בניית מערכת תאורה פשוטה ומגוונת לניסויים אופטוגנטיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניסויים אופטוגנטיים לבקרת ביטוי גנים באור אדום ואדום רחוק באמצעות PhyB ו-PIF3. כלולות הוראות שלב אחר שלב לבניית מערכת תאורה פשוטה וגמישה, המאפשרת שליטה על ביטוי גנים או אופטוגנטיקה אחרת באמצעות מחשב.
Abstract
שליטה בתהליכים ביולוגיים באמצעות אור הגבירה את הדיוק והמהירות שבהם חוקרים יכולים לתמרן תהליכים ביולוגיים רבים. בקרה אופטית מאפשרת יכולת חסרת תקדים לנתח תפקודים וטומנת בחובה פוטנציאל לאפשר טיפולים גנטיים חדשניים. עם זאת, ניסויים אופטוגנטיים דורשים מקורות אור נאותים עם בקרת מרחב, זמן או עוצמה, לעתים קרובות צוואר בקבוק עבור החוקרים. כאן אנו מפרטים כיצד לבנות מערכת תאורת LED בעלות נמוכה ורב-תכליתית הניתנת להתאמה אישית בקלות עבור כלים אופטוגנטיים זמינים שונים. מערכת זו ניתנת להגדרה עבור שליטה ידנית או מחשב עם עוצמת LED מתכווננת. אנו מספקים מדריך מאויר שלב אחר שלב לבניית המעגל, הפיכתו לנשלט מחשב ובניית נורות ה- LED. כדי להקל על הרכבת מכשיר זה, אנו דנים גם בכמה טכניקות הלחמה בסיסיות ומסבירים את המעגלים המשמשים לשליטה בנורות ה- LED. באמצעות ממשק המשתמש שלנו בקוד פתוח, משתמשים יכולים להפוך תזמון מדויק ופעימת אור לאוטומטיים במחשב אישי (PC) או בטאבלט זול. אוטומציה זו הופכת את המערכת לשימושית עבור ניסויים המשתמשים בנורות LED כדי לשלוט בגנים, מסלולי איתות ופעילויות תאיות אחרות המתפרשות על פני סקאלות זמן גדולות. עבור פרוטוקול זה, אין צורך במומחיות קודמת באלקטרוניקה כדי לבנות את כל החלקים הדרושים או להשתמש במערכת התאורה לביצוע ניסויים אופטוגנטיים.
Introduction
כלים אופטוגנטיים הופכים להיות בכל מקום וטכנולוגיה חדשה מפותחת כל הזמן כדי לשלוט אופטית בתהליכים ביולוגיים כגון ביטוי גנים, איתות תאי, ועודרבים 1,2,3. היכולת לשלוט בתהליכים תאיים באמצעות אור מאפשרת קינטיקה מהירה, שליטה מרחבית הדוקה וויסות תלוי מינון שניתן לשלוט בו על ידי עוצמת האור וזמן החשיפה. כדי להשתמש בכלים אלה, יש צורך במכשיר לשליטה בפרמטרים אלה. לאחרונה פיתחנו מתג גנים של יונקים מקודד גנטית PhyB-PIF3 המפעיל ומנטרל גנים באופן הפיך באמצעות אור אדום/אדום רחוק, בהתאמה4. מערכת זו נבדקה במספר שורות תאים של יונקים ואפשרה השראה חסרת תקדים של ביטוי גנים גם עם כמויות קטנות מאוד של אור, כולל פולסים של אור. חוקרים המעוניינים להשתמש במתג PhyB ובכלים דומים 5,6 מבקשים לעתים קרובות מידע על שיטות לשליטה בעוצמת התאורה ובמשך. לכן, פיתחנו פרוטוקול זה עם הוראות שלב אחר שלב כדי לאפשר אימוץ רחב יותר של כלים אלה עבור אופטוגנטיקה.
לפני השימוש הנרחב בנורות LED, מקורות אור בפס רחב עם מסננים שימשו לחקר חלבונים מגיבי אור כגון פיטוכרום7. לאחרונה, כמה מערכות תאורת LED פורסמו יחד עם כלים אופטוגנטיים 8,9,10,11,12, אבל פרוטוקולים אלה יכולים לדרוש מומחיות משמעותית באלקטרוניקה / תוכנה, דורשים ציוד מיוחד (למשל, מדפסות תלת מימד, מכונות חיתוך לייזר, או מסכות פוטו), או לא לספק את ההוראות שלב אחר שלב כמה החוקרים יצטרכו לפרוס לצרכי המחקר שלהם. בעוד שבקרה עצמאית של בארות בודדות בצלחת מרובת בארות יכולה להיות שימושית, לעתים קרובות היא מיותרת כאשר החוקרים צריכים להשוות רק כמה דגימות שונות באור בהיר ואור כהה או אדום לעומת אור אדום רחוק. כמו כן, מערכות מסחריות קיימות רבות הן יקרות, עם יכולת התאמה אישית מוגבלת. עם זאת, נורות ה- LED המתוארות בפרוטוקול זה הן חסכוניות, בהירות וניתנות להרכבה בדרכים רבות; לכן, הם יכולים לשמש כדי להאיר כמה סוגים שונים של דגימות. עם הפרוטוקול והתוכנה המסופקת, נורות LED החל מאולטרה סגול (UV) ועד NIR ניתן להשתמש ולשלוט עם תוכנה לביצוע ניסויים אופטוגנטיים באמצעות UVR8 13,14, Dronpa 15,16, תחומי LOV 17,18, פונקציית צעד Opsins 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, פיטוכרום חיידקי26,27,28,29 ומערכות אחרות המגיבות לאור 30,31,32.
פרוטוקול זה מהווה הדרכה להרכבת המעגלים וחומרה אחרת הדרושה לשליטה בפרמטרים שונים לגירוי אור, כמו גם בכלים המולקולריים/תאיים לביצוע ניסוי אופטוגנטי. בנוסף, אנו מדווחים על פלסמידים שעברו אופטימיזציה מ- Kyriakakis et al.4 שהם קטנים ויציבים יותר לשיבוט. באמצעות פרוטוקול זה, ביולוגים ללא מומחיות באלקטרוניקה ואופטיקה יכולים לבנות מערכות תאורה גמישות וחזקות. באופן שלב אחר שלב, אנו מראים כיצד לבנות מערכות LED, תוך הסרת צוואר הבקבוק הטכני לאימוץ רחב יותר של כלים אופטוגנטיים. מערכת זו יכולה לשמש בקלות ברוב אינקובטורים תרבית תאים, גם אם הם אינם מכילים יציאות תיל. לדוגמה, שמרנו את מערכת ה- LED באינקובטור CO2 לח ברציפות במשך יותר מ -6 חודשים ללא ירידה בביצועים. אנו גם מסבירים כיצד לחבר את מערכת ה- LED למחשב ולממשק אותה עם תוכנת קוד פתוח שאנו מספקים ב- GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). בניית מערכת באמצעות פרוטוקול זה מספקת לחוקרים את הידע הבסיסי כדי לאתר באגים בבעיות פוטנציאליות, להחליף חלקים ולשפר/להרחיב פונקציונליות.
סקירה כללית של המערכת
בניית מערכת התאורה כוללת (1) בניית המעגל האלקטרוני, (2) בניית הציוד ההיקפי (כבל אספקת חשמל, מתג חשמל וכו’), (3) בניית נורות ה-LED, (4) הרכבת כל הרכיבים הללו, ו-(5) התקנת התוכנה לשליטה בנורות ה-LED באמצעות ממשק משתמש (איור 1A). לאחר השלמתה, מערכת התאורה יכולה לשלוט בעד ארבע נורות LED באופן עצמאי באמצעות ממשק משתמש (איור 1B). ממשק המשתמש מאפשר לכל נורית לדפוק בפרקי זמן מוגדרים ולכבות לאחר זמן מוגדר. יש גם עיכוב התחלה להתחיל תוכניות תאורה בזמן מוגדר. פוטנציומטרים (POTs) מווסתים את עוצמת כל נורית באופן עצמאי או שניתן להשתמש בהם לבקרת LED ידנית ללא מחשב. החוטים לנורות ה-LED יכולים להיות בכל אורך מותאם אישית, מה שמאפשר למקם אותם בקלות באינקובטור או בחלל מעבדה. בשל ההספק הגבוה של נורות אלה, ניתן להשתמש בהן כדי להאיר שטח גדול באמצעות נורית LED אחת מרחוק.
תיאור מנהל התקן LED
כדי להפעיל ולשלוט בעוצמת נורות ה- LED, פרוטוקול זה יעבור שלבים לבניית “מנהל התקן LED”. לכל נורית LED יש טווח מתחים שבהם היא פועלת (איור 1C). במהלך הפעולה, מתח היציאה של הרגולטור, השולט על עוצמת האור, יכול להיות מכוון על ידי פוטנציומטר. ה- POT משנה את ההתנגדות ומתאים את מתח / בהירות היציאה. כוונון עם POT של 1kΩ (1 קילו-אוהם) נותן את מה שאנו מכנים “מעגל מתח גבוה” ויש לו טווח של 1.35 וולט עד 2.9 וולט. מאחר ש-2.9 וולט הוא גבוה מדי להפעלת נורות ה-LED של המתח הנמוך יותר (איור 1C), אנו מראים שינוי יחיד (נגד 3 או “R3” משלים איור 1A) שמגביל את הטווח כך שיתאים לנורות המתח הנמוך. R3 משמש להקטנת המתח המרבי המופעל על נורות ה-LED ל-1.85 וולט (הרכבה המפורטת באיור משלים 8) במקביל לפוטנציומטר. על ידי שימוש במתח כדי לשלוט בבהירות במקום בזרם, המערכת גמישה יותר עבור נורות LED עם מתחי הפעלה שונים. איור 1C מכיל רשימה של נורות LED במתח גבוה ונמוך כדי להנחות את בחירת המעגלים האופטימלית. עיצוב זה שומר על מתח מינימלי נמוך מספיק, כך שהנורית כבויה לחלוטין כאשר הפוטנציומטר כבוי ואינו מאפשר למתח לעלות מעל מתח ההפעלה האופייני של נורית ה- LED. עבור אופטוגנטיקה של PhyB, אנו משתמשים בנורות LED אדומות עמוקות ואדומות רחוקות, המשתמשות במעגל מתח נמוך.
תיאור מערכת בקרת מחשב LED
מערכת תאורת LED יכולה לשמש להארה מתמדת ללא מחשב או מיקרו-בקר. עם זאת, עבור תוכניות פועמות ולשליטה בתזמון LED בודד, יש להתקין מיקרו-בקר. כדי להשתמש במיקרו-בקר לשליטה בנורות ה-LED, נדרש טרנזיסטור כדי לחבר את המיקרו-בקר למעגל. טרנזיסטור זה חש מתח מהמיקרו-בקר ועובר מלהיות מוליך או מבודד. כדי לשלוט ב”מופעל” וב”כבוי”, אנו משתמשים במה שנקרא “טרנזיסטור מסוג מיתוג NPN” (2N2222) כשאנט נשלט על פני R2 (איור משלים 1A). כאשר המתח מהמיקרו-בקר מוחל על בסיס הטרנזיסטור, הטרנזיסטור הופך למוליך והופך את מתח ה- LED לנמוך, ומכבה את ה- LED. לפיכך, מצבי LED וטרנזיסטור לסירוגין נשלטים ישירות על ידי המיקרו-בקר, הנשלט על ידי התוכנה המותקנת במחשב.
להכנת מערכת התאורה, נדרשים השלבים הבאים: בניית המעגל החשמלי; לבנות את ספק הכוח, מתג ההפעלה הידני, POTs וחיבור מיקרו-בקרים; לבנות את נורות ה- LED; להתאים קופסה שחורה שתתאים למערכת התאורה; לחבר את כל החיווט והמכשירים; להתקין את תוכנת בקרת LED, לעורר את התאים עם אור; למדוד ביטוי גנים באמצעות בדיקת לוציפראז כפולה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת ה-LED המתוארת כאן שימשה במעבדה שלנו כדי לייעל, לאפיין ולעבוד עם מספר כלים אופטוגנטיים. ב- Kyriakakis et al.4, בדקנו שילובים רבים של מתגי גנים PhyB-PIF במקביל. לאחר מכן השתמשנו במערכת זו כדי לבדוק פולסים של אור בתדרים שונים כדי למדוד את הקינטיקה של מתג הגנים ואת עוצמת האור האפקטיבית. מערכת זו שימשה גם לייעול ואפיון שתי מערכות אופטוגנטיות המשתמשות באור כחול לגירוי 5,6. מכיוון שרק נורית LED אחת צריכה להיות בהירה מספיק כדי להפעיל את רוב הכלים האופטוגנטיים, רכישת מערכת עם מספר רב של נורות LED מעל כל באר אינה תמיד הכרחית. התקנה זו זולה, אמינה, קלה להגדרה מחדש, ואינה דורשת מומחיות חשמלית קודמת כדי לעקוב אחר פרוטוקול ההרכבה.
באיורים המשלימים 31–38 אנו מתארים כיצד לשלב עד ארבע נורות LED במערכת. בעוד שזה עשוי להגביל כמה ניסויים הדורשים מספר רב של תנאים מקבילים, ניתן להוסיף נורות LED נוספות על ידי החלפת ספק הכוח 9 וולט המשמש בפרוטוקול זה בספק גבוה יותר. באופן דומה, ניתן לחבר מספר נורות LED בהספק נמוך יותר במקביל לכל מעגל. בסידור אחרון זה, חלק מנורות ה- LED לא יישלטו בנפרד, אך זה יכול להיות שימושי כאשר נורות LED רבות נדרשות לכסות שטח גדול יותר. לאחר היכרות עם האלקטרוניקה של מערכת זו, ישנן דרכים רבות להתאים אותו אישית. אסטרטגיות נוספות להתאמה אישית של המערכת כוללות הצבת נורית ה-LED רחוק יותר או קרוב יותר לדגימה ותאורה באמצעות מסננים/מפזרי תאורה לתנאי תאורה הומוגניים או למניעת חימום כמו ב-(איור משלים 23) ו-Allen et al.5. תכונה בולטת נוספת בעיצוב ה- LED שלנו היא שהיא עטופה באפוקסי ויש לה מהדק מגע בגב; זה מאפשר למקם את הנורית בצורה מאובטחת בקלות כמעט בכל מקום: באינקובטורים, מיכלי דגים, כלובי בעלי חיים, קירות וכו ‘.
ניסויים רבים המשתמשים באופטוגנטיקה כדי לשלוט בגנים, מסלולי איתות ופעילות תאית אחרת דורשים לעתים קרובות פעימות, משתרעים על פני טווחי זמן גדולים, או צריכים להתבצע באינקובטור, ולכן דורשים אוטומציה או מניפולציה מרחוק ללא מיקרוסקופ. מערכת LED זו נבדקה ברציפות במשך מספר חודשים בתוך אינקובטור CO2 לח ללא בעיות. בנוסף, עם מערכות הפיכות כגון מערכות אופטוגנטיות PhyB, ייתכן שהנסיין יצטרך לתכנת לוחות זמנים ספציפיים להארה פועמת. בעבודה הקודמת שלנו4, השתמשנו בתוכניות פועמות כדי לבחון את דינמיקת ההפיכות של מתג PhyB-PIF3 בתאי יונקים דרך ממשק המשתמש. באמצעות המתודולוגיה המתוארת בכתב יד זה, תכנות פרוטוקול פועם הוא קל, ומספק את הגמישות והאוטונומיה הדרושות לסוגים רבים של ניסויים אופטוגנטיים באופן ידידותי למשתמש.
השלבים הקריטיים ביותר בבניית מערכת זו כוללים הרכבת המעגל החשמלי בלוח המעגלים המודפסים וחיבור הרכיבים, המפורטים בסעיף 1 ובסעיף 2. חשוב לעקוב בקפידה אחר כל שלב בסעיפים אלה ולבדוק שוב את מספרי חורי הסיכה שורה אחר שורה לפני הלחמה של כל רכיב. סעיף 2 מסביר כיצד להגדיר את הרכיבים שיחוברו למעגל. כדי שהרכיבים יתחברו בכיוון הנכון, חשוב במיוחד לוודא שהצבעים של החוטים השחורים והאדומים במחברי חוט לחוט תואמים. סביר להניח שמחדלים קטנים בשני סעיפים אלה ישפיעו על תפקוד המערכת. ואכן, השלב הראשון בפתרון בעיות בשיטה זו יהיה לבדוק שהמעגל נבנה כראוי ושכל החיבורים נמצאים במקום. שנית, בדיקת איכות ההלחמה לחיבורים רופפים והחוטים לחוטים מתלקחים שעלולים לקצר את המעגל היא בעלת חשיבות מיוחדת. צעד שלישי יהיה לוודא כי נורות LED פועלות כראוי, אשר ניתן לעשות זאת באמצעות ספק כוח או סוללה 1.5 V על ידי חיתוך שני הדקים של LED עם קליפסים תנין. שיקול קריטי נוסף הוא למנוע חימום (בעת שימוש בנורות LED בהספק גבוה) או פיזור האור להארה רחבה יותר. כדי לענות על שיקולים אלה, ניתן להתקין את נורות ה-LED מחוץ לקופסה שחורה עם “סרט פרטיות” מבפנים, כפי שמתואר באיור משלים 23 וב-Allen et al.5. בגלל הפשטות של מערכת זו, פירוק זה כדי לאמת, לשנות, לשדרג או לתקן רכיבים מודולריים אינו קשה.
גורם קריטי נוסף עבור מערכות גנים המושרות הוא לשקול כמה הפעלה נדרשת או כמה דליפה מקובלת עבור המערכת הביולוגית המבוקרת. כפי שניתן לראות באיור 6, אלה יכולים להשתנות עם כמות הדנ”א של המדווח. בנוסף, יעילות ההעברה, ולכן, מספר העותק של מבנים כתב בכל תא ישתנה. זה עשוי להיות יתרון עבור ניסויים מסוימים לעשות קו תאים עם כמות קבועה של כתב או רכיבי מתג הגן PhyB ומסך עבור שיבוטים עם טווח רצוי של ביטוי מושרה, כפי שנעשה בדרך כלל עם מערכות השראת סמים. בשל הגודל וחוסר היציבות של פלסמיד לנטיויראלי pPK-2304, יצרנו גם גרסאות פלסמיד לא לנטיויראלי של מתג PhyB בעמוד השדרה של pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) ו- pPK-352 (Addgene #157922).
על ידי בניית מערכת תאורת LED זו בעקבות פרוטוקול זה, למשתמשים יש את כל הרכיבים הדרושים לביצוע מגוון רחב של ניסויים אופטוגנטיים במבחנה ו- in vivo. בשילוב עם ההוראות לשימוש ב- PhyB-PIF3 בתאי יונקים, פרוטוקול זה יאפשר לאנשים שאינם מהנדסים וביולוגים להשתמש באופטוגנטיקה מבוססת PhyB במגוון הקשרים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ליינגשיאו (פיטר) וואנג, זיליאנג הואנג ומולי אלן על בדיקת גרסאות שונות של מערכת LED בזמן פיתוחה. עבודה זו נתמכה על ידי מכון קוולי למוח ונפש באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו ומכון סאלק, הקרן הלאומית למדע באמצעות מרכז NSF למדע המידע תחת מענק CCF-0939370, מענק NIH NS060847 ומענק NIH R21DC018237.
Materials
| 18AWG 2pin RED Black wire | Amazon | 15M-28AWG-2468 | Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| 1K Ohm potentiometer | Amazon | 52161500 | 2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| 20 Gauge Silicone JST Connector | Amazon | SIM&NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| 22 AWG solid jumper wires | Amazon | WJW-60B-R | Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| 560 ohm 1/2watt 1% tolerance | Amazon | a14051600ux0301 | Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN |
| 820 ohm 1/2watt 1% tolerance | Amazon | TTL-A-8035-50Ea | Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor |
| A Male to B Male Cable (10 Feet) | Amazon | Part# 30-001-10B | The cable that comes with the Arduino doesn't fit well in the box. https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Ardiuino UNO equivilent | Amazon | Elegoo EL-CB-001 | UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Arduino holder | Digikey | X000018 | Fits very snug. https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632 |
| Black boxes for circuits and light chambers | Amazon | 1591ESBK | Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Blue LED | Digikey | LXML-PB01-0040 | LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134 |
| Cable ties | Amazon | sd027 | Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
| Command Fridge Clips | Amazon | 17210CLR | Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| Cyan LED | Digikey | LXML-PE01-0070 | LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd |
| Electrical tape – 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack | Amazon | 03429NA | Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK |
| Farred LED 720nm | Luxeon Star LEDs | LXML-PF01 | Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW |
| Farred LED 740nm | Ushio | EDC740D-1100-S5 | Uses "STAR XP 3535" base https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf |
| Farred LED 780nm | Ushio | EDC780D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf |
| Farred LED 810nm | Ushio | EDC810D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf |
| Farred LED 850nm | Ushio | EDC850D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf |
| Grommets | Amazon | Pico 6120D | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G |
| Hair/Alligator Clips | Amazon | 1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
|
| LED base | Luxeon Star LEDs | LXB-RS20A | Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds |
| LED PCB fopr Ushio LEDs | Adura LED solutions | STAR XP 3535 Package LED | Fits many other LEDs by Ushio http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led |
| Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe | Amazon | 1943587 | Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C |
| NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS | Amazon | B000FIDTYG | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| Picture Hanging Velcro Strips | Amazon | PH204-16NA | With these you can hang the LEDs in many places. https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H |
| Power supply | Amazon | tb013 | Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1 |
| Power switch Rocker Switch | Amazon | SIXQJZML | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011 |
| Rectangular Connectors – for crimped wires | Digikey | 2183-1905-ND | 6 Rectangular Connectors – Housings Black 0.100" (2.54mm) https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB |
| Red LED | Digikey | LXM3-PD01 | LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd |
| Sandpaper | Amazon | B002NEV6GS | 3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1 |
| Solder for soldering wires and circuit components | Amazon | Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY |
| Solder-able Breadboard for building the circuit | Amazon | GK1007 | Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Spade drill bit | Amazon | Irwin 88811 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit |
| Transistor | Newark | 2N2222A | Can buy from many places. http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197 |
| Voltage regulator | Newark | LM317T | Equivilent to NTE956. https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC |
| Windows 10 tablet | Amazon | B08BYTT79Y | Any Windows 10 PC will do. https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1 |
| Cell Culture Reagents | |||
| Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 | ATCC | ATCC CRL-1573 | Common Cell line. https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose | ThermoFisher | 11965−092 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118 |
| 10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122 |
| White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates | ThermoFisher | 07-200-589 | White plates are preferred. Do not use clear plates. https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852 |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | PolySciences | 24765-1 | Can be replaced with another transfection reagent. https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/ |
| Name of Equipment | |||
| Diagonal Cutting Plier (110mm) | Amazon | Proskit 1PK-037S | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11 |
| Dremil 3000 with cutting tool and grinder | Amazon | Dremel 3000 | Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3 |
| Dremil cutting and grinding tool | Amazon | Dremel 200-1/15 | Any similar Dremil will work. https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
| Dremil grinding tip | Amazon | Dremel 84922 | Silicon Carbide Grinding Stone. https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922 |
| EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT | Amazon | DS017 | For removing solder/mistakes. https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI |
| Helping Hand with Magnifying Glass | Amazon | SE MZ101B | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch |
| Pointed Nose Micro Pliers | Amazon | Hakko CHP PN-20-M | Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
| Small screw drivers | Amazon | Wiha 26197 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set |
| Soldering iron | Amazon | Yihua 939D+ Digital Soldering Station | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR |
| TraceTech No-Clean Flux Pen | Amazon | 2507-N | Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1 |
| Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber | Amazon | WSA350 | For soldering safety. https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK |
| Wire strippers | Amazon | CSP-30-7 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG |
| IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG | Amazon | IWS-3220M | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
References
- Klewer, L., Wu, Y. W. Light-induced dimerization approaches to control cellular processes. Chemistry – A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).
- Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms. Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).
- Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology. Advanced Science. 6 (1), 1800952 (2019).
- Kyriakakis, P., et al. Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 706-717 (2018).
- Allen, M. E., et al. An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics. ACS Synthetic Biology. 8 (10), 2359-2371 (2019).
- Huang, Z., et al. Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy. Science Advances. 6 (8), (2020).
- Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production. Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).
- Hernández-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2). Methods. 164-165, 81-90 (2019).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).
- Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch. Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
- Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nature Communications. 4, 1779 (2013).
- Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. A light-triggered protein secretion system. The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nature Communications. 6, 6256 (2015).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).
- Gong, X., et al. An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques. Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Levskaya, A., et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).
- Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
- Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).
- Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. Engineering an E. coli near-infrared light sensor. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 240-248 (2018).
- Zhang, W., et al. Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl. Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).
- Lee, D., et al. Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain. Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).
- Kim, M. W., et al. Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout. eLife. 6, (2017).
