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Bioengineering

Construire un système d’éclairage simple et polyvalent pour les expériences optogénétiques

Published: January 12, 2021
doi:
10.3791/61914
, , , , , , , , , ,
1Department of Bioengineering,University of California, San Diego, 2University of California, San Diego, 3Department of Mathematical Computational, and Systems biology,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

Ce protocole décrit comment effectuer des expériences optogénétiques pour contrôler l’expression des gènes avec la lumière rouge et rouge lointain en utilisant PhyB et PIF3. Vous y trouverez des instructions étape par étape pour la construction d’un système d’éclairage simple et flexible, qui permet le contrôle de l’expression génique ou d’autres optogénétiques avec un ordinateur.

Abstract

Le contrôle des processus biologiques à l’aide de la lumière a augmenté la précision et la vitesse avec lesquelles les chercheurs peuvent manipuler de nombreux processus biologiques. Le contrôle optique permet une capacité sans précédent de disséquer la fonction et a le potentiel de permettre de nouvelles thérapies génétiques. Cependant, les expériences optogénétiques nécessitent des sources lumineuses adéquates avec un contrôle spatial, temporel ou d’intensité, souvent un goulot d’étranglement pour les chercheurs. Ici, nous détaillons comment construire un système d’éclairage LED peu coûteux et polyvalent qui est facilement personnalisable pour différents outils optogénétiques disponibles. Ce système est configurable pour un contrôle manuel ou informatique avec une intensité LED réglable. Nous fournissons un guide illustré étape par étape pour la construction du circuit, le rendre contrôlé par ordinateur et la construction des LED. Pour faciliter l’assemblage de cet appareil, nous discutons également de quelques techniques de soudure de base et expliquons les circuits utilisés pour contrôler les LED. Grâce à notre interface utilisateur open source, les utilisateurs peuvent automatiser la synchronisation précise et les pulsations de la lumière sur un ordinateur personnel (PC) ou une tablette bon marché. Cette automatisation rend le système utile pour les expériences qui utilisent des LED pour contrôler les gènes, les voies de signalisation et d’autres activités cellulaires qui couvrent de grandes échelles de temps. Pour ce protocole, aucune expertise préalable en électronique n’est requise pour construire toutes les pièces nécessaires ou pour utiliser le système d’éclairage pour effectuer des expériences optogénétiques.

Introduction

Les outils optogénétiques deviennent omniprésents et de nouvelles technologies sont constamment développées pour contrôler optiquement les processus biologiques tels que l’expression des gènes, la signalisation cellulaire et bien d’autres 1,2,3. La capacité de contrôler les processus cellulaires avec la lumière permet une cinétique rapide, un contrôle spatial serré et une régulation dose-dépendante qui peut être contrôlée par l’intensité lumineuse et le temps d’exposition. Pour utiliser ces outils, un dispositif permettant de contrôler ces paramètres est nécessaire. Nous avons récemment développé un commutateur génétique de mammifère PhyB-PIF3 codé qui active et désactive de manière réversible les gènes en utilisant la lumière rouge/rouge-lointaine, respectivement4. Ce système a été testé dans plusieurs lignées cellulaires de mammifères et a permis l’induction inégalée de l’expression génique même avec de très petites quantités de lumière, y compris des impulsions de lumière. Les chercheurs qui souhaitent utiliser l’interrupteur PhyB et des outils similaires 5,6 demandent fréquemment des informations sur les méthodes de contrôle de l’intensité et de la durée de l’éclairage. Par conséquent, nous avons développé ce protocole avec des instructions étape par étape pour permettre une adoption plus large de ces outils pour l’optogénétique.

Avant l’utilisation généralisée des LED, des sources lumineuses à large bande avec filtres étaient utilisées pour étudier les protéines sensibles à la lumière telles que les phytochromes7. Récemment, certains systèmes d’éclairage DEL ont été publiés avec les outils optogénétiques 8,9,10,11,12, mais ces protocoles peuvent nécessiter une expertise importante en électronique / logiciel, nécessitent de l’équipement spécialisé (par exemple, des imprimantes 3D, des machines de découpe laser ou des photomasques) ou ne fournissent pas les instructions étape par étape que certains chercheurs devraient déployer pour leurs besoins de recherche. Bien qu’un contrôle indépendant des puits individuels dans une plaque multipuits puisse être utile, il est souvent inutile lorsque les chercheurs n’ont besoin de comparer que plusieurs échantillons différents dans la lumière claire et l’obscurité ou la lumière rouge par rapport à la lumière rouge lointain. En outre, de nombreux systèmes commerciaux existants sont coûteux, avec une capacité de personnalisation limitée. Cependant, les LED décrites dans ce protocole sont rentables, lumineuses et peuvent être montées de plusieurs façons; Par conséquent, ils peuvent être utilisés pour éclairer plusieurs types d’échantillons différents. Avec le protocole et le logiciel fournis, les LED allant de l’ultraviolet (UV) au NIR peuvent être utilisées et contrôlées avec un logiciel pour effectuer des expériences optogénétiques en utilisant UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV domains 17,18, Step Function Opsins 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ,25, phytochromes bactériens26,27,28,29 et autres systèmes photosensibles 30,31,32.

Ce protocole constitue un tutoriel pour l’assemblage des circuits et autres matériels nécessaires pour contrôler différents paramètres de stimulation lumineuse ainsi que les outils moléculaires/cellulaires pour mener une expérience optogénétique. De plus, nous rapportons des plasmides optimisés à partir de Kyriakakis et al.4 qui sont plus petits et plus stables pour le clonage. Grâce à ce protocole, les biologistes sans expertise en électronique et en optique peuvent construire des systèmes d’éclairage flexibles et robustes. Étape par étape, nous montrons comment construire des systèmes LED, en supprimant le goulot d’étranglement technique pour une adoption plus large des outils optogénétiques. Ce système peut facilement être utilisé dans la plupart des incubateurs de culture cellulaire, même s’ils ne contiennent pas de ports filaires. Par exemple, nous avons conservé le système LED dans un incubateur de CO2 humidifié en continu pendant plus de 6 mois sans diminution des performances. Nous expliquons également comment connecter le système LED à un ordinateur et l’interfacer avec un logiciel open source que nous fournissons sur GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). La construction d’un système utilisant ce protocole fournit aux chercheurs les connaissances de base pour déboguer les problèmes potentiels, remplacer des pièces et améliorer/étendre les fonctionnalités.

Vue d’ensemble du système

La construction du système d’éclairage implique (1) la construction du circuit électronique, (2) la construction des périphériques (cordon d’alimentation, interrupteur d’alimentation, etc.), (3) la construction des LED, (4) l’assemblage de tous ces composants et (5) l’installation du logiciel pour contrôler les LED avec une interface utilisateur (Figure 1A). Une fois terminé, le système d’éclairage peut contrôler jusqu’à quatre LED indépendamment avec une interface utilisateur (Figure 1B). L’interface utilisateur permet à chaque LED d’émettre des impulsions à des intervalles de temps spécifiés et de s’éteindre après un temps spécifié. Il y a aussi un délai de démarrage-début pour commencer les programmes d’éclairage à une heure spécifiée. Les potentiomètres (POT) régulent l’intensité de chaque LED indépendamment ou peuvent être utilisés pour le contrôle manuel des LED sans ordinateur. Les fils des LED peuvent être de n’importe quelle longueur personnalisée, ce qui leur permet d’être facilement placés dans un incubateur ou un espace de laboratoire. En raison de la puissance élevée de ces LED, elles peuvent être utilisées pour éclairer une grande surface avec une seule LED à distance.

Description du pilote LED

Pour alimenter et contrôler l’intensité des LED, ce protocole passera par des étapes pour construire un « pilote LED ». Chaque LED a une plage de tensions dans laquelle elle fonctionne (Figure 1C). Pendant le fonctionnement, la tension de sortie du régulateur, qui contrôle l’intensité lumineuse, peut être réglée par un potentiomètre. Le POT fait varier la résistance, en ajustant la tension / luminosité de sortie. Le réglage avec un POT de 1 kΩ (1 kilo-ohm) donne ce que nous appelons le « circuit haute tension » et a une plage de 1,35 V à 2,9 V. Étant donné que 2,9 V est trop élevé pour faire fonctionner les LED basse tension (Figure 1C), nous montrons une seule modification (Résistance 3 ou Figure 1A supplémentaire « R3 ») qui limite la plage pour correspondre aux LED basse tension. R3 sert à diminuer la tension maximale appliquée aux LED à 1,85 V (ensemble détaillé dans la figure supplémentaire 8) lorsqu’il est en parallèle avec le potentiomètre. En utilisant la tension pour contrôler la luminosité au lieu du courant, le système est plus flexible pour les LED avec différentes tensions de fonctionnement. La Figure 1C contient une liste des voyants haute et basse tension pour guider la sélection optimale du circuit. Cette conception maintient la tension minimale suffisamment basse pour que la LED soit complètement éteinte lorsque le potentiomètre est éteint et ne permet pas à la tension de dépasser la tension de fonctionnement typique de la LED. Pour l’optogénétique PhyB, nous utilisons des LED rouge foncé et rouge lointain, qui utilisent le circuit basse tension.

Description du système de contrôle informatique LED

Le système d’éclairage LED peut être utilisé pour un éclairage constant sans ordinateur ni microcontrôleur. Cependant, pour les programmes pulsés et pour contrôler la synchronisation individuelle des LED, un microcontrôleur doit être installé. Pour utiliser un microcontrôleur pour contrôler les LED, un transistor est nécessaire pour connecter le microcontrôleur au circuit. Ce transistor détecte la tension du microcontrôleur et passe de la conductivité ou de l’isolation. Pour contrôler le « on » et « off », nous utilisons ce qu’on appelle un « transistor de type commutation NPN » (2N2222) comme shunt contrôlable à travers R2 (Figure supplémentaire 1A). Lorsque la tension du microcontrôleur est appliquée à la base du transistor, le transistor devient conducteur et rend la tension de la LED faible, éteignant la LED. Ainsi, les états d’allumage et d’arrêt de la LED et du transistor sont directement contrôlés par le microcontrôleur, qui est contrôlé par le logiciel installé sur le PC.

Pour fabriquer le système d’éclairage, les étapes suivantes sont nécessaires: Construire le circuit électrique; construire l’alimentation, l’interrupteur d’alimentation manuel, les POT et la connexion du microcontrôleur; construire les LED; accueillir une boîte noire pour s’adapter au système d’éclairage; connecter tout le câblage et les appareils; installer le logiciel de contrôle LED, stimuler les cellules avec de la lumière; Mesurer l’expression génique à l’aide d’un double test de luciférase.

Protocol

1. Construire le circuit électrique REMARQUE: Le protocole de construction d’un circuit unique pour une LED disponible est décrit ici. Des instructions pour étendre cela jusqu’à quatre LED sont incluses dans les informations supplémentaires. Allumez l’absorbeur de fumée et le fer à souder. Ajoutez de l’eau à l’éponge d’essuyage, ayez la soudure à portée de main.ATTENTION : Assurez-vous de prendre des mesures de sécurité pour éliminer la fumée et prévenir les brûlures. Commencez à souder les composants du circuit imprimé sur la carte de circuit imprimé (carte PCB) dans l’ordre indiqué dans les panneaux supplémentaires.REMARQUE: Utilisez une petite quantité de soudure sur la pointe de fer à souder pour chauffer d’abord le métal du composant et de la carte PCB et faites fondre la soudure supplémentaire directement sur les composants; Le flux peut beaucoup aider. Fils et composants de cavalier de soudure (Figure supplémentaire 2 et Figure 3 supplémentaire).Pour les fils de démarrage (le câblage isolé qui relie deux points sur la carte de circuit imprimé), utilisez deux morceaux de fils orange [7,6 mm (0,3 pouce)] et jaune [12 mm (0,4 pouce)] du kit de démarrage. Fixez la carte PCB sur les « mains secourables » et insérez les fils de démarrage dans les trous d’épingle suivants, pliez les bornes de 45 degrés et ajoutez du flux (Figure 2, Figure 2 supplémentaire et Figure 3 supplémentaire) : a1 et a3 → masse (-) (orange), a7 →alimentation (+) #7 (jaune), d2 → d6 (jaune). Souder puis couper l’arrière des fils. Insérez le régulateur de tension LM317T dans les trous d’épingle suivants, pliez les broches et ajoutez du flux (Figure 2 et Figure 4 supplémentaire) : Adj → e5, V→ e6, Vdans → e7. Soudez d’abord les bornes gauche et droite, coupez-les, puis soudez et coupez la borne du milieu. Pour régler la plage basse tension du circuit, insérez une résistance 820 Ω jusque dans les trous d’épingle, soudez et coupez c2 → c5 (Figure 2 et Figure 5 supplémentaire). Pour activer la commande LED par le microcontrôleur, insérez le transistor dans b3–b5 (Figure 2 et Figure 6 supplémentaire) : Collecteur → b3, Base → b4, Emitter → b5.REMARQUE: Soyez conscient de l’orientation du transistor à insérer correctement; vérifiez les spécifications pour trouver la désignation Collecteur, Base et Émetteur. Soudez les connecteurs fil à fil pour le POT, le LED, le microcontrôleur et la source d’alimentation.REMARQUE: Faites attention à la couleur des fils des connecteurs fil à fil et si vous utilisez un connecteur fil à fil femelle ou mâle.Déterminez si un circuit « basse tension » ou un circuit « haute tension » est requis pour le voyant souhaité (Figure 1C).REMARQUE: Si la LED est sur la liste « basse tension », une résistance en parallèle avec le POT est nécessaire. Pour le circuit « basse tension » ou « haute tension », placez le fil d’un connecteur fil à fil femelle dans le trou a5 (figure supplémentaire 7). Ne soudez pas encore en place si vous faites le circuit basse tension.REMARQUE: Tournez les extrémités nues du fil de fer afin que les petits poils de fil ne s’écaillent pas. Si le fil semble trop épais pour passer à travers le trou d’épingle sans s’effilocher, coupez 2 à 6 brins, puis retordez-les ensemble (figure supplémentaire 7B–D). Si vous utilisez le circuit « haute tension », passez à l’étape 1.4.5. Si vous faites le circuit « basse tension », poussez une résistance 560Ω à travers le même trou (a5) et soudez avec le fil du connecteur fil à fil. Connectez l’autre extrémité de la résistance à la masse (Figure supplémentaire 7G). Insérez l’autre extrémité du connecteur fil à fil femelle soudé dans un trou a5 le reliant à la terre et soudez-le (figure supplémentaire 8A,B). Pour la connexion du microcontrôleur, insérez une extrémité d’un connecteur fil à fil mâle dans le trou a4 et l’autre dans un trou relié à la terre (Figure supplémentaire 9A–C). Pour la connexion LED, insérer une extrémité d’un connecteur fil-à-fil femelle dans le trou a2 et l’autre extrémité dans un trou relié à la terre (figure supplémentaire 9D,E). 2. Construire une alimentation, un interrupteur d’alimentation manuel, des POT et une connexion de microcontrôleur Construisez l’alimentation.Souder un cavalier orange [7,6 mm (0,3 pouce)] de A29 au sol (figure supplémentaire 10). Souder un connecteur fil à fil femelle de a30 au bloc d’alimentation (+) (Figure supplémentaire 11A–C). Souder un connecteur fil-à-fil mâle de c29 à c30 (figure supplémentaire 11D–F). Coupez le connecteur d’un cordon d’alimentation, exposez les fils et dénudez-les (Figure supplémentaire 12A–C). Ajoutez du flux aux fils avant de souder à l’aide d’un stylo flux (Figure supplémentaire 3G). Placez un tube rétractable de 3,18 mm (1/8 po) autour d’un connecteur fil-à-fil mâle et une pièce plus épaisse de 4,76 mm (3/16 po) sur le fil d’alimentation (figure supplémentaire 12D). Tournez les fils du bloc d’alimentation et du connecteur fil à fil mâle ensemble et soudez (Figure supplémentaire 12E, 13A,B). Placez le tube rétractable de plus petit diamètre de 3,18 mm (1/8 pouce) sur les raccords et rétrécissez-les à l’aide d’un pistolet thermique (figure supplémentaire 13C,D). Placer un tube rétractable de plus grand diamètre de 4,76 mm (3/16 po) sur le tube rétractable plus petit de 3,18 mm (1/8 po) et chauffer à nouveau (figure supplémentaire 13E,F). Construisez l’interrupteur d’alimentation manuel.Placez le tube rétractable à 3,18 mm (1/8 pouce) au-dessus des fils de l’interrupteur (figure supplémentaire 14A). Tournez et soudez les fils d’un connecteur fil à fil mâle (figure supplémentaire 14B,C). Placer le tube rétractable de 3,18 mm (1/8 pouce) sur les sections soudées et rétrécir à l’aide d’un pistolet thermique (figure supplémentaire 14D,E). Connectez le connecteur fil à fil mâle au POT.Boucler le fil noir du connecteur fil à fil autour de la borne centrale du POT (figure supplémentaire 15B). Tournez le fil qui est enroulé étroitement autour de la borne et soudez-le (figure supplémentaire 15C).REMARQUE: Une petite pince de précision peut aider à faire une torsion serrée. Répétez l’opération avec le fil rouge raccord avec la borne, comme dans la figure supplémentaire 15D. Utilisez une pince pour briser la languette métallique près de la flèche rouge (figure supplémentaire 15E,F). Construisez la connexion du microcontrôleur (nécessaire uniquement pour les LED contrôlées par ordinateur).Si vous fabriquez un pilote LED pour plus d’une LED, coupez les fils noirs de tous les connecteurs fil-à-fil femelles sauf un (Figure supplémentaire 16A). Sertir les extrémités des connecteurs fil-à-fil, comme illustré (Figure supplémentaire 16B–D). Poussez les extrémités serties à travers le connecteur rectangulaire (figure supplémentaire 16E). 3. Construisez les LED Dénuder les extrémités du fil (~5 mm) et appliquer le flux à l’aide d’un stylo de flux comme dans la figure supplémentaire 3G.REMARQUE: Pour souder efficacement les fils sur la base LED, un flux doit être ajouté aux contacts de la base LED et des fils. Étamer le fil en le chauffant par le bas et en ajoutant de la soudure par le haut (figure supplémentaire 17B). Utilisez le stylet de flux pour placer le flux sur le contact de surface de la base LED (Figure supplémentaire 17C). Placez une quantité généreuse de soudure sur une grande pointe de soudure (~4–5 mm) (Figure supplémentaire 17D), utilisez-la pour chauffer la base LED au contact (Figure supplémentaire 17E). Après quelques secondes, faites glisser la soudure sur le contact (Figure supplémentaire 17F). Répétez les étapes 3.3 à 3.4 sur l’autre contact (figure supplémentaire 17G).ATTENTION: La base LED peut devenir très chaude pendant la soudure. Placez la base LED sur une surface qui ne fondra pas et ne brûlera pas. Fixez le fil noir sur le contact « C+ » (la cathode) à l’aide des pinces à cheveux (figure supplémentaire 18A). Placez une quantité généreuse de soudure sur la grande pointe de soudure (Figure supplémentaire 18B) et appuyez sur le fil jusqu’à ce que la soudure de la base de la LED fonde (Figure supplémentaire 18C). Maintenez le fil enfoncé (figure supplémentaire 18D) et retirez le fer à souder tout en maintenant le fil en place (figure supplémentaire 18E). Placez une petite quantité de pâte à souder sur les tampons pour les raccords LED (Figure supplémentaire 19A,B) et placez la LED sur les tampons à l’aide de pinces (Figure supplémentaire 19C).REMARQUE: Si le placement est un peu décalé, ce n’est pas grave; Il se mettra en place une fois que la pâte à souder fondra. Tenez le fil rouge sur le « A+ » (anode) et clipsez-le avec une pince à cheveux (figure supplémentaire 20A–C). Placez une quantité généreuse de soudure sur la grande pointe de soudure (figure supplémentaire 20D) et appuyez sur le fil jusqu’à ce que la soudure sur la base de la LED et la pâte à souder sous la LED fondent (figure supplémentaire 20E).REMARQUE: Une fois la pâte à souder fondue, la couleur devient argentée (Figure supplémentaire 20H, I). Choisissez la longueur du fil nécessaire pour la configuration souhaitée. Dénudez les fils LED et un connecteur fil à fil mâle (Figure supplémentaire 21A), puis ajoutez le flux comme dans la Figure supplémentaire 3G. Placez le tube rétractable sur les fils. Utiliser un tube rétractable de 3,18 mm (1/8 pouce) au-dessus des connecteurs fil à fil et un tube rétractable de 4,76 mm (3/16 po) au-dessus du fil (figure supplémentaire 21B). Clipsez le connecteur fil à fil avec une « main secourable » et tournez l’extrémité du connecteur avec le fil (figure supplémentaire 21C) et soudez-les. Répéter avec l’autre fil (figure supplémentaire 21D,E). Placez les tubes rétractables de 3,18 mm (1/8 po) sur la soudure et rétractez (figure supplémentaire 21F–G). Placer le tube rétractable de 4,76 mm (3/16 po) sur le tube rétractable de 3,18 mm (1/8 po) et rétrécir (figure supplémentaire 21H–I). Fixez les fils de la LED sur les « mains secourables » avec du ruban adhésif en dessous (Figure supplémentaire 22A). Mélanger l’époxy selon les instructions du fabricant et étaler sur le dessus de la LED soudée (Figure supplémentaire 22B). Laisser toute la nuit pour guérir. Si le montage est effectué à l’aide d’une attache tactile, coupez un petit morceau de la fixation tactile (Figure supplémentaire 23A) et pressez-le contre l’arrière de la LED pendant 30 s. Utilisez un outil rotatif à grande vitesse pour faire une encoche sur le couvercle d’une boîte noire (figure supplémentaire 23C–E). Construisez un support pour une seule LED à travers un film d’intimité.À l’aide du foret à bêche, percez un trou de 1,75 cm (11/16 po) dans le haut d’une boîte noire où la DEL sera placée (figure supplémentaire 24A). À l’aide d’un outil rotatif à grande vitesse, faites une encoche d’un côté du trou pour faire de la place pour le fil LED, comme illustré à la figure supplémentaire 24A. Découpez un morceau de film d’intimité (25 à 30 mm) et collez du ruban adhésif à l’intérieur de la boîte noire recouvrant le trou par lequel la LED éclairera (figure supplémentaire 24A). Placez le voyant à l’extérieur de la boîte noire au-dessus du trou avec un film d’intimité et du ruban adhésif en place avec du ruban électrique (figure supplémentaire 24B–E). 4. Accueillir une boîte noire pour s’adapter au système d’éclairage Pour un système à quatre DEL, percez quatre trous de 0,83 cm (21/64 po) sur le couvercle à 3,81 cm (1,5 po) l’un de l’autre à l’endroit où les potentiomètres seront fixés (figure supplémentaire 25). À l’aide d’un outil rotatif à grande vitesse, percez un trou rectangulaire de 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 pouce x 0,75 pouce) dans le coin supérieur gauche (figure supplémentaire 25). À l’aide du foret à bêche, percez un trou de 1,75 cm (11/16 po) sur la boîte noire (figure supplémentaire 26). Limer les trous et insérer l’œillet dans le trou percé (figure supplémentaire 26). Pour les LED contrôlées par ordinateur, du papier sablé la zone où le microcontrôleur sera collé dans une boîte noire, ainsi que la face inférieure du support du microcontrôleur. Enclenchez le microcontrôleur sur le support avant de le fixer dans la boîte noire, puis époxy en place (Figure supplémentaire 27A). Utilisez du papier de verre pour poncer le fond de deux clips et la zone dans une boîte noire où le circuit sera placé et fixez les clips à l’intérieur de la boîte noire avec l’époxy (figure supplémentaire 27A). Fixez la carte PCB dans des clips (Figure supplémentaire 27B). Poussez l’interrupteur d’alimentation à travers le trou carré du couvercle de la figure supplémentaire 25 et enclenchez-le en place (figure supplémentaire 28A). Poussez les POTs à travers les trous du couvercle, vissez en place (Figure supplémentaire 28A) et placez le bouton sur le POT (Figure supplémentaire 28B). 5. Connectez tout le câblage et les appareils Étiquetez les connecteurs fil à fil (p. ex., LED, POT, COM) (figure supplémentaire 29A). Fixez les connecteurs serties fabriqués à l’étape 2.4 (figure supplémentaire 16) au connecteur fil à fil mâle entre les deux connecteurs femelles (POT et LED) (figures supplémentaires 7A et S37). Connectez les extrémités serties au microcontrôleur (Figure supplémentaire 30). Tirez le câble USB à travers l’œillet et branchez-le sur le microcontrôleur. Tirez les fils des LED à travers l’œillet et connectez-les au connecteur fil à fil femelle situé à gauche de la connexion du microcontrôleur (figures supplémentaires 9D et 38). Tirez le fil du bloc d’alimentation à travers l’œillet et connectez-le au connecteur fil à fil mâle situé sur le côté droit de la carte PCB (Figure supplémentaire 11D). Connectez le connecteur fil-à-fil mâle de l’interrupteur d’alimentation au connecteur fil à fil femelle situé à droite de la carte PCB (Figure supplémentaire 11A). Connectez les connecteurs fil à fil mâles des POT sur le couvercle aux connecteurs fil à fil femelles sur la carte PCB (figures supplémentaires 8 et 36).REMARQUE: N’allumez pas le circuit sans les potentiomètres connectés. 6. Installez le logiciel de contrôle LED REMARQUE: Consultez les instructions détaillées d’installation du logiciel dans le fichier supplémentaire sur Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces Téléchargez et installez le logiciel de programmation du microcontrôleur Téléchargez et installez le gestionnaire de paquets. Programmez le microcontrôleur. Téléchargez et installez le moteur d’exécution. Téléchargez l’interface utilisateur. 7. Stimuler les cellules avec de la lumière Transfect cellules HEK293.Plaquez des cellules HEK293 à 100k cellules par puits dans une plaque de 24 puits. Utilisez l’exemple de tableau pour calculer les milieux sans sérum, la polyéthylènemine (PEI) et les volumes d’ADN (figure supplémentaire 39) et transfecter à l’aide du protocole du fabricant. Stimuler les cellules avec de la lumière.REMARQUE: Les cellules doivent être conservées dans l’obscurité après la transfection ou manipulées à l’aide d’une source de lumière qui n’excite pas le système optogénétique.Décidez quel type de stimulation sera utilisé sur les cellules (lumière continue, intensité pulsée, etc.). Lorsque les POT sont éteints (dans le sens inverse des aiguilles d’une montre), allumez le bloc d’alimentation LED. Placez un posemètre à l’intérieur de la boîte noire où les cellules seront placées et placez le couvercle avec la LED sur le compteur. Ajustez l’intensité lumineuse au besoin. Si vous utilisez l’ordinateur pour contrôler les voyants, ouvrez le logiciel de l’interface utilisateur. Programmez l’interface utilisateur (Figure 5A,B).Sur le panneau supérieur gauche, sélectionnez le port COM du microcontrôleur et cliquez sur Connecter. Utilisez les panneaux à droite pour programmer chaque LED. Pour la lumière continue, sélectionnez n’importe quelle heure sauf zéro dans le « Time On » et réglez le « Time Off » sur zéro. Dans le panneau inférieur droit, programmez le contrôle de synchronisation principal.Pour retarder l’éclairage, sélectionnez un délai de démarrage (HH:MM). Pour éteindre tous les voyants après une heure désignée, sélectionnez une durée d’exécution (HH:MM). Démarrez le programme d’éclairage en cliquant sur le bouton Exécuter (Figure 5A). 8. Mesurer l’expression génique à l’aide d’un double test de luciférase Préparer le réactif de luciférase en mélangeant 10 mL de tampon luciférase avec le réactif de luciférase et aliquote dans des tubes de 1 mL à conserver à -80 °C pendant 1 an. Préparer le tampon de lyse 5x en 1x pour 100 μL pour les puits N+2. p. ex., pour 30 échantillons, 30 x 20 μL de tampon de lyse 5X et 30 x 80 μL de MQ H2O. Préparer la solution de substrat Renilla: 20 μL de substrat Renilla pour 1 mL de tampon Renilla (cette quantité convient à 10 dosages). Retirer les cellules de l’incubateur, aspirer le média, ajouter 100 μL de 1x tampon de lyse par puits et le placer sur un agitateur à 100 RPM pendant 15 min. Placer à -20 °C pendant au moins 1 h. Ajouter 100 μL de réactif luciférase par échantillon dans un puits d’une plaque blanche de 96 puits. Configurez le lecteur de plaques pour la luminescence. À l’aide du module luminomètre du lecteur de plaques, réglez l’intégration sur 1 s. Ajouter les lysats décongelés dans les puits sous le réactif de luciférase. À l’aide d’une pipette multicanaux, mélanger 20 μL d’échantillon dans le réactif de luciférase et mesurer immédiatement la luminescence. Après le plateau des lectures, ajouter 100 μL de solution de substrat Renilla et scanner à nouveau. Divisez le signal Luciferase par le signal Renilla pour tenir compte de l’efficacité de la transfection. Comparer les signaux de luciférase normalisés pour l’efficacité de la transfection (par exemple, comparer le signal des échantillons éclairés par la lumière rouge et de la lumière rouge lointaine).

Representative Results

Une fois que le circuit d’alimentation, l’alimentation, l’interrupteur d’alimentation, les POT et une LED sont assemblés (jusqu’à la figure supplémentaire 21), le circuit peut être testé. Avec tous les POT en place, le POT contrôlera l’intensité de la LED. Une fois l’assemblage terminé jusqu’à la figure supplémentaire 29, le système peut être utilisé manuellement pour l’optogénétique ou d’autres applications. L’alimentation complète du système peut être contrôlée manuellement avec l’interrupteur d’alimentation. L’intensité de chaque LED peut être contrôlée indépendamment à l’aide du POT connecté à chaque circuit. Après avoir installé le logiciel et programmé le microcontrôleur, l’interface utilisateur peut communiquer avec le microcontrôleur. Avec l’interface utilisateur, les LED peuvent être contrôlées temporellement de plusieurs manières: (1) chaque LED peut être programmée pour rester allumée pendant un temps spécifié, (2) chaque LED peut être programmée pour impulser, (3) un délai de démarrage global (par exemple, lors du transfectage et de la lumière brillante 24 heures plus tard) peut être programmé (Figure 6B), (4) la durée totale d’exécution du programme après le retard. Il existe deux interfaces utilisateur, l’une avec des boutons plus grands qui peuvent contrôler deux LED à la fois et l’autre qui peut contrôler quatre LED (Figure 5A,B). L’interface utilisateur à deux LED est optimisée pour les tablettes et est suffisante pour contrôler les LED rouges et rouges lointaines pour de nombreuses expériences. Pour les expériences plus importantes, la deuxième interface utilisateur peut être utilisée pour contrôler jusqu’à quatre LED. Lors de l’induction de l’expression génique, le résultat attendu dépend de plusieurs paramètres. Il s’agit notamment du temps d’induction, des niveaux d’induction (p. ex., quantité de lumière ou de médicament) et du nombre de copies de la construction inductible dans la cellule. Pour montrer cela, nous avons transfecté le commutateur du gène PhyB avec différentes quantités d’ADN rapporteur (pPK-202) (0,5%, 1%, 2%, 4% et 8% de l’ADN transfecté) (Figure 6A) et éclairé comme le montre la Figure 6B. Dans les échantillons contenant du PhyB, mais pas de plasmide pour produire de la phycocyanobiline (chromophore PCB) (c.-à-d. insensible à la lumière), l’expression/la fuite du gène de la luciférase augmente avec la quantité d’ADN rapporteur (figure 6C) (P rouge lointain < 0,0001, régression linéaire suivie d’un test de Wald) (P rouge < 0,0001, régression linéaire suivie d’un test de Wald). De plus, lorsque l’ensemble du commutateur du gène PhyB, y compris le plasmide producteur du chromophore PCB (cellules sensibles à la lumière), est éclairé pour la lumière rouge lointain, l’expression de la luciférase augmente également avec l’augmentation des quantités de construction du rapporteur dans le mélange de transfection (Figure 6C, D) (lumière rouge lointaine P < 0,0001, régression linéaire suivie d’un test de Wald). De même, lorsque les cellules sensibles à la lumière sont éclairées par la lumière rouge, l’expression de la luciférase augmente également avec l’augmentation de la quantité de rapporteur (P < 0,0001, régression linéaire suivie d’un test de Wald). En comparant les niveaux d’induction des cellules traitées à la lumière rouge aux cellules traitées à la lumière rouge lointaine, nous avons constaté une légère diminution de l’activation du pli avec une quantité croissante de rapporteur (Figure 6E) (P = 0,0141, régression linéaire suivie d’un test de Wald). Figure 1 : Circuit de base pour une seule LED. (A) Un organigramme montrant un aperçu des étapes nécessaires à la construction du système d’éclairage LED. (B) Le système de contrôle de l’éclairage à DEL. (à gauche) Boîtier de commande pour réguler l’intensité et la synchronisation des LED. (milieu) Une tablette PC exécutant une interface utilisateur pour contrôler les LED. (à droite) Une boîte noire pour le montage de LED et le placement de cellules pour la stimulation optique. (C) Tableau permettant de déterminer si la LED nécessite un circuit haute ou basse tension. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Instructions pour souder les composants en place. (A) Un exemple des instructions de dessin animé étape par étape pour la construction du circuit. (B,C) Exemples d’instructions avec des images de l’appareil en cours d’assemblage. (D) Exemple d’instructions pour l’assemblage simultané de plusieurs circuits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Vues d’un système de commande à DEL assemblé. (A) Une vue extérieure de dessus du système assemblé. (B) Vue de l’intérieur d’un système d’éclairage à quatre LED assemblé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Instructions pour souder la LED par refusion sur le dissipateur de chaleur. (A) La base LED et un gros plan d’une LED rouge foncé. (B) Mise en place de la pâte à souder sur la base de la LED. (C) Image de LED soudée. Les flèches rouges pointent vers des tampons de soudure. Par rapport au gris avant soudure (A), après soudure, la soudure apparaît métallique / brillante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Logiciel de contrôle des expériences optogénétiques. (A) Une interface utilisateur à deux LED avec de gros boutons pour une utilisation facile avec une tablette peu coûteuse. b) Une interface utilisateur à quatre LED. Les deux interfaces permettent un contrôle LED indépendant. Pour les impulsions, les LED peuvent être programmées pour s’allumer et s’éteindre pour des largeurs d’impulsion spécifiques et des durées spécifiées. La pulsation peut également avoir un délai de démarrage et une durée totale d’exécution prédéterminée. (C) La tablette de contrôle LED montée sur un incubateur de culture cellulaire. (D) Illustration du système génétique PhyB lorsqu’il est éclairé par une lumière rouge lointaine. La lumière rouge lointain maintient le gène dans l’état « off » ou « sombre ». (E) Illustration du système génétique PhyB lorsqu’il est éclairé par une lumière rouge. La lumière rouge induit l’expression des gènes en favorisant l’interaction entre PhyB et PIF3. Cette interaction localise le domaine d’activation génique (AD) fusionné à PIF3 au promoteur UAS, activant le gène rapporteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Résultats prévus de l’utilisation du système LED pour contrôler PhyB. (A) Un plasmide codant pour des partenaires hybrides PhyB+PIF3 (pPK-351), un plasmide codant pour des enzymes de synthèse phycocyanobiline (chromophore PCB) (pPK-352) et un plasmide rapporteur de la luciférase (pPK-202). (B) Chronologie des expériences d’induction de lumière pour C-E. (C) Niveaux de transcription basaux (AKA leakiness) avec des quantités croissantes d’ADN rapporteur. Les échantillons de « fuite » ne sont pas transfectés avec du pPK-352 (c.-à-d. qu’ils ne répondent pas à la lumière), mais sont éclairés par une lumière rouge ou rouge lointain. Les échantillons d’interrupteurs de lumière (LS) comprennent tous les plasmides de commutation de gènes de lumière et sont éclairés par une lumière rouge ou rouge lointain. (D) Niveaux d’induction de la lumière en réponse à la lumière rouge et rouge lointain. (LS-Far-lumière rouge est la même donnée en C et D.) (E) Induction de la luciférase dans les cellules éclairées par une lumière rouge/lumière rouge lointain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.  Veuillez cliquer ici pour télécharger les figures supplémentaires 1 à 39. Figure supplémentaire 1 : Circuit de commande électronique pour plusieurs LED. (A) Le schéma du circuit pour un système à DEL unique. (B) Le schéma du circuit pour un système à quatre LED. Figure supplémentaire 2 : Mise en place des interconnexions de circuits. (A) Clipsez votre carte PCB sur vos mains secourables. (B) Emplacement des sauteurs du circuit principal dans les trous traversants de l’image. (C) Schéma des connecteurs de fil cartographiant les coordonnées. Pour les quatre systèmes LED, tracez des lignes divisant chaque circuit comme indiqué (lignes verticales noires). Les figures supplémentaires 31 à 38 décrivent l’assemblage simultané de quatre circuits. Figure supplémentaire 3 : Soudure des fils sur le circuit imprimé. (A) Pliez les cavaliers de manière à ce qu’ils entrent en contact direct avec le PCB et restent en place pendant la soudure. (B) Une autre vue des fils tordus. (C) Fils après soudure. (D) Fils coupés sur le PCB. (E) Isolation rétrécie après chauffage à la soudure. (F) Mise en place de l’isolant pour couvrir le trou traversant du sol (flèche bleue) (G) Ajout de flux à une extrémité ou à une borne de fil. Figure supplémentaire 4 : Soudure du régulateur de tension en place. (A) Carte des coordonnées du régulateur de tension. B) Emplacement du régulateur de tension. (C) Fils de régulateur de tension pliés. (D) Bornes du régulateur de tension après soudure. Figure supplémentaire 5 : Soudure de la résistance R1 en place. (A) Carte des coordonnées de la résistance R1 (820Ω). (B) Traction de la résistance par le fil à l’aide d’une pince (C) La résistance tirée près du PCB. (D) La résistance soudée proche du PCB. Figure supplémentaire 6 : Soudure du transistor en place. (A) Carte des coordonnées et de l’orientation du transistor. B) Noter l’orientation du transistor; l’étiquette de ce modèle fait face au régulateur de tension (LM317T). Vérifiez les spécifications du transistor pour vous assurer que les « Émetteur », « Base » et « Collecteur » sont dans les bons trous. (C) Le transistor dont les bornes sont pliées avant la soudure. Figure supplémentaire 7 : Soudure du connecteur fil à fil du potentiomètre (plus une résistance 560Ω pour le circuit basse tension). (A) Carte des coordonnées du connecteur fil à fil (plus le R3-560Ω si vous construisez le circuit basse tension, le connecteur fil à fil est placé dans le trou avant la résistance). (B) Un connecteur fil-à-fil femelle. (C) Pour faciliter le montage de la résistance et du connecteur fil à fil dans le trou traversant, 3 à 5 brins du fil tressé sont pliés. (D) Les brins sont coupés à l’aide de coupe-fil aussi près que possible de l’isolant. (E) Fil rouge inséré d’un connecteur fil à fil femelle à travers le trou traversant a5 (pour le circuit basse tension, insérer R3 à travers le même trou traversant). (F) Vue inférieure de la résistance et du connecteur fil à fil avant soudure. (G) Image de la résistance R3 soudée connectée à la masse (F = femelle). Figure supplémentaire 8 : Soudure du connecteur fil à fil du potentiomètre à la masse. (A) Carte des coordonnées de la connexion à la terre pour le connecteur fil à fil potentiomètre. (B) Vue de dessus du connecteur fil-à-fil du potentiomètre en parallèle avec R3 (F = femelle). Figure supplémentaire 9 : Soudure du microcontrôleur et des connecteurs fil à fil LED. (A) Carte des coordonnées du connecteur fil-à-fil pour connecter le 2N222A et la terre au microcontrôleur. (B) Connecteur fil-à-fil mâle soudé. (C) Vue de dessus de (B). (D) Carte des coordonnées du connecteur fil à fil femelle pour connecter l’entrée du circuit et la masse à la LED. (E) Connecteur fil-à-fil femelle soudé (F = femelle, M = mâle). Figure supplémentaire 10 : Soudure du cavalier du circuit d’alimentation. (A) Carte des coordonnées du cavalier orange pour connecter l’alimentation électrique à la terre. (B) Le pull orange soudé en place. (C) Vue inférieure du cavalier soudé en place. Figure supplémentaire 11 : Soudure de l’interrupteur d’alimentation et des connecteurs fil-à-fil de la source d’alimentation. (A) Carte des coordonnées du connecteur fil-à-fil femelle pour la connexion de l’interrupteur d’alimentation. (B) Le connecteur fil à fil femelle soudé en place. C) Un autre point de vue de l’alinéa B). (D) Carte des coordonnées du connecteur fil-à-fil mâle pour la connexion de la source d’alimentation. (E) Connecteur fil à fil mâle soudé. (F) Une autre vue de (E) (F = Femme, M = Homme). Figure supplémentaire 12 : Connexion du bloc d’alimentation à un connecteur fil-à-fil mâle. (A) L’alimentation électrique non modifiée. (B) Couper les fils d’alimentation. (C) Les fils d’alimentation électrique dénudés et avec l’excès d’isolation coupée. D) Placement d’un tube rétractable autour des fils d’alimentation. Tube séparant les deux connexions (flèches rouges) et tube pour maintenir les fils séparés (flèche jaune). (E) Fils torsadés reliant l’alimentation au connecteur fil à fil femelle. Figure supplémentaire 13 : Soudure et isolation de la connexion du bloc d’alimentation à un connecteur fil à fil mâle. (A) La connexion soudée entre la masse du bloc d’alimentation et un connecteur fil-à-fil femelle. (B) La connexion soudée entre la borne positive de l’alimentation et un connecteur fil-à-fil femelle. (C) Tube rétractable tiré sur les raccords individuels soudés (flèche rouge). (D) Les deux connexions d’alimentation électrique soudées et avec tube rétractable traité thermiquement. E) Mise en place du tube rétractable sur les raccords individuels (flèche jaune). (F) Alimentation électrique terminée. Figure supplémentaire 14 : Soudure de l’interrupteur d’alimentation à un connecteur fil-à-fil mâle. (A) Interrupteur d’alimentation avec fils dénudés et tube rétractable placé sur les fils (flèches rouges). (B) Fils reliant l’interrupteur et le connecteur mâle fil à fil torsadés ensemble avant soudure. (C) Placer le tube rétractable sur les raccords soudés. D) Raccords recouverts du tube rétractable traité thermiquement. (E) Un interrupteur d’alimentation assemblé avec un connecteur fil-à-fil mâle. Figure supplémentaire 15 : Câblage d’un potentiomètre à un connecteur fil-à-fil mâle. (A) Les pièces du potentiomètre. (B) Un connecteur fil à fil mâle tordu et plié pour s’accrocher autour de la borne centrale du potentiomètre. (C) Un connecteur fil à fil mâle tordu autour de la borne centrale du potentiomètre. (D) Connexions fil à fil soudées. (E) Flèche rouge pointant vers la languette métallique avant d’être retirée. (F) Le potentiomètre après enlèvement de la languette métallique. Figure supplémentaire 16 : Câblage de la connexion du microcontrôleur. (A) Fils pour connecteurs fil à fil femelles dénudés et coupés en vue du sertissage. (B) Mise en place du sertissage sur le connecteur fil-à-fil. (C) Sertissage du connecteur fil à fil. (D) Connecteur fil à fil serti. (E) Connexion de microcontrôleur entièrement assemblée. Figure supplémentaire 17 : Fils de soudure et LED sur la base de la LED Partie 1. (A) Matériaux nécessaires pour souder la LED à la base de la LED. (B) Étamage de l’extrémité du fil dénudé. (C) Application de flux sur le contact de la base de la DEL. (D) Ajout de soudure à la grande pointe de soudure pour étamer la base LED. (E) Mise en place de la soudure sur le contact pour chauffer la base de la DEL. (F) La base de la LED après avoir fait glisser la pointe de soudure sur le contact. (G) La même procédure pour l’autre contact. Figure supplémentaire 18 : Fils de soudure et LED sur la base de la LED Partie 2. (A) Un fil étamé attaché au contact à l’aide d’une pince à cheveux. Notez que le fil noir est soudé à la cathode « C-« . (B) Ajout d’une quantité généreuse de soudure à la pointe de soudure. (C) La pointe de soudure appuyant sur le fil, faisant fondre la soudure sur la base de la LED et le fil. (D) Maintenir le fil enfoncé de manière à ce qu’il reste en place lorsque le fer à souder est retiré. (E) Maintenir le fil en place jusqu’à ce que la soudure durcisse. Figure supplémentaire 19 : Fils de soudure et LED sur la base de la LED Partie 3. (A) Utiliser une pointe tranchante pour placer de la pâte à souder sur la base de la LED pour le montage de la LED. (B) La base LED avec la pâte à souder en place. (C) Placement de la LED sur la base de la LED de telle sorte que les contacts de la LED et de la base LED correspondent. Figure supplémentaire 20 : Fils de soudure et LED sur la base de la LED Partie 4. (A) Le fil noir encore attaché au contact par la pince à cheveux. (B,C) À l’aide d’une deuxième pince à cheveux, le fil rouge est maintenu en place. Notez que le fil rouge est soudé à l’anode « A + ». (D) Ajout d’une quantité généreuse de soudure à la pointe de soudure. (E) La pointe de soudure appuyant sur le fil, faisant fondre la soudure sur la base de la LED et le fil ainsi que la pâte à souder sous la LED. (F) Le refroidissement de la base LED chaude après soudure. (G) La base LED avec les fils et la LED soudée. (H,I) Les flèches rouges pointent vers des tampons de soudure. Après soudure, la soudure apparaît métallique/brillante (par rapport au gris avant soudure (Figure supplémentaire 16D)). Figure supplémentaire 21 : Connexion du fil LED à un connecteur fil-à-fil mâle. (A) Fils dénudés et connecteur fil à fil mâle à côté du tube rétractable coupé en deux (1/8 pouce et 3/16 pouce). (B) Placer le tube rétractable sur les fils avant le brasage. (C) Fils tordus ensemble avant soudure. (D) La connexion soudée du fil au connecteur fil à fil. (E) Les fils rouge et noir soudés ensemble. (F) Placement du tube rétractable de 1/8 pouce sur le raccord soudé. (G) Le tube rétractable après rétrécissement avec le pistolet thermique. (H) Placement du tube rétractable de 3/16 de pouce sur le tube rétractable plus petit. (I) Le raccord soudé et scellé avec le tube rétractable. Figure supplémentaire 22 : Fixation des fils et des LED à la base de la LED à l’aide d’époxy. (A) Utilisation d’un applicateur en bois pour placer de l’époxy dans la base de la LED. Un ruban adhésif est placé en dessous pour attraper tout époxy dégoulinant. (B) L’époxy est réparti uniformément sur toute la surface. (C) La LED est laissée durcir toute la nuit. Figure supplémentaire 23 : Montage de voyants à l’intérieur d’un couvercle de boîte. (A) Une LED avec une pièce de fixation tactile fixée pour un montage facile. (B) LED de différentes couleurs montées à l’intérieur d’une boîte noire à l’aide d’une attache tactile. (C) Une encoche sur le couvercle de la boîte noire faite par un outil rotatif à grande vitesse pour faire de la place pour le fil LED. (D) Une boîte noire pour stimuler les cellules avec des attaches tactiles pour le montage de la LED. (E) Placement d’une antenne multipuits à l’intérieur de la version à fermeture tactile du boîtier LED. Figure supplémentaire 24 : Montage de voyants à l’extérieur d’un couvercle de boîte. (A) Trou percé dans le couvercle de la boîte noire avec une encoche de l’outil rotatif à grande vitesse pour faire de la place pour le fil (flèche rouge). (B) LED placée dans le trou avec le fil dans l’encoche, maintenue en place avec du ruban électrique. (C) Deux autres morceaux de ruban adhésif sont utilisés pour fixer la LED. L’arrière du dissipateur thermique est exposé pour maximiser l’échange de chaleur. (D) Film d’intimité collé sur le trou où la LED sera placée. La flèche rouge pointe vers le film d’intimité. (E) Une boîte noire pour stimuler les cellules avec une LED montée à l’extérieur de la boîte et avec un film d’intimité pour diffuser l’éclairage. (F) Placement d’une antenne multipuits à l’intérieur de la version LED externe + film d’intimité de la boîte LED. Figure supplémentaire 25 : Perçage de trous sur le couvercle du boîtier pour l’interrupteur d’alimentation et les potentiomètres. (A) Un dessin CAO avec les dimensions annotées du couvercle de la boîte. (B) Le couvercle de la boîte avec les trous du potentiomètre et de l’interrupteur d’alimentation. Figure supplémentaire 26 : Préparation du trou de sortie du fil. (A) Un dessin CAO avec des cotes annotées. (B) Image du trou foré avec le foret. (C) Lissage du trou de sortie avec un outil rotatif à grande vitesse ou un outil de limaillage. (D) Placer l’œillet dans le trou de sortie. Figure supplémentaire 27 : Placement du microcontrôleur et du PCB dans la boîte. (A) Le support du microcontrôleur (orange) et les supports de PCB à l’intérieur de la boîte. (B) Le microcontrôleur et le PCB fixés dans la boîte. Figure supplémentaire 28 : Emplacement des potentiomètres et de l’interrupteur d’alimentation. (A) Vue de face d’un couvercle de boîte muni d’un interrupteur d’alimentation et de quatre POT. (B) Vue de face du couvercle de la boîte avec boutons de potentiomètre ajoutés. (C) Une vue arrière du couvercle de la boîte avec les éléments fixés. Figure supplémentaire 29 : Le système de commande à DEL assemblé. (A) Un boîtier de commande ouvert avec les fils étiquetés avec une imprimante d’étiquettes et une fermeture éclair attachée pour l’organisation. (B) La boîte une fois qu’elle est entièrement assemblée avec chaque POT étiqueté avec le code PIN. Figure supplémentaire 30 : Emplacement du connecteur fil à fil serti. (A) Image des connecteurs fil-à-fil serties pour un système à microcontrôleur à quatre LED. (B) Placement du connecteur serti dans les ports du microcontrôleur. Figure supplémentaire 31 : Mise en place des fils de démarrage. (A) Une carte de circuit imprimé avec les coordonnées des fils de démarrage rouges étiquetés. (B) Une carte de circuit imprimé avec les coordonnées des fils de démarrage jaunes étiquetés. Figure supplémentaire 32 : Mise en place des fils de démarrage. Carte de circuit imprimé affichant les coordonnées des fils de démarrage jaunes. Figure supplémentaire 33 : Ajout des régulateurs de tension. Les régulateurs de tension LM317T sont ajoutés au circuit avec leurs coordonnées étiquetées dans les diagrammes. Figure supplémentaire 34 : Insertion des résistances 820Ω. Les résistances R1 sont ajoutées au circuit avec leurs coordonnées étiquetées dans les diagrammes. Figure supplémentaire 35 : Insertion des transistors. Les transistors 2N2222A sont ajoutés au circuit avec leurs coordonnées étiquetées dans les diagrammes. Figure supplémentaire 36 : Insertion des connecteurs fil-à-fil femelles et des résistances (en option) pour la connexion POT. Les fils et les résistances sont ajoutés au circuit avec leurs coordonnées étiquetées dans les diagrammes. (A) Insérez le fil rouge, suivi de la résistance R2 (560Ω) (pour le circuit basse tension uniquement). (B) Insérez l’autre extrémité de la résistance dans le trou de terre indiqué. (C) Insérez les fils noirs dans les trous marqués pour les connecter à la terre. Remarque : R2 (560Ω) est parallèle au potentiomètre. Figure supplémentaire 37 : Insertion de connecteurs fil-à-fil mâles pour la connexion du microcontrôleur et l’alimentation. Les fils sont ajoutés au circuit avec leurs coordonnées étiquetées dans les diagrammes. (A) Insérez les fils rouges dans les trous indiqués. (B) Insérez les fils noirs dans les trous marqués. Figure supplémentaire 38 : Ajout de connecteurs LED fil-à-fil. (A) Connecteurs fil-à-fil femelles avec les coordonnées de fil rouge mises en évidence. (B) Connecteur fil-à-fil femelle avec les coordonnées noires du fil en surbrillance. Figure supplémentaire 39 : Mise en place d’une expérience de commutation génique PhyB-PIF3. (A) Un exemple de tableau d’un mélange-maître contenant Renilla pour le contrôle interne. (B) Un exemple de tableau pour la mise en place du mélange d’ADN pour un test rapporteur à double luciférase d’une expérience optogénétique PhyB-PIF3. (C) Un exemple de tableau pour la mise en place du réactif de transfection PEI et l’aliquote du mélange sur les cellules (goutte à goutte). (D) Emplacement du posemètre pour régler la luminosité de la DEL.

Discussion

Le système LED décrit ici a été utilisé dans notre laboratoire pour optimiser, caractériser et travailler avec plusieurs outils optogénétiques. Dans Kyriakakis et al.4, nous avons testé de nombreuses combinaisons de commutateurs de gènes PhyB-PIF en parallèle. Nous avons ensuite utilisé ce système pour tester des impulsions lumineuses à différentes fréquences afin de mesurer la cinétique de commutation génétique et l’intensité lumineuse effective. Ce système a également été utilisé pour optimiser et caractériser deux systèmes optogénétiques qui utilisent la lumière bleue pour la stimulation 5,6. Étant donné qu’une seule LED devait être suffisamment lumineuse pour activer la plupart des outils optogénétiques, l’achat d’un système avec un grand nombre de LED sur chaque puits n’est pas toujours nécessaire. Cette configuration est peu coûteuse, fiable, facile à reconfigurer et ne nécessite aucune expertise électrique préalable pour suivre le protocole d’assemblage.

Dans les figures supplémentaires 31 à 38, nous décrivons comment incorporer jusqu’à quatre LED dans le système. Bien que cela puisse limiter certaines expériences nécessitant un grand nombre de conditions parallèles, plus de LED peuvent être ajoutées en remplaçant l’alimentation 9 volts utilisée dans ce protocole par une alimentation de puissance plus élevée. De même, plusieurs LED de faible puissance peuvent être connectées en parallèle à chaque circuit. Dans ce dernier arrangement, certaines LED ne seront pas contrôlées individuellement, mais cela peut être utile lorsque de nombreuses LED sont nécessaires pour couvrir une plus grande surface. Une fois familiarisé avec l’électronique de ce système, il existe de nombreuses façons de le personnaliser. D’autres stratégies de personnalisation du système consistent à placer la DEL plus loin ou plus près de l’échantillon et à éclairer à travers des filtres/diffuseurs pour des conditions d’éclairage homogènes ou pour empêcher l’échauffement, comme dans (figure supplémentaire 23) et Allen et coll.5. Une autre caractéristique notable de notre conception LED est qu’elle est encapsulée dans de l’époxy et dispose d’une attache tactile à l’arrière; cela permet de placer facilement et en toute sécurité la LED pratiquement n’importe où: dans les incubateurs, les aquariums, les cages pour animaux, les murs, etc.

De nombreuses expériences qui utilisent l’optogénétique pour contrôler les gènes, les voies de signalisation et d’autres activités cellulaires nécessitent souvent des pulsations, couvrent de grandes échelles de temps ou doivent être effectuées dans un incubateur, nécessitant donc une automatisation ou une manipulation à distance sans microscope. Ce système LED a été testé en continu pendant plusieurs mois à l’intérieur d’un incubateur de CO2 humidifié sans aucun problème. De plus, avec des systèmes réversibles tels que les systèmes optogénétiques PhyB, l’expérimentateur peut avoir besoin de programmer des programmes d’éclairage pulsé spécifiques. Dans notre travail précédent4, nous avons utilisé des programmes pulsés pour tester la dynamique de réversibilité d’un commutateur PhyB-PIF3 dans des cellules de mammifères via l’interface utilisateur. En utilisant la méthodologie décrite dans ce manuscrit, la programmation d’un protocole pulsé est facile, offrant la flexibilité et l’autonomie nécessaires pour de nombreux types d’expériences optogénétiques d’une manière conviviale.

Les étapes les plus critiques de la construction de ce système comprennent l’assemblage du circuit électrique sur la carte PCB et la connexion des composants, qui sont détaillés dans les sections 1 et 2. Il est essentiel de suivre attentivement chaque étape de ces sections et de vérifier les numéros de sténopé ligne par ligne avant de souder chaque composant. La section 2 explique comment configurer les composants qui seront connectés au circuit. Pour que les composants se connectent dans la bonne orientation, il est particulièrement important de s’assurer que les couleurs des fils noirs et rouges sur les connecteurs fil à fil correspondent. De petits oublis dans ces deux sections affecteront très probablement la fonctionnalité du système. En effet, la première étape du dépannage de cette méthode sera de vérifier que le circuit a été construit correctement et que toutes les connexions sont en place. Deuxièmement, la vérification de la qualité de soudure pour les connexions desserrées et des fils pour les poils de fil évasés qui peuvent court-circuiter le circuit est d’une importance particulière. Une troisième étape serait de s’assurer que les LED fonctionnent correctement, ce qui peut être fait à l’aide d’une alimentation ou d’une batterie de 1,5 V en clipsant les deux bornes de la LED avec des pinces crocodiles. Une autre considération potentiellement critique est d’empêcher le chauffage (lors de l’utilisation des LED à haute puissance) ou la diffusion de la lumière pour un éclairage plus répandu. Pour tenir compte de ces considérations, les DEL peuvent être montées à l’extérieur d’une boîte noire avec un « film d’intimité » à l’intérieur, comme décrit dans la figure supplémentaire 23 et Allen et al.5. En raison de la simplicité de ce système, il n’est pas difficile de le démonter pour vérifier, modifier, mettre à niveau ou réparer des composants modulaires.

Un autre facteur critique pour les systèmes de gènes inductibles est de considérer combien d’activation est nécessaire ou combien de fuite est acceptable pour le système biologique contrôlé. Comme le montre la figure 6, ceux-ci peuvent varier en fonction de la quantité d’ADN du déclarant. En outre, l’efficacité de la transfection et, par conséquent, le nombre de copies des constructions rapporteures dans chaque cellule varieront. Il peut être avantageux pour certaines expériences de fabriquer une lignée cellulaire avec une quantité fixe de composants rapporteurs ou de commutation génique PhyB et de rechercher des clones avec la gamme souhaitée d’expression induite, comme cela se fait couramment avec les systèmes inductibles par les médicaments. En raison de la taille et de l’instabilité du plasmide lentiviral pPK-2304, nous avons également fabriqué des versions plasmides non lentivirales du commutateur PhyB dans le squelette pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) et pPK-352 (Addgene #157922).

En construisant ce système d’éclairage LED suivant ce protocole, les utilisateurs disposent de tous les composants nécessaires pour réaliser un large éventail d’expériences optogénétiques in vitro et in vivo. Combiné aux instructions d’utilisation de PhyB-PIF3 dans les cellules de mammifères, ce protocole permettra aux non-ingénieurs et aux biologistes d’utiliser l’optogénétique basée sur PhyB de manière flexible et efficace dans divers contextes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang et Molly Allen d’avoir testé différentes versions du système LED au fur et à mesure de son développement. Ce travail a été soutenu par le Kavli Institute for Brain and Mind de l’UC San Diego et le Salk Institute, National Science Foundation par le biais du NSF Center for Science of Information sous la subvention CCF-0939370, la subvention NIH NS060847 et la subvention NIH R21DC018237.

Materials

18AWG 2pin RED Black wire Amazon 15M-28AWG-2468 Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit.
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560 ohm 1/2watt 1% tolerance Amazon a14051600ux0301 Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W.
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820 ohm 1/2watt 1% tolerance Amazon TTL-A-8035-50Ea Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W).
https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor
A Male to B Male Cable (10 Feet) Amazon Part# 30-001-10B The cable that comes with the Arduino doesn't fit well in the box.
https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Ardiuino UNO equivilent Amazon Elegoo EL-CB-001 UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino.
https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1
Arduino holder Digikey X000018 Fits very snug.
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Black boxes for circuits and light chambers Amazon 1591ESBK Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black.
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Blue LED Digikey LXML-PB01-0040 LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134
Cable ties Amazon sd027 Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White).
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Command Fridge Clips Amazon 17210CLR Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used.
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Cyan LED Digikey LXML-PE01-0070 LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd
Electrical tape – 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack Amazon 03429NA Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft.
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Farred LED 720nm Luxeon Star LEDs LXML-PF01 Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base"
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Farred LED 740nm Ushio EDC740D-1100-S5 Uses "STAR XP 3535" base
https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf
Farred LED 780nm Ushio EDC780D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf
Farred LED 810nm Ushio EDC810D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf
Farred LED 850nm Ushio EDC850D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf
Grommets Amazon Pico 6120D These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G
Hair/Alligator Clips Amazon 1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs.
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LED base Luxeon Star LEDs LXB-RS20A Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs
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LED PCB fopr Ushio LEDs Adura LED solutions STAR XP 3535 Package LED Fits many other LEDs by Ushio
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Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe Amazon 1943587 Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe.
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NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS Amazon B000FIDTYG These are very common and there are many equivalents.
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Picture Hanging Velcro Strips Amazon PH204-16NA With these you can hang the LEDs in many places.
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Power supply Amazon tb013 Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway.
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Power switch Rocker Switch Amazon SIXQJZML These are very common and there are many equivalents.
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Rectangular Connectors – for crimped wires Digikey 2183-1905-ND 6 Rectangular Connectors – Housings Black 0.100" (2.54mm)
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Red LED Digikey LXM3-PD01 LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd
Sandpaper Amazon B002NEV6GS 3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch.
https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1
Solder for soldering wires and circuit components Amazon Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY
Solder-able Breadboard for building the circuit Amazon GK1007 Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007.
https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1
Spade drill bit Amazon Irwin 88811 These are very common and there are many equivalents.
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Transistor Newark 2N2222A Can buy from many places.
http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197
Voltage regulator Newark LM317T Equivilent to NTE956.
https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC
Windows 10 tablet Amazon B08BYTT79Y Any Windows 10 PC will do.
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Cell Culture Reagents
Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 ATCC ATCC CRL-1573 Common Cell line.
https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 26140079 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose ThermoFisher 11965−092 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118
10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin ThermoFisher 15140122 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122
White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates ThermoFisher 07-200-589 White plates are preferred. Do not use clear plates.
https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) PolySciences 24765-1 Can be replaced with another transfection reagent.
https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/
Name of Equipment
Diagonal Cutting Plier (110mm) Amazon Proskit 1PK-037S These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11
Dremil 3000 with cutting tool and grinder Amazon Dremel 3000 Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver.
https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3
Dremil cutting and grinding tool Amazon Dremel 200-1/15 Any similar Dremil will work.
https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Dremil grinding tip Amazon Dremel 84922 Silicon Carbide Grinding Stone.
https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922
EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT Amazon DS017 For removing solder/mistakes.
https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI
Helping Hand with Magnifying Glass Amazon SE MZ101B These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch
Pointed Nose Micro Pliers Amazon Hakko CHP PN-20-M Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose.
https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Small screw drivers Amazon Wiha 26197 These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set
Soldering iron Amazon Yihua 939D+ Digital Soldering Station These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR
TraceTech No-Clean Flux Pen Amazon 2507-N Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL.
https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1
Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber Amazon WSA350 For soldering safety.
https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK
Wire strippers Amazon CSP-30-7 These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG
IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG Amazon IWS-3220M These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
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