。(E)はんだで加熱した後の絶縁体を収縮させます。(F)絶縁体を地面の貫通穴を覆う位置に移動します(青い矢印)(G)ワイヤの端または端子にフラックスを追加します。 補足図4:電圧レギュレータを所定の位置にはんだ付けする。 (A)電圧レギュレータ座標のマップ。(B)電圧レギュレータの配置。(C)曲がった電圧レギュレータのリード。(D)はんだ付け後の電圧レギュレータ端子。 補足図5:R1抵抗を所定の位置にはんだ付けする。 (A) R1抵抗(820Ω)座標のマップ(B)ペンチを使用してリード線で抵抗器を引っ張る(C)PCBの近くで抵抗器を引っ張る。(D)PCBに近いはんだ付けされた抵抗器。 補足図6:トランジスタを所定の位置にはんだ付けする。 (A)トランジスタの座標と向きのマップ。(B)トランジスタの向きに注意してください。このモデルのラベルは電圧レギュレータ(LM317T)に面しています。トランジスタの仕様を再確認して、「エミッタ」、「ベース」、「コレクタ」が正しい穴にあることを確認してください。(C)はんだ付け前に端子を曲げたトランジスタ。 補足図7:ポテンショメータ用の電線対電線コネクタを所定の位置にはんだ付けします(および低電圧回路用の560Ω抵抗 )。(A)電線対電線コネクタの座標のマップ(低電圧回路を構築する場合はR3-560Ωに加えて、電線対電線コネクタは抵抗の前の穴に配置されます)。(B) メス電線対電線コネクタ。(C)抵抗器と電線対電線コネクタを貫通穴に簡単に取り付けるために、編組線の3〜5本のストランドを曲げます。(D)ストランドは、絶縁体のできるだけ近いワイヤーカッターで切断されます。(E)メス電線対電線コネクタの赤い線をa5スルーホールに挿入します(低電圧回路の場合は、同じスルーホールにR3を挿入します)。(F)はんだ付け前の抵抗器と電線対電線コネクタの下面図。(G)グランドに接続されたはんだ付けされたR3抵抗の画像(F =メス)。 補足図8:ポテンショメータの電線対電線コネクタをアースにはんだ 付けする。(A) ポテンショメータ電線対電線コネクタのアース接続の座標のマップ。(B) R3と並列のポテンショメータ電線対電線コネクタの上面図(F =メス)。 補足図9:マイクロコントローラとLED電線対電線コネクタのはんだ付け (A) 2N222Aとグランドをマイコンに接続するための電線対電線コネクタの座標のマップ。(B)はんだ付けされたオス電線対電線コネクタ。(C)(B)の上面図。(D) 回路の入力とグランドを LED に接続するためのメス電線対電線コネクタ座標のマップ。(E)はんだ付けされたメス電線対電線コネクタ(F =メス、M =オス)。 補足図10:電源回路のジャンパのはんだ付け。 (A)電源をアースに接続するためのオレンジ色のジャンパーの座標のマップ。(B)オレンジ色のジャンパーを所定の位置にはんだ付けします。(C)所定の位置にはんだ付けされたジャンパーの下側図。 補足図11:電源スイッチと電源電線対電線コネクタのはんだ付け。 (A)電源スイッチを接続するためのメス電線対電線コネクタの座標のマップ。(B)メスの電線対電線コネクタが所定の位置にはんだ付けされている。(C)(B)の別の見方。(D)電源を接続するためのオス電線対電線コネクタの座標のマップ。(E) はんだ付けオス電線対電線コネクタ。(F)(E)の別のビュー(F =女性、M =男性)。 補足図12:電源をオスの電線対電線コネクタに接続する。 (A) 変更されていない電源装置。(B)電源線を切断します。(C)電源線が剥がされ、余分な絶縁が切断されています。(D)電源線周りのシュリンクチューブの配置。2つの接続を分離するチューブ(赤い矢印)と、分離されたワイヤを保持するためのチューブ(黄色の矢印)。(E) 電源モジュールをメス電線対電線コネクタに接続する撚り線。 補足図13:オス電線対電線コネクタへの電源接続のはんだ付けと絶縁。 (A) 電源アースとメス電線対電線コネクタの間のはんだ付けされた接続。(B) 電源装置のプラス端子とメス電線対電線コネクタの間のはんだ付けされた接続。(C)はんだ付けされた個々の接続部(赤い矢印)の上に引っ張られたシュリンクチューブ。(D)両方の電源接続ははんだ付けされ、熱処理されたシュリンクチューブが付いています。(E)個々の接続部へのシュリンクチューブの配置(黄色の矢印)。(F)電源供給が完了しました。 補足図14:電源スイッチをオスの電線対電線コネクタにはんだ付けする。 (A)ワイヤーを剥がした電源スイッチとシュリンクチューブをワイヤーの上に置きます(赤い矢印)。(B)はんだ付けする前に、スイッチとオス電線対電線コネクタを接続するワイヤをねじり合わせます。(C)はんだ付けされた接続部の上にシュリンクチューブを配置します。(D)熱処理されたシュリンクチューブで覆われた接続。(E) オス電線対電線コネクタで組み立てられた電源スイッチ。 補足図15:ポテンショメータをオス電線対電線コネクタに配線する。 (A)ポテンショメータ部品。(B)オスの電線対電線コネクタをねじって曲げ、ポテンショメータの中央端子に引っ掛けます。(C)ポテンショメータの中央端子の周りにねじれたオスの電線対電線コネクタ。(D)はんだ付けされた電線対電線接続。(E)取り外す前に金属製のタブを指す赤い矢印。(F)金属タブを取り外した後のポテンショメータ。 補足図16:マイクロコントローラ接続の配線。 (A)圧着に備えてメス電線対電線コネクタ用のワイヤを剥がして切断します。(B) 電線対電線コネクタへの圧着の配置。(C) 電線対電線コネクタの圧着。(D) 圧着電線対電線コネクタ。(E)完全に組み立てられたマイクロコントローラ接続。 補足図17:LEDベースへのワイヤとLEDのはんだ付けパート1。 (A)LEDをLEDベースにはんだ付けするために必要な材料。(B)剥がしたワイヤーの先端を錫メッキします。(C)LEDベースの接点にフラックスを塗布します。(D)LEDベースの錫メッキのために、大きなはんだ付け先端に半田を追加します。(E)LEDベースを加熱するための接点へのはんだの配置。(F)はんだ付けチップを接点にドラッグした後のLEDベース。(G)他の連絡先でも同じ手順。 補足図18:LEDベースへのワイヤとLEDのはんだ付けパート2。 (A)ヘアクリップを使用して接点にクリップされた錫メッキワイヤー。黒い線はカソード「C-」にはんだ付けされていることに注意してください。(B)はんだ付け先端に多量のはんだを加える。(C)はんだ付けチップがワイヤーを押し下げ、LEDベースとワイヤーのはんだを溶かします。(D)はんだごてを取り外したときにワイヤーが固定されたままになるようにワイヤーを押し続けます。(E)はんだが固まるまでワイヤーを所定の位置に保持します。 補足図19:LEDベースへのワイヤとLEDのはんだ付け パート3。 (A)鋭利な先端を使用して、LEDを取り付けるためのLEDベースにはんだペーストを配置します。(B)はんだペーストが所定の位置にあるLEDベース。(C)LEDとLEDベースの接点が一致するように、LEDをLEDベースに配置します。 補足図20:LEDベースへのワイヤとLEDのはんだ付け パート4。 (A)黒いワイヤーはまだヘアクリップで接点にクリップされています。(B,C)2番目のヘアクリップを使用して、赤いワイヤーを所定の位置に保持します。赤い線はアノード「A +」にはんだ付けされていることに注意してください。(D)はんだ付け先端に多量のはんだを加える。(E)はんだ付けチップがワイヤを押し下げ、LEDベースとワイヤのはんだ、およびLEDの下のはんだペーストを溶かします。(F)はんだ付け後のホットLEDベースの冷却。(G)ワイヤーとLEDがはんだ付けされたLEDベース。(H,I)赤い矢印ははんだ付けパッドを指しています。はんだ付け後、はんだは金属/光沢があります(はんだ付け前の灰色と比較して(補足図16D))。 補足図21:LEDワイヤをオス電線対電線コネクタに接続する。 (A)シュリンクチューブの横にある剥がされたワイヤとオス電線対電線コネクタを半分にカット(1/8インチと3/16インチ)。(B)はんだ付けする前に、ワイヤー上のシュリンクチューブの配置。(C)はんだ付けする前にワイヤーを撚り合わせます。(D) 電線から電線対電線コネクタへのはんだ付けされた接続。(E)赤と黒の両方のワイヤーをはんだ付けしました。(F)はんだ付けされた接続部の上に1/8インチのシュリンクチューブを配置します。(G)ヒートガンで収縮した後のシュリンクチューブ。(H)小さい方のシュリンクチューブの上に3/16インチのシュリンクチューブを配置します。(I)接続部はシュリンクチューブではんだ付けして密封します。 補足図22:エポキシを使用してワイヤとLEDをLEDベースに固定します。 (A)木製のアプリケーターを使用して、LEDベースにエポキシを配置します。滴り落ちるエポキシをキャッチするためにテープが下に置かれます。(B)エポキシが全面に均一に広がっている。(C)LEDを一晩放置して硬化させます。 補足図23:ボックスの蓋の内側にLEDを取り付ける。 (A)取り付けが簡単なタッチファスナーピース付きのLEDです。(B)タッチファスナーを使用してブラックボックスの内側に取り付けられた異なる色のLED。(C)LEDワイヤー用のスペースを作るために高速回転工具によって作られたブラックボックスの蓋のノッチ。(D)LEDを取り付けるためのタッチファスナーで細胞を刺激するためのブラックボックス。(E)LEDボックスのタッチファスナーバージョンの内側にマルチウェルディッシュを配置します。 補足図24:ボックスの蓋の外側にLEDを取り付ける。 (A)高速回転工具の切り込みでブラックボックスの蓋に穴を開け、ワイヤー用のスペースを作ります(赤い矢印)。(B)ワイヤーをノッチに入れて穴に入れ、電気テープで所定の位置に保持するLED。(C)LEDを固定するために、さらに2本のテープを使用します。ヒートシンクの裏側は、熱交換を最大化するために露出しています。(D)LEDが配置される穴の上にテープで留められたプライバシーフィルム。赤い矢印はプライバシーフィルムを指しています。(E)箱の外側に取り付けられたLEDと照明を拡散させるためのプライバシーフィルムで細胞を刺激するためのブラックボックス。(F)外部LED+プライバシーフィルムバージョンのLEDボックスの内側にマルチウェル皿を配置します。 補足図25:電源スイッチとポテンショメータ用のボックスの蓋に穴を開ける。 (A)箱の蓋の注釈付き寸法を含むCAD図面。(B)ポテンショメータと電源スイッチの穴が付いたボックスの蓋。 補足図26:ワイヤ出口穴の準備。 (A) 注釈付き寸法を含む CAD 図面。(B)ドリルビットでドリルされた穴の画像。(C)高速回転工具またはファイリング工具による出口穴の平滑化。(D)グロメットを出口穴に配置します。 補足図27:ボックス内のマイクロコントローラとPCBの配置。 (A)ボックス内のマイクロコントローラホルダー(オレンジ)とPCBホルダー。(B)マイクロコントローラとPCBをボックスに固定します。 補足図28:ポテンショメータと電源スイッチの配置。 (A)電源スイッチと4つのPOTを備えたボックス蓋の正面図。(B)ポテンショメータノブが追加されたボックス蓋の正面図。(C)ボックス蓋と付属コンポーネントの外観。 補足図29:組み立てられたLED制御システム。 (A)ラベルプリンターでラベル付けされたワイヤーと整理用のジッパーが結ばれたオープンコントロールボックス。(B)各POTにPINとともにラベルを付けて完全に組み立てられた箱。 補足図 30: 圧着電線対電線コネクタの配置。 (A) 4 つの LED マイクロコントローラ システム用の圧着電線対電線コネクタの写真。(B) 圧着コネクタをマイクロコントローラポートに配置します。 補足図31:ジャンパ線の配置。 (A)赤いジャンパー線の座標がラベル付けされた回路基板。(B)黄色のジャンパー線の座標がラベル付けされた回路基板。 補足図32:ジャンパ線の配置。 黄色のジャンパ線の座標を表示する回路基板。 補足図33:電圧レギュレータの追加 LM317T電圧レギュレータが回路に追加され、その座標が図にラベル付けされています。 補足図34:820Ω抵抗の挿入 R1抵抗は回路に追加され、その座標は図にラベル付けされています。 補足図35:トランジスタの挿入 2N2222Aトランジスタが回路に追加され、その座標が図にラベル付けされています。 補足図36:POT接続用のメス電線対電線コネクタと抵抗器(オプション)の挿入。 ワイヤと抵抗器が回路に追加され、それらの座標がダイアグラムにラベル付けされます。(A)赤い線を挿入し、続いてR2抵抗(560Ω)を挿入します(低電圧回路のみ)。(B)抵抗のもう一方の端を指定されたアース穴に挿入します。(C)マークされた穴に黒い線を挿入してアースに接続します。注:R2(560Ω)はポテンショメータと平行です。 補足図37:マイクロコントローラ接続と電源用のオス電線対電線コネクタの挿入。 ワイヤが回路に追加され、その座標がダイアグラムにラベル付けされます。(A)赤いワイヤーを指示された穴に挿入します。(B)マークされた穴に黒いワイヤーを挿入します。 補足図 38: LED 電線対電線コネクタの追加 (A) 赤いリード線座標が強調表示されたメス電線対電線コネクタ。(B) 黒いリード線座標が強調表示されたメス電線対電線コネクタ。 補足図39:PhyB-PIF3遺伝子スイッチ実験のセットアップ。 (A)内部コントロール用のRenillaを含むマスターミックスの例の表。(B)PhyB-PIF3光遺伝学的実験のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ用のDNA混合物を設定するためのサンプルテーブル。(C)PEIトランスフェクション試薬をセットアップし、混合物を細胞に分注(ドロップワイズ)するための表の例。(D)LEDの明るさを設定するための露出計の配置。
Discussion
ここで説明するLEDシステムは、いくつかの光遺伝学的ツールを最適化、特性評価、および操作するために、私たちのラボで使用されています。Kyriakakisら4では、PhyB-PIF遺伝子スイッチの多くの組み合わせを並行して試験した。次に、このシステムを使用して、さまざまな周波数の光のパルスをテストし、遺伝子スイッチの動態と有効光強度を測定しました。このシステムは、刺激に青色光を使用する2つの光遺伝学的システムを最適化し、特徴付けるためにも使用されました5,6。ほとんどの光遺伝学的ツールをアクティブにするのに十分な明るさのLEDは1つだけであるため、各ウェルに多数のLEDを備えたシステムを購入する必要は必ずしもありません。このセットアップは安価で信頼性が高く、再構成が容易であり、アセンブリプロトコルに従うために事前の電気的専門知識は必要ありません。
補足 図31〜38では、最大4つのLEDをシステムに組み込む方法について説明します。これにより、多数の並列条件を必要とする一部の実験が制限される可能性がありますが、このプロトコルで使用されている9ボルトの電源をより高いワット数の電源に置き換えることで、LEDを追加できます。同様に、いくつかの低電力LEDを各回路に並列に接続することができます。この後者の配置では、一部のLEDは個別に制御されませんが、これは、より広い領域をカバーするために多くのLEDが必要な場合に役立ちます。このシステムの電子機器に慣れたら、それをカスタマイズする方法はたくさんあります。システムをカスタマイズするための追加の戦略には、LEDをサンプルに近づけたり近づけたり、フィルター/ディフューザーを通して照明したりして、均一な照明条件を実現したり、(補足図23)やAllenら5のように加熱を防止したりすることが含まれます。私たちのLEDデザインのもう一つの注目すべき特徴は、エポキシでカプセル化されており、背面にタッチファスナーが付いていることです。これにより、LEDはインキュベーター、水槽、動物ケージ、壁など、事実上どこにでも簡単に安全に配置できます。
オプトジェネティクスを使用して遺伝子、シグナル伝達経路、およびその他の細胞活動を制御する多くの実験では、パルスが必要であったり、時間スケールが大きくなったり、インキュベーター内で実行したりする必要があるため、顕微鏡なしで自動化またはリモート操作を行う必要があります。このLEDシステムは、加湿されたCO2 インキュベーター内で数ヶ月間問題なく継続的にテストされています。さらに、PhyB光遺伝学システムなどの可逆システムでは、実験者はプログラム固有のパルス照明スケジュールが必要になる場合があります。以前の研究4では、パルスプログラムを使用して、哺乳類細胞におけるPhyB-PIF3スイッチの可逆性ダイナミクスをユーザーインターフェイスを介してテストしました。この原稿で説明されている方法論を使用すると、パルスプロトコルのプログラミングは簡単で、多くのタイプの光遺伝学的実験に必要な柔軟性と自律性をユーザーフレンドリーな方法で提供します。
このシステムを構築する上で最も重要なステップには、PCBボード上の電気回路を組み立て、コンポーネントを接続することが含まれます, セクション1とセクション2で詳しく説明します.各コンポーネントをはんだ付けする前に、これらのセクションの各手順を注意深く実行し、ピンホール番号を行ごとに再確認することが不可欠です。セクション2では、回路に接続するコンポーネントの設定方法について説明します。コンポーネントが正しい方向で接続されるように、電線対電線コネクタの黒と赤のワイヤの色が一致するようにすることが特に重要です。これら2つのセクションの小さな見落としは、システムの機能に影響を与える可能性が非常に高いです。実際、この方法のトラブルシューティングの最初のステップは、回路が正しく構築され、すべての接続が整っていることを確認することです。第二に、接続の緩みについてははんだ付け品質をチェックし、回路を短絡させている可能性のあるワイヤーヘアのフレアがないかワイヤをチェックすることは特に重要です。3番目のステップは、LEDが正しく機能していることを確認することですが、これは、LEDの2つの端子をワニ口クリップでクリップすることにより、電源または1.5Vバッテリーを使用して行うことができます。別の潜在的に重要な考慮事項は、加熱(高出力でLEDを使用する場合)またはより広い拡散照明のための光の拡散を防ぐことです。これらの考慮事項に対処するために、LEDは、 補足図23 およびAllenら5で説明されているように、内側に「プライバシーフィルム」が付いたブラックボックスの外側に取り付けることができます。このシステムはシンプルであるため、モジュールコンポーネントを検証、変更、アップグレード、または修理するために分解することは難しくありません。
誘導可能な遺伝子システムのもう一つの重要な要素は、制御される生物学的システムにとってどの程度の活性化が必要か、またはどの程度の漏れが許容できるかを考慮することである。 図6に示すように、これらはレポーターDNAの量によって変化し得る。さらに、トランスフェクション効率、したがって各細胞におけるレポーター構築物のコピー数は様々である。いくつかの実験では、薬物誘導性システムで一般的に行われているように、一定量のレポーターまたはPhyB遺伝子スイッチ成分を用いて細胞株を作製し、所望の発現誘導範囲を有するクローンをスクリーニングすることが有利であり得る。レンチウイルスプラスミドpPK-2304のサイズと不安定性のために、pcDNAバックボーンpPK-351(Addgene #157921)およびpPK-352(Addgene #157922)のPhyBスイッチの非レンチウイルスプラスミドバージョンも作製しました。
このプロトコルに従ってこのLED照明システムを構築することにより、ユーザーはin vitroおよびin vivoで幅広い光遺伝学実験を実行するために必要なすべてのコンポーネントを手に入れることができます。哺乳類細胞でPhyB-PIF3を使用するための指示と組み合わせることで、このプロトコルは、非エンジニアや生物学者がさまざまな状況でPhyBベースの光遺伝学を柔軟かつ効果的に使用できるようになります。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yingxiao (Peter) Wang、Ziliang Huang、Molly Allenが、開発中のLEDシステムのさまざまなバージョンをテストしてくれたことに感謝します。この研究は、カリフォルニア大学サンディエゴ校のKavli Institute for Brain and Mindと国立科学財団のソーク研究所によって、助成金CCF-0939370、NIH Grant NS060847、およびNIH Grant R21DC018237の下でNSF情報科学センターを通じて支援されました。
Materials
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| 1K Ohm potentiometer | Amazon | 52161500 | 2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
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| 560 ohm 1/2watt 1% tolerance | Amazon | a14051600ux0301 | Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN |
| 820 ohm 1/2watt 1% tolerance | Amazon | TTL-A-8035-50Ea | Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor |
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| Blue LED | Digikey | LXML-PB01-0040 | LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134 |
| Cable ties | Amazon | sd027 | Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
| Command Fridge Clips | Amazon | 17210CLR | Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| Cyan LED | Digikey | LXML-PE01-0070 | LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd |
| Electrical tape – 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack | Amazon | 03429NA | Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK |
| Farred LED 720nm | Luxeon Star LEDs | LXML-PF01 | Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW |
| Farred LED 740nm | Ushio | EDC740D-1100-S5 | Uses "STAR XP 3535" base https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf |
| Farred LED 780nm | Ushio | EDC780D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf |
| Farred LED 810nm | Ushio | EDC810D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf |
| Farred LED 850nm | Ushio | EDC850D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf |
| Grommets | Amazon | Pico 6120D | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G |
| Hair/Alligator Clips | Amazon | 1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
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| LED base | Luxeon Star LEDs | LXB-RS20A | Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds |
| LED PCB fopr Ushio LEDs | Adura LED solutions | STAR XP 3535 Package LED | Fits many other LEDs by Ushio http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led |
| Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe | Amazon | 1943587 | Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C |
| NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS | Amazon | B000FIDTYG | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
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| Power switch Rocker Switch | Amazon | SIXQJZML | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011 |
| Rectangular Connectors – for crimped wires | Digikey | 2183-1905-ND | 6 Rectangular Connectors – Housings Black 0.100" (2.54mm) https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB |
| Red LED | Digikey | LXM3-PD01 | LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd |
| Sandpaper | Amazon | B002NEV6GS | 3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1 |
| Solder for soldering wires and circuit components | Amazon | Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY |
| Solder-able Breadboard for building the circuit | Amazon | GK1007 | Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Spade drill bit | Amazon | Irwin 88811 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit |
| Transistor | Newark | 2N2222A | Can buy from many places. http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197 |
| Voltage regulator | Newark | LM317T | Equivilent to NTE956. https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC |
| Windows 10 tablet | Amazon | B08BYTT79Y | Any Windows 10 PC will do. https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Cell Culture Reagents | |||
| Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 | ATCC | ATCC CRL-1573 | Common Cell line. https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose | ThermoFisher | 11965−092 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118 |
| 10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122 |
| White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates | ThermoFisher | 07-200-589 | White plates are preferred. Do not use clear plates. https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852 |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | PolySciences | 24765-1 | Can be replaced with another transfection reagent. https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/ |
| Name of Equipment | |||
| Diagonal Cutting Plier (110mm) | Amazon | Proskit 1PK-037S | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11 |
| Dremil 3000 with cutting tool and grinder | Amazon | Dremel 3000 | Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3 |
| Dremil cutting and grinding tool | Amazon | Dremel 200-1/15 | Any similar Dremil will work. https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
| Dremil grinding tip | Amazon | Dremel 84922 | Silicon Carbide Grinding Stone. https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922 |
| EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT | Amazon | DS017 | For removing solder/mistakes. https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI |
| Helping Hand with Magnifying Glass | Amazon | SE MZ101B | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch |
| Pointed Nose Micro Pliers | Amazon | Hakko CHP PN-20-M | Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| Small screw drivers | Amazon | Wiha 26197 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set |
| Soldering iron | Amazon | Yihua 939D+ Digital Soldering Station | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR |
| TraceTech No-Clean Flux Pen | Amazon | 2507-N | Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1 |
| Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber | Amazon | WSA350 | For soldering safety. https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK |
| Wire strippers | Amazon | CSP-30-7 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG |
| IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG | Amazon | IWS-3220M | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
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Cite This Article
Kyriakakis, P., Fernandez de Cossio, L., Howard, P. W., Kouv, S., Catanho, M., Hu, V. J., Kyriakakis, R., Allen, M. E., Ma, Y., Aguilar-Rivera, M., Coleman, T. P. Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments. J. Vis. Exp. (167), e61914, doi:10.3791/61914 (2021).