JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

بناء نظام إضاءة بسيط ومتعدد الاستخدامات لتجارب البصريات الوراثية

Published: January 12, 2021
doi:
10.3791/61914
, , , , , , , , , ,
1Department of Bioengineering,University of California, San Diego, 2University of California, San Diego, 3Department of Mathematical Computational, and Systems biology,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تجارب بصرية وراثية للتحكم في التعبير الجيني بالضوء الأحمر والأحمر البعيد باستخدام PhyB و PIF3. يتضمن إرشادات خطوة بخطوة لبناء نظام إضاءة بسيط ومرن ، والذي يتيح التحكم في التعبير الجيني أو علم البصريات الوراثي الآخر باستخدام الكمبيوتر.

Abstract

أدى التحكم في العمليات البيولوجية باستخدام الضوء إلى زيادة الدقة والسرعة التي يمكن للباحثين من خلالها التعامل مع العديد من العمليات البيولوجية. يسمح التحكم البصري بقدرة غير مسبوقة على تشريح الوظيفة ويحمل القدرة على تمكين علاجات جينية جديدة. ومع ذلك ، تتطلب التجارب البصرية الوراثية مصادر ضوء كافية مع التحكم المكاني أو الزماني أو الكثافة ، وغالبا ما تكون عنق الزجاجة للباحثين. نوضح هنا بالتفصيل كيفية بناء نظام إضاءة LED منخفض التكلفة ومتعدد الاستخدامات يمكن تخصيصه بسهولة لمختلف أدوات البصريات الوراثية المتاحة. هذا النظام قابل للتكوين للتحكم اليدوي أو الكمبيوتر مع كثافة LED قابلة للتعديل. نحن نقدم دليلا مصورا خطوة بخطوة لبناء الدائرة ، وجعلها يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر ، وبناء مصابيح LED. لتسهيل تجميع هذا الجهاز ، نناقش أيضا بعض تقنيات اللحام الأساسية ونوضح الدوائر المستخدمة للتحكم في مصابيح LED. باستخدام واجهة المستخدم مفتوحة المصدر الخاصة بنا ، يمكن للمستخدمين أتمتة التوقيت الدقيق ونبض الضوء على جهاز كمبيوتر شخصي (PC) أو جهاز لوحي غير مكلف. تجعل هذه الأتمتة النظام مفيدا للتجارب التي تستخدم مصابيح LED للتحكم في الجينات ومسارات الإشارات والأنشطة الخلوية الأخرى التي تمتد عبر نطاقات زمنية كبيرة. بالنسبة لهذا البروتوكول ، لا يلزم وجود خبرة سابقة في مجال الإلكترونيات لبناء جميع الأجزاء اللازمة أو لاستخدام نظام الإضاءة لإجراء تجارب البصريات الوراثية.

Introduction

أصبحت أدوات علم البصريات الوراثية في كل مكان ويتم تطوير تقنية جديدة باستمرار للتحكم بصريا في العمليات البيولوجية مثل التعبير الجيني وإشارات الخلية وغيرها الكثير1،2،3. تسمح القدرة على التحكم في العمليات الخلوية بالضوء بالحركية السريعة والتحكم المكاني المحكم والتنظيم المعتمد على الجرعة الذي يمكن التحكم فيه من خلال شدة الضوء ووقت التعرض. لاستخدام هذه الأدوات ، من الضروري وجود جهاز للتحكم في هذه المعلمات. لقد طورنا مؤخرا مفتاح جين ثديي PhyB-PIF3 مشفر وراثيا ينشط الجينات ويعطل تنشيطها بشكل عكسي باستخدام الضوء الأحمر / الأحمر البعيد ، على التوالي4. تم اختبار هذا النظام في العديد من خطوط خلايا الثدييات ومكن من تحريض التعبير الجيني بشكل لا مثيل له حتى مع وجود كميات صغيرة جدا من الضوء ، بما في ذلك نبضات الضوء. كثيرا ما يطلب الباحثون الذين يرغبون في استخدام مفتاح PhyB والأدوات المماثلة 5,6 معلومات حول طرق التحكم في شدة الإضاءة ومدتها. لذلك ، قمنا بتطوير هذا البروتوكول مع تعليمات خطوة بخطوة لتمكين اعتماد أوسع لهذه الأدوات لعلم البصريات الوراثي.

قبل الاستخدام الواسع النطاق لمصابيح LED ، تم استخدام مصادر الضوء ذات النطاق العريض مع المرشحات لدراسة البروتينات المستجيبة للضوء مثل phytochromes7. في الآونة الأخيرة ، تم نشر بعض أنظمة إضاءة LED جنبا إلى جنب مع أدوات البصرياتالوراثية 8،9،10،11،12 ، ولكن هذه البروتوكولات يمكن أن تتطلب خبرة كبيرة في الإلكترونيات / البرامج ، أو تتطلب معدات متخصصة (على سبيل المثال ، طابعات 3D ، آلات القطع بالليزر ، أو الأقنعة الضوئية) ، أو لا توفر التعليمات خطوة بخطوة التي قد يحتاجها بعض الباحثين لنشرها لتلبية احتياجاتهم البحثية. في حين أن التحكم المستقل في الآبار الفردية في لوحة متعددة الآبار يمكن أن يكون مفيدا ، إلا أنه غالبا ما يكون غير ضروري عندما يحتاج الباحثون فقط إلى مقارنة عدة عينات مختلفة في الضوء والضوء الداكن أو الأحمر مقابل الضوء الأحمر البعيد. أيضا ، العديد من الأنظمة التجارية الحالية باهظة الثمن ، مع قدرة تخصيص محدودة. ومع ذلك ، فإن مصابيح LED الموصوفة في هذا البروتوكول فعالة من حيث التكلفة ومشرقة ويمكن تركيبها بعدة طرق ؛ لذلك ، يمكن استخدامها لإلقاء الضوء على عدة أنواع مختلفة من العينات. مع البروتوكول والبرامج المقدمة ، يمكن استخدام مصابيح LED التي تتراوح من الأشعة فوق البنفسجية (UV) إلى NIR والتحكم فيها باستخدام برنامج لإجراء تجارب بصرية وراثية باستخدام UVR8 13,14 و Dronpa 15,16 ومجالات LOV 17,18 و Step Function Opsins 19,20 و CRY2 21,22 و PhyB 4,23,24 ، 25 ، فيتوكروم البكتيرية26،27،28،29 وغيرها من الأنظمة المستجيبة للضوء30،31،32.

يشكل هذا البروتوكول برنامجا تعليميا لتجميع الدوائر والأجهزة الأخرى اللازمة للتحكم في المعلمات المختلفة لتحفيز الضوء بالإضافة إلى الأدوات الجزيئية / الخلوية لإجراء تجربة بصرية وراثية. بالإضافة إلى ذلك ، أبلغنا عن البلازميدات المحسنة من Kyriakakis et al.4 الأصغر حجما والأكثر استقرارا للاستنساخ. من خلال هذا البروتوكول ، يمكن لعلماء الأحياء الذين ليس لديهم خبرة في الإلكترونيات والبصريات بناء أنظمة إضاءة مرنة وقوية. بطريقة خطوة بخطوة ، نوضح كيفية بناء أنظمة LED ، وإزالة عنق الزجاجة التقني لاعتماد أدوات البصريات الوراثية على نطاق أوسع. يمكن استخدام هذا النظام بسهولة في معظم حاضنات زراعة الخلايا ، حتى لو لم تكن تحتوي على منافذ سلكية. على سبيل المثال ، احتفظنا بنظام LED في حاضنة CO2 مرطبة بشكل مستمر لأكثر من 6 أشهر دون أي انخفاض في الأداء. نوضح أيضا كيفية توصيل نظام LED بجهاز كمبيوتر وربطه ببرنامج مفتوح المصدر نقدمه على GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). يوفر بناء نظام باستخدام هذا البروتوكول للباحثين المعرفة الأساسية لتصحيح المشكلات المحتملة واستبدال الأجزاء وتحسين / توسيع الوظائف.

نظرة عامة على النظام

يتضمن بناء نظام الإضاءة (1) بناء الدائرة الإلكترونية ، (2) بناء الأجهزة الطرفية (سلك إمداد الطاقة ، مفتاح الطاقة ، إلخ) ، (3) بناء مصابيح LED ، (4) تجميع كل هذه المكونات ، و (5) تثبيت البرنامج للتحكم في مصابيح LED بواجهة مستخدم (الشكل 1 أ). بمجرد الانتهاء ، يمكن لنظام الإضاءة التحكم في ما يصل إلى أربعة مصابيح LED بشكل مستقل باستخدام واجهة مستخدم (الشكل 1B). تتيح واجهة المستخدم لكل مؤشر LED النبض على فترات زمنية محددة وإيقاف تشغيله بعد وقت محدد. هناك أيضا تأخير بدء لبدء برامج الإضاءة في وقت محدد. تنظم مقاييس الجهد (POTs) شدة كل مصباح LED بشكل مستقل أو يمكن استخدامها للتحكم اليدوي في LED بدون جهاز كمبيوتر. يمكن أن تكون الأسلاك إلى مصابيح LED بأي طول مخصص ، مما يسمح بوضعها بسهولة في حاضنة أو مساحة مختبر. نظرا للطاقة العالية لمصابيح LED هذه ، يمكن استخدامها لإضاءة مساحة كبيرة باستخدام مصباح LED واحد من مسافة بعيدة.

وصف سائق LED

لتشغيل شدة مصابيح LED والتحكم فيها ، سيمر هذا البروتوكول بخطوات لبناء “برنامج تشغيل LED”. يحتوي كل مصباح LED على مجموعة من الفولتية التي يعمل فيها (الشكل 1C). أثناء التشغيل ، يمكن ضبط جهد خرج المنظم ، الذي يتحكم في شدة الضوء ، بواسطة مقياس الجهد. يغير POT المقاومة ، ويضبط جهد الخرج / السطوع. يعطي الضبط باستخدام وعاء 1kΩ (1 كيلو أوم) ما نسميه “دائرة الجهد العالي” وله نطاق من 1.35 فولت إلى 2.9 فولت. نظرا لأن 2.9 فولت مرتفع جدا لتشغيل مصابيح LED ذات الجهد المنخفض (الشكل 1C) ، فإننا نعرض تعديلا واحدا (المقاوم 3 أو “R3” الشكل التكميلي 1A) يحد من النطاق ليتناسب مع مصابيح LED ذات الجهد المنخفض. يعمل R3 على تقليل الحد الأقصى للجهد المطبق على مصابيح LED إلى 1.85 فولت (التجميع المفصل في الشكل التكميلي 8) عندما يكون بالتوازي مع مقياس الجهد. باستخدام الجهد للتحكم في السطوع بدلا من التيار ، يكون النظام أكثر مرونة لمصابيح LED ذات جهد التشغيل المختلفة. يحتوي الشكل 1C على قائمة بمصابيح LED ذات الجهد العالي والمنخفض لتوجيه اختيار الدائرة الأمثل. يحافظ هذا التصميم على الحد الأدنى للجهد منخفضا بدرجة كافية بحيث يكون مؤشر LED مغلقا تماما عند إيقاف تشغيل مقياس الجهد ولا يسمح للجهد بتجاوز جهد التشغيل النموذجي لمصباح LED. بالنسبة لعلم البصريات الوراثي PhyB ، نستخدم مصابيح LED حمراء عميقة وحمراء بعيدة ، والتي تستخدم دائرة الجهد المنخفض.

وصف نظام التحكم في الكمبيوتر LED

يمكن استخدام نظام إضاءة LED للإضاءة المستمرة بدون جهاز كمبيوتر أو متحكم دقيق. ومع ذلك ، بالنسبة للبرامج النابضة وللتحكم في توقيت LED الفردي ، يجب تثبيت متحكم دقيق. لاستخدام متحكم دقيق للتحكم في مصابيح LED ، يلزم وجود ترانزستور لتوصيل المتحكم الدقيق بالدائرة. يستشعر هذا الترانزستور الجهد من المتحكم الدقيق ويتحول من كونه موصلا أو عازلا. للتحكم في “التشغيل” و “الإيقاف” ، نستخدم ما يسمى “ترانزستور من نوع تبديل NPN” (2N2222) كتحويلة يمكن التحكم فيها عبر R2 (الشكل التكميلي 1A). عندما يتم تطبيق الجهد من المتحكم الدقيق على قاعدة الترانزستور ، يصبح الترانزستور موصلا ويجعل جهد LED منخفضا ، مما يؤدي إلى إيقاف تشغيل مؤشر LED. وبالتالي ، يتم التحكم في حالات تشغيل وإيقاف LED والترانزستور مباشرة بواسطة المتحكم الدقيق ، والذي يتم التحكم فيه بواسطة البرنامج المثبت على جهاز الكمبيوتر.

لصنع نظام الإضاءة ، يلزم اتباع الخطوات التالية: بناء الدائرة الكهربائية ؛ بناء مصدر الطاقة ، ومفتاح الطاقة اليدوي ، و POTs ، واتصال المتحكم الدقيق ؛ بناء المصابيح. استيعاب صندوق أسود ليناسب نظام الإضاءة ؛ توصيل جميع الأسلاك والأجهزة ؛ تثبيت برنامج التحكم LED ، وتحفيز الخلايا بالضوء ؛ قياس التعبير الجيني باستخدام مقايسة لوسيفيراز مزدوجة.

Protocol

1. بناء الدائرة الكهربائية ملاحظة: بروتوكول بناء دائرة واحدة لمصباح LED متاح موصوف هنا. يتم تضمين تعليمات لتوسيع هذا حتى أربعة مصابيح LED في المعلومات التكميلية. قم بتشغيل ممتص الدخان ومكواة اللحام. أضف الماء إلى إسفنجة المسح ، واجعل اللحام في متناول اليد.تنبيه: تأكد من اتخاذ احتياطات السلامة لإزالة الدخان ومنع الحروق. ابدأ لحام مكونات الدائرة بلوحة الدوائر المطبوعة (لوحة PCB) بالترتيب الموضح في اللوحات التكميلية.ملاحظة: استخدم كمية صغيرة من اللحام على طرف حديد اللحام لتسخين معدن المكون ولوحة ثنائي الفينيل متعدد الكلور أولا وإذابة لحام إضافي مباشرة على المكونات ؛ يمكن أن يساعد التدفق كثيرا. أسلاك ومكونات وصلة اللحام (الشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3).بالنسبة لأسلاك العبور (الأسلاك المعزولة التي تربط نقطتين على لوحة الدائرة) ، استخدم قطعتين من الأسلاك البرتقالية [7.6 مم (0.3 بوصة)] والأصفر [12 مم (0.4 بوصة)] من مجموعة العبور. قم بتثبيت لوحة PCB على “أيدي المساعدة” وأدخل أسلاك العبور في الثقوب التالية ، وثني الأطراف 45 درجة وأضف التدفق (الشكل 2 ، الشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3): A1 و A3 → الأرض (-) (برتقالي) ، A7 → مصدر الطاقة (+) # 7 (أصفر) ، D2 → D6 (أصفر). لحام ثم تقليم الجزء الخلفي من الأسلاك. أدخل منظم الجهد LM317T في الثقوب التالية ، وثني المسامير ، وأضف التدفق (الشكل 2 والشكل التكميلي 4): صفة → e5 ، Vخارج → e6 ، Vفي → e7. لحام المحطات اليسرى واليمنى أولا ، وتقليمها ، ثم لحام وتقليم الطرف الأوسط. لضبط نطاق الجهد المنخفض للدائرة ، أدخل مقاوما 820 Ω وصولا إلى الثقوب ، وقم باللحام وتقليم c2 → c5 (الشكل 2 والشكل التكميلي 5). لتمكين التحكم في LED بواسطة المتحكم الدقيق ، أدخل الترانزستور في b3-b5 (الشكل 2 والشكل التكميلي 6): المجمع → b3 ، القاعدة → b4 ، الباعث → b5.ملاحظة: كن على دراية باتجاه الترانزستور لإدخاله بشكل صحيح ؛ تحقق من المواصفات للعثور على تعيين المجمع والقاعدة والباعث. قم بلحام الموصلات من سلك إلى سلك ل POT و LED والمتحكم الدقيق ومصدر الطاقة.ملاحظة: انتبه إلى لون أسلاك الموصلات من سلك إلى سلك وما إذا كنت تستخدم موصلا من سلك إلى سلك أنثى أو ذكرا.حدد ما إذا كانت دائرة “الجهد المنخفض” أو دائرة “الجهد العالي” مطلوبة لمؤشر LED المطلوب (الشكل 1C).ملاحظة: إذا كان مؤشر LED مدرجا في قائمة “الجهد المنخفض” ، فيجب وجود مقاوم بالتوازي مع POT. بالنسبة لدائرة “الجهد المنخفض” أو “الجهد العالي” ، ضع السلك من موصل أنثى من سلك إلى سلك من خلال الفتحة a5 (الشكل التكميلي 7). لا تقم باللحام في مكانه بعد في حالة عمل دائرة الجهد المنخفض.ملاحظة: قم بلف أطراف السلك العاري حتى لا تتقشر شعيرات السلك الصغيرة. إذا بدا السلك سميكا جدا بحيث لا يمكن دفعه عبر الثقب دون أن يتآكل ، فقم بقطع 2-6 خيوط ثم قم بلفها معا مرة أخرى (الشكل التكميلي 7 ب – د). في حالة إنشاء دائرة “الجهد العالي” ، انتقل إلى الخطوة 1.4.5. في حالة صنع دائرة “الجهد المنخفض” ، ادفع المقاوم 560Ω من خلال نفس الفتحة (a5) ولحام بسلك موصل سلك. قم بتوصيل الطرف الآخر من المقاوم بالأرض (الشكل التكميلي 7G). أدخل الطرف الآخر من الموصل الأنثوي من سلك إلى سلك ملحوم في فتحة A5 لتوصيله بالأرض ولحامه (الشكل التكميلي 8 أ ، ب). بالنسبة لتوصيل المتحكم الدقيق ، أدخل أحد طرفي موصل ذكر من سلك إلى سلك في الفتحة A4 والآخر في فتحة متصلة بالأرض (الشكل التكميلي 9 أ – ج). بالنسبة لتوصيل LED ، أدخل أحد طرفي موصل أنثى من سلك إلى سلك في الفتحة A2 والطرف الآخر في فتحة متصلة بالأرض (الشكل التكميلي 9D ، E). 2. بناء امدادات الطاقة ، مفتاح الطاقة اليدوي ، POTs ، واتصال متحكم بناء امدادات الطاقة.لحام وصلة برتقالية [7.6 مم (0.3 بوصة)] من a29 إلى الأرض (الشكل التكميلي 10). لحام موصل أنثى من سلك إلى سلك من a30 إلى مصدر الطاقة (+) (الشكل التكميلي 11A – C). لحام موصل ذكر من سلك إلى سلك من c29 إلى c30 (الشكل التكميلي 11D – F). اقطع الموصل عن سلك إمداد الطاقة ، واكشف الأسلاك ، وقم بتجريدها (الشكل التكميلي 12 أ – ج). أضف تدفقا إلى الأسلاك قبل اللحام باستخدام قلم التدفق (الشكل التكميلي 3G). ضع أنبوبا متقلصا مقاس 3.18 مم (1/8 بوصة) حول موصل ذكر من سلك إلى سلك وقطعة أكثر سمكا 4.76 مم (3/16 بوصة) فوق سلك إمداد الطاقة (الشكل التكميلي 12D). قم بلف الأسلاك من مصدر الطاقة والموصل الذكري من سلك إلى سلك معا ولحام (الشكل التكميلي 12E ، 13A ، B). ضع أنبوب الانكماش الأصغر قطرا 3.18 مم (1/8 بوصة) فوق الوصلات وقم بتقليصها بمسدس حراري (الشكل التكميلي 13C ، D). ضع أنبوب انكماش بقطر أكبر 4.76 مم (3/16 بوصة) فوق أنبوب الانكماش الأصغر 3.18 مم (1/8 بوصة) وقم بتسخينه مرة أخرى (الشكل التكميلي 13E ، F). بناء مفتاح الطاقة اليدوي.ضع أنبوب الانكماش 3.18 مم (1/8 بوصة) فوق أسلاك المفتاح (الشكل التكميلي 14 أ). قم بلف ولحام أسلاك موصل ذكر من سلك إلى سلك (الشكل التكميلي 14B ، C). ضع أنبوب الانكماش 3.18 مم (1/8 بوصة) فوق الأقسام الملحومة وتقلص بمسدس حراري (الشكل التكميلي 14D ، E). قم بتوصيل موصل السلك إلى الذكر ب POT.قم بحلقة السلك الأسود للموصل من سلك إلى سلك حول الطرف الأوسط ل POT (الشكل التكميلي 15B). قم بلف السلك الملتف بإحكام حول الطرف ولحامه (الشكل التكميلي 15C).ملاحظة: يمكن أن تساعد الزردية الدقيقة الصغيرة في إحداث تطور محكم. كرر مع اتصال السلك الأحمر بالجهاز ، كما في الشكل التكميلي 15D. استخدم كماشة لكسر اللسان المعدني بالقرب من السهم الأحمر (الشكل التكميلي 15E ، F). قم ببناء اتصال المتحكم الدقيق (ضروري فقط لمصابيح LED التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر).في حالة إنشاء برنامج تشغيل LED لأكثر من مصباح LED واحد ، قم بقطع الأسلاك السوداء من جميع الموصلات باستثناء موصل أنثى من سلك إلى سلك (الشكل التكميلي 16 أ). تجعيد نهايات الموصلات من سلك إلى سلك ، كما هو موضح (الشكل التكميلي 16 ب – د). ادفع الأطراف المجعدة من خلال الموصل المستطيل (الشكل التكميلي 16E). 3. بناء المصابيح قم بتجريد أطراف السلك (~ 5 مم) وقم بتطبيق التدفق باستخدام قلم التدفق كما في الشكل التكميلي 3G.ملاحظة: لحام الأسلاك بكفاءة على قاعدة LED ، يجب إضافة التدفق إلى جهات الاتصال الموجودة على قاعدة LED والأسلاك. قم بقص السلك عن طريق تسخين السلك من الأسفل وإضافة اللحام من الأعلى (الشكل التكميلي 17 ب). استخدم قلم التدفق لوضع التدفق على ملامسة السطح لقاعدة LED (الشكل التكميلي 17C). ضع كمية سخية من اللحام على طرف لحام كبير (~ 4-5 مم) (الشكل التكميلي 17D) ، واستخدمه لتسخين قاعدة LED عند التلامس (الشكل التكميلي 17E). بعد بضع ثوان ، اسحب اللحام عبر جهة الاتصال (الشكل التكميلي 17F). كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.4 على جهة الاتصال الأخرى (الشكل التكميلي 17G).تنبيه: يمكن أن تصبح قاعدة LED ساخنة جدا أثناء اللحام. ضع قاعدة LED على سطح لا يذوب أو يحترق. قم بقص السلك الأسود على جهة الاتصال “C +” (الكاثود) باستخدام مشابك الشعر (الشكل التكميلي 18A). ضع كمية سخية من اللحام على طرف اللحام الكبير (الشكل التكميلي 18B) واضغط عليه لأسفل على السلك حتى يذوب اللحام الموجود على قاعدة LED (الشكل التكميلي 18C). اضغط باستمرار على السلك (الشكل التكميلي 18D) وقم بإزالة مكواة اللحام أثناء تثبيت السلك في مكانه (الشكل التكميلي 18E). ضع كمية صغيرة من معجون اللحام على الوسادات لتوصيلات LED (الشكل التكميلي 19A ، B) وضع مؤشر LED فوق الوسادات باستخدام ملقط (الشكل التكميلي 19C).ملاحظة: إذا كان الموضع متوقفا قليلا ، فلا بأس ؛ سوف يدخل في مكانه بمجرد ذوبان معجون اللحام. امسك السلك الأحمر على “A +” (الأنود) وقم بقصه بمشبك شعر (الشكل التكميلي 20A – C). ضع كمية سخية من اللحام على طرف اللحام الكبير (الشكل التكميلي 20D) واضغط عليه لأسفل على السلك حتى يذوب اللحام الموجود على قاعدة LED ومعجون اللحام أسفل LED (الشكل التكميلي 20E).ملاحظة: بعد ذوبان معجون اللحام ، يصبح اللون فضيا (الشكل التكميلي 20H ، I). اختر طول السلك اللازم للإعداد المطلوب. قم بتجريد أسلاك LED ، وموصل ذكر من سلك إلى سلك (الشكل التكميلي 21A) ثم أضف التدفق كما في الشكل التكميلي 3G. ضع أنبوب الانكماش فوق الأسلاك. استخدم أنبوب انكماش 3.18 مم (1/8 بوصة) فوق الموصلات من سلك إلى سلك وأنبوب انكماش 4.76 مم (3/16 بوصة) فوق السلك (الشكل التكميلي 21 ب). قم بقص الموصل من سلك إلى سلك باستخدام “أيدي المساعدة” وقم بلف طرف الموصل بالسلك (الشكل التكميلي 21C) وقم بلحامها. كرر مع السلك الآخر (الشكل التكميلي 21D ، E). ضع أنابيب الانكماش 3.18 مم (1/8 بوصة) فوق اللحام وتقلص (الشكل التكميلي 21F – G). ضع أنبوب الانكماش 4.76 مم (3/16 بوصة) فوق أنبوب الانكماش 3.18 مم (1/8 بوصة) وتقلص (الشكل التكميلي 21H-I). قم بقص أسلاك LED “أيدي المساعدة” بشريط تحتها (الشكل التكميلي 22 أ). امزج الإيبوكسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وانتشر فوق الجزء العلوي من مصباح LED الملحوم (الشكل التكميلي 22B). اتركيه بين عشية وضحاها للعلاج. في حالة التركيب باستخدام قفل يعمل باللمس ، قم بقص قطعة صغيرة من مثبت اللمس (الشكل التكميلي 23A) واضغط عليه مقابل الجزء الخلفي من مؤشر LED لمدة 30 ثانية. استخدم أداة دوارة عالية السرعة لعمل شق على غطاء الصندوق الأسود (الشكل التكميلي 23C – E). قم ببناء حامل لمصباح LED واحد من خلال فيلم خصوصية.باستخدام مثقاب الأشياء بأسمائها الحقيقية ، قم بحفر ثقب 1.75 سم (11/16 بوصة) من خلال الجزء العلوي من الصندوق الأسود حيث سيتم وضع مؤشر LED (الشكل التكميلي 24 أ). باستخدام أداة دوارة عالية السرعة ، قم بعمل شق على جانب واحد من الفتحة لإفساح المجال لسلك LED ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 24A. قم بقص قطعة من فيلم الخصوصية (25-30 مم) والشريط على الجزء الداخلي من الصندوق الأسود الذي يغطي الفتحة التي سيضيء مؤشر LED من خلالها (الشكل التكميلي 24A). ضع مؤشر LED خارج الصندوق الأسود أعلى الفتحة مع فيلم الخصوصية والشريط في مكانه بشريط كهربائي (الشكل التكميلي 24B – E). 4. استيعاب صندوق أسود لتناسب نظام الإضاءة بالنسبة لنظام LED بأربعة ، قم بحفر أربعة ثقوب 0.83 سم (21/64 بوصة) على الغطاء 3.81 سم (1.5 بوصة) حيث سيتم توصيل مقاييس الجهد (الشكل التكميلي 25). باستخدام أداة دوارة عالية السرعة ، قم بقص ثقب مستطيل مقاس 1.19 سم × 1.90 سم (0.47 بوصة × 0.75 بوصة) في الزاوية العلوية اليسرى (الشكل التكميلي 25). باستخدام مثقاب الأشياء بأسمائها الحقيقية ، قم بحفر ثقب 1.75 سم (11/16 بوصة) على الصندوق الأسود (الشكل التكميلي 26). قم بملف الثقوب وأدخل الجروميت في الحفرة المحفورة (الشكل التكميلي 26). بالنسبة لمصابيح LED التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر ، قم بصنفرة المنطقة التي سيتم فيها لصق المتحكم الدقيق في صندوق أسود ، بالإضافة إلى الجانب السفلي من حامل وحدة التحكم الدقيقة. ثبت المتحكم الدقيق على الحامل قبل تثبيت الحامل في الصندوق الأسود ثم قم بتثبيته في مكانه (الشكل التكميلي 27 أ). استخدم ورق الصنفرة لصنفرة الجزء السفلي من مقطعين والمنطقة الموجودة في صندوق أسود حيث سيتم وضع الدائرة وتأمين المشابك داخل الصندوق الأسود باستخدام الإيبوكسي (الشكل التكميلي 27 أ). قم بتأمين لوحة ثنائي الفينيل متعدد الكلور في مقاطع (الشكل التكميلي 27 ب). ادفع مفتاح الطاقة من خلال الفتحة المربعة في الغطاء المصنوع في الشكل التكميلي 25 وقم بتثبيته في مكانه (الشكل التكميلي 28 أ). ادفع POTs من خلال الفتحات الموجودة على الغطاء ، وقم بتثبيتها في مكانها (الشكل التكميلي 28A) ، وضع المقبض على POT (الشكل التكميلي 28B). 5. قم بتوصيل جميع الأسلاك والأجهزة قم بتسمية الموصلات من سلك إلى سلك (على سبيل المثال ، LED ، POT ، COM) (الشكل التكميلي 29 أ). قم بتوصيل الموصلات المجعدة المصنوعة في الخطوة 2.4 (الشكل التكميلي 16) بالموصل الذكري من سلك إلى سلك بين الموصلين الأنثويين (POT و LED) (الشكلان التكميليان 7A و S37). قم بتوصيل الأطراف المجعدة بمتحكم دقيق (الشكل التكميلي 30). اسحب كبل USB عبر الجروميت وقم بتوصيله بوحدة التحكم الدقيقة. اسحب أسلاك مصابيح LED عبر الجروميت وقم بتوصيلها بالموصل الأنثوي من سلك إلى سلك على يسار اتصال المتحكم الدقيق (الشكلان التكميليان 9D و 38). اسحب سلك مصدر الطاقة من خلال الجروميت وقم بتوصيله بموصل السلك إلى الذكر على الجانب الأيمن من لوحة ثنائي الفينيل متعدد الكلور (الشكل التكميلي 11D). قم بتوصيل الموصل الذكري من سلك إلى سلك من مفتاح الطاقة إلى الموصل الأنثوي من سلك إلى سلك على يمين لوحة ثنائي الفينيل متعدد الكلور (الشكل التكميلي 11 أ). قم بتوصيل الموصلات الذكرية من سلك إلى سلك من POTs الموجودة على الغطاء إلى الموصلات الأنثوية من سلك إلى سلك على لوحة ثنائي الفينيل متعدد الكلور (الشكلان التكميليان 8 و 36).ملاحظة: لا تقم بتشغيل الدائرة دون توصيل مقاييس الجهد. 6. قم بتثبيت برنامج التحكم LED ملاحظة: راجع إرشادات تثبيت البرنامج التفصيلية في الملف التكميلي على Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces قم بتنزيل وتثبيت البرنامج لبرمجة المتحكم الدقيق قم بتنزيل وتثبيت مدير الحزم. برمجة متحكم دقيق. قم بتنزيل محرك وقت التشغيل وتثبيته. قم بتنزيل واجهة المستخدم. 7. تحفيز الخلايا بالضوء نقل خلايا HEK293.لوحة HEK293 الخلايا في 100k خلية لكل بئر في لوحة 24 بئر. استخدم جدول الأمثلة لحساب الوسائط الخالية من المصل ، والبولي إيثيلينيمين (PEI) ، وأحجام الحمض النووي (الشكل التكميلي 39) والنقل باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. تحفيز الخلايا بالضوء.ملاحظة: يجب إبقاء الخلايا في الظلام بعد النقل أو التعامل معها باستخدام مصدر ضوء لا يثير النظام البصري الوراثي.حدد نوع التحفيز الذي سيتم استخدامه على الخلايا (الضوء المستمر ، شدة النبض ، إلخ). مع إيقاف تشغيل POTs (عكس اتجاه عقارب الساعة) ، قم بتشغيل مصدر طاقة LED. ضع مقياس ضوء داخل الصندوق الأسود حيث سيتم وضع الخلايا ووضع الغطاء مع مؤشر LED فوق جهاز القياس. اضبط شدة الضوء حسب الحاجة. إذا كنت تستخدم الكمبيوتر للتحكم في مصابيح LED ، فافتح برنامج واجهة المستخدم. برمجة واجهة المستخدم (الشكل 5أ ، ب).في اللوحة العلوية اليسرى ، حدد منفذ COM للمتحكم الدقيق وانقر فوق اتصال. استخدم اللوحات الموجودة على اليمين لبرمجة كل مصباح LED. للضوء المستمر ، حدد أي وقت باستثناء الصفر في “Time On” واضبط “Time Off” على الصفر. في اللوحة اليمنى السفلية ، قم ببرمجة عنصر التحكم الرئيسي في التوقيت.لتأخير الإضاءة، حدد تأخير البدء (HH:MM). لإيقاف تشغيل جميع مصابيح LED بعد وقت محدد ، حدد وقت التشغيل (HH: MM). ابدأ برنامج الإضاءة بالنقر فوق الزر ” تشغيل” (الشكل 5 أ). 8. قياس التعبير الجيني باستخدام مقايسة لوسيفيراز المزدوجة تحضير كاشف لوسيفيراز عن طريق خلط 10 مل من محلول لوسيفيراز مع كاشف لوسيفيراز والقسمة في أنابيب سعة 1 مل ليتم تخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد. تحضير محلول التحلل 5x إلى 1x مقابل 100 ميكرولتر لآبار N + 2. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 30 عينة ، 30 × 20 ميكرولتر من محلول تحلل 5X ، و 30 × 80 ميكرولتر من MQ H2O. تحضير محلول ركيزة رينيلا: 20 ميكرولتر من ركيزة رينيلا مقابل 1 مل من محلول رينيلا (هذه الكمية مناسبة ل 10 مقايسات). قم بإزالة الخلايا من الحاضنة ، واستنشاق الوسائط ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول تحلل 1x لكل بئر وضعه على شاكر عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. ضعه في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. أضف 100 ميكرولتر من كاشف لوسيفيراز لكل عينة إلى بئر من لوحة بيضاء 96 بئر. قم بإعداد قارئ اللوحة للتلألؤ. باستخدام وحدة مقياس الإنارة لقارئ اللوحة ، اضبط التكامل لمدة 1 ثانية. أضف المحللات المذابة في الآبار أسفل كاشف لوسيفيراز. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، امزج 20 ميكرولتر من العينة في كاشف لوسيفيراز وقم بقياس التلألؤ على الفور. بعد هضبة القراءات ، أضف 100 ميكرولتر من محلول ركيزة Renilla وقم بالمسح الضوئي مرة أخرى. قسم إشارة Luciferase على إشارة Renilla لحساب كفاءة النقل. قارن إشارات لوسيفيراز الطبيعية لكفاءة النقل (على سبيل المثال ، قارن الإشارة من الضوء الأحمر المضيء والعينات المضيئة بالضوء الأحمر البعيد).

Representative Results

بمجرد تجميع دائرة الطاقة ومصدر الطاقة ومفتاح الطاقة و POTs و LED (حتى الشكل التكميلي 21) ، يمكن اختبار الدائرة. مع وجود جميع POTs في مكانها الصحيح ، سيتحكم POT في شدة LED. بمجرد اكتمال التجميع حتى الشكل التكميلي 29 ، يمكن استخدام النظام يدويا لعلم البصريات الوراثي أو التطبيقات الأخرى. يمكن التحكم في طاقة النظام بالكامل يدويا باستخدام مفتاح الطاقة. يمكن التحكم في شدة كل مصباح LED بشكل مستقل باستخدام POT المتصل بكل دائرة. بعد تثبيت البرنامج وبرمجة وحدة التحكم الدقيقة ، يمكن لواجهة المستخدم التواصل مع وحدة التحكم الدقيقة. باستخدام واجهة المستخدم ، يمكن التحكم في مصابيح LED مؤقتا بعدة طرق: (1) يمكن برمجة كل مصباح LED للبقاء قيد التشغيل لفترة محددة ، (2) يمكن برمجة كل مصباح LED على النبض ، (3) يمكن برمجة تأخير بدء عالمي (على سبيل المثال ، عند نقل الضوء وتسليط الضوء بعد 24 ساعة) (الشكل 6 ب) ، (4) الوقت الإجمالي لتشغيل البرنامج بعد التأخير. هناك واجهتان للمستخدم ، واحدة بها أزرار أكبر يمكنها التحكم في مصباحي LED في وقت واحد والأخرى يمكنها التحكم في أربعة مصابيح LED (الشكل 5أ ، ب). تم تحسين واجهة مستخدم LED للأجهزة اللوحية وهي كافية للتحكم في مصابيح LED الحمراء والحمراء البعيدة للعديد من التجارب. بالنسبة للتجارب الأكبر حجما ، يمكن استخدام واجهة المستخدم الثانية للتحكم في ما يصل إلى أربعة مصابيح LED. عند تحفيز التعبير الجيني ، تعتمد النتيجة المتوقعة على عدة معلمات. وتشمل هذه وقت الحث ، ومستويات الحث (على سبيل المثال ، كمية الضوء أو الدواء) ، وعدد نسخ البناء المستحث في الخلية. لإظهار ذلك ، قمنا بنقل مفتاح جين PhyB جنبا إلى جنب مع كميات مختلفة من الحمض النووي للمراسل (pPK-202) (0.5٪ و 1٪ و 2٪ و 4٪ و 8٪ من الحمض النووي المنقول) (الشكل 6 أ) وأضاءت كما هو موضح في الشكل 6 ب. في العينات التي تحتوي على PhyB ، ولكن لا يوجد بلازميد لإنتاج phycocyanobilin (PCB-chromophore) (أي لا يستجيب للضوء) ، يزداد تعبير / تسرب جين luciferase مع كمية الحمض النووي للمراسل (الشكل 6C) (أحمر بعيد P < 0.0001 ، الانحدار الخطي متبوعا باختبار Wald) ، (Red P < 0.0001 ، الانحدار الخطي متبوعا باختبار Wald). بالإضافة إلى ذلك ، عندما يضيء مفتاح جين PhyB بالكامل ، بما في ذلك البلازميد المنتج لكروموفور ثنائي الفينيل متعدد الكلور (الخلايا الحساسة للضوء) ، للضوء الأحمر البعيد ، يزداد تعبير Luciferase أيضا مع زيادة كميات بناء المراسل في مزيج النقل (الشكل 6C ، D) (الضوء الأحمر البعيد P < 0.0001 ، الانحدار الخطي متبوعا باختبار والد). وبالمثل ، عندما تضيء الخلايا الحساسة للضوء بالضوء الأحمر ، يزداد تعبير لوسيفيراز أيضا مع زيادة كمية المراسل (P < 0.0001 ، الانحدار الخطي متبوعا باختبار والد). عند مقارنة مستويات الحث للخلايا المعالجة بالضوء الأحمر بالخلايا المعالجة بالضوء الأحمر البعيد ، وجدنا انخفاضا طفيفا في تنشيط الطي مع زيادة كمية المراسل (الشكل 6E) (P = 0.0141 ، الانحدار الخطي متبوعا باختبار والد). الشكل 1: دائرة أساسية لمصباح LED واحد. (أ) مخطط انسيابي يوضح نظرة عامة على الخطوات اللازمة لبناء نظام إضاءة LED. (ب) نظام التحكم في إضاءة LED. (يسار) صندوق تحكم لتنظيم شدة LED وتوقيتها. (وسط) جهاز لوحي للكمبيوتر الشخصي يعمل بواجهة مستخدم للتحكم في مصابيح LED. (يمين) صندوق أسود لتركيب مصابيح LED ووضع خلايا للتحفيز البصري. (ج) جدول لتحديد ما إذا كان مؤشر LED يتطلب دائرة جهد عالية أو منخفضة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: تعليمات لحام المكونات في مكانها. (أ) مثال على التعليمات الكرتونية خطوة بخطوة لبناء الدائرة. (ب، ج) مثال على التعليمات مع صور الجهاز الذي يتم تجميعه. د: مثال على تعليمات تجميع دوائر كهربية متعددة في وقت واحد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 3: مناظر لنظام تحكم LED مجمع. (أ) منظر خارجي علوي للنظام المجمع. (ب) منظر داخلي لنظام إضاءة LED رباعي مجمع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: تعليمات لإعادة إنحسر لحام LED على المشتت الحراري. (أ) قاعدة LED ولقطة مقربة لمصباح LED أحمر غامق. (ب) وضع معجون اللحام على قاعدة LED. (ج) صورة LED ملحومة. تشير الأسهم الحمراء إلى منصات اللحام. بالمقارنة مع الرمادي قبل اللحام (A) ، بعد اللحام ، يبدو اللحام معدنيا / لامعا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 5: برنامج للتحكم في تجارب البصريات الوراثية. (أ) واجهة مستخدم LED مع أزرار كبيرة لسهولة الاستخدام مع جهاز لوحي غير مكلف. (ب) واجهة مستخدم بأربعة مصابيح LED. تسمح كلتا الواجهتين بالتحكم المستقل في LED. للنبض ، يمكن برمجة مصابيح LED للتشغيل والإيقاف لعرض نبضة محددة وفترات محددة. يمكن أن يكون للنبض أيضا تأخير في البدء ووقت تشغيل إجمالي محدد مسبقا. (ج) قرص التحكم LED المثبت على حاضنة زراعة الخلايا. د: رسم توضيحي لنظام الجينات PhyB عند إضاءته بضوء أحمر بعيد. يحافظ الضوء الأحمر البعيد على الجين في حالة “إيقاف” أو “مظلمة”. ه: رسم توضيحي لنظام الجينات PhyB عند إضاءته بالضوء الأحمر. يحفز الضوء الأحمر التعبير الجيني من خلال تعزيز التفاعل بين PhyB و PIF3. يعمل هذا التفاعل على توطين مجال تنشيط الجينات (AD) المنصهر في PIF3 إلى مروج UAS ، مما يؤدي إلى تنشيط جين المراسل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 6: النتائج المتوقعة باستخدام نظام LED للتحكم في PhyB. (أ) ترميز البلازميد PhyB + PIF3 شركاء هجينين (pPK-351) ، وإنزيمات تخليق phycocyanobilin المشفرة للبلازميد (PCB-chromophore) (pPK-352) ، وبلازميد مراسل Luciferase (pPK-202). (ب) الجدول الزمني لتجارب الحث الضوئي ل C-E. (ج) مستويات النسخ القاعدية (تسرب AKA) مع كميات متزايدة من الحمض النووي للمراسل. لا يتم نقل عينات “التسرب” باستخدام pPK-352 (أي لا تستجيب للضوء) ، ولكنها تضيء بالضوء الأحمر أو الأحمر البعيد. تشمل عينات مفتاح الضوء (LS) جميع بلازميدات تبديل الجينات الخفيفة وتضيء بالضوء الأحمر أو الأحمر البعيد. د: مستويات تحريض الضوء استجابة للضوء الأحمر والضوء الأحمر البعيد. (الضوء الأحمر LS-Far-هو نفس البيانات في C و D.) (ه) تحريض أضعاف لوسيفيراز في الخلايا المضاءة بالضوء الأحمر / الضوء الأحمر البعيد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.  يرجى النقر هنا لتنزيل الأشكال التكميلية 1-39. الشكل التكميلي 1: دائرة تشغيل إلكترونية لمصابيح LED متعددة. (أ) مخطط الدائرة لنظام LED واحد. ب: مخطط الدائرة لنظام LED أربعة. الشكل التكميلي 2: وضع التوصيلات البينية للدائرة. (أ) قم بقص لوحة PCB الخاصة بك على يديك المساعدة. (ب) موضع وصلات الدائرة الرئيسية في الثقوب في الصورة. (ج) رسم تخطيطي لموصلات الأسلاك التي تحدد الإحداثيات. بالنسبة لأنظمة LED الأربعة ، ارسم خطوطا تقسم كل دائرة كما هو موضح (خطوط عمودية سوداء). يصف الشكل التكميلي 31-38 تجميع أربع دوائر في وقت واحد. الشكل التكميلي 3: لحام الأسلاك على ثنائي الفينيل متعدد الكلور. (أ) ثني وصلات العبور بحيث تتلامس مباشرة مع ثنائي الفينيل متعدد الكلور وتبقى في مكانها أثناء اللحام. ب: منظر آخر للأسلاك المثنية. ج: الأسلاك بعد اللحام. (د) الأسلاك المشذبة على ثنائي الفينيل متعدد الكلور. (ه) تقلص العزل بعد التسخين باللحام. (و) تحريك العزل إلى موضعه لتغطية الأرض من خلال الفتحة (السهم الأزرق) (ز) إضافة تدفق إلى طرف سلك أو طرف. الشكل التكميلي 4: لحام منظم الجهد في مكانه. (أ) خريطة إحداثيات منظم الجهد. (ب) وضع منظم الجهد. (ج) أسلاك منظم الجهد المنحني. (د) أطراف منظم الجهد بعد اللحام. الشكل التكميلي 5: لحام المقاوم R1 في مكانه. (أ) خريطة إحداثيات المقاومة R1 (820Ω). (ب) سحب المقاومة من خلال الرصاص باستخدام كماشة (ج) المقاومة المسحوبة بالقرب من ثنائي الفينيل متعدد الكلور. (د) المقاوم الملحوم بالقرب من ثنائي الفينيل متعدد الكلور. الشكل التكميلي 6: لحام الترانزستور في مكانه. (أ) خريطة إحداثيات الترانزستور واتجاهه. (ب) لاحظ اتجاه الترانزستور ؛ يواجه الملصق في هذا النموذج منظم الجهد (LM317T). تحقق جيدا من مواصفات الترانزستور للتأكد من وجود “الباعث” و “القاعدة” و “المجمع” في الثقوب الصحيحة. (ج) الترانزستور مع ثني الأطراف قبل اللحام. الشكل التكميلي 7: لحام الموصل من سلك إلى سلك لمقياس الجهد في مكانه (بالإضافة إلى مقاوم 560Ω لدائرة الجهد المنخفض). (أ) خريطة إحداثيات الموصل من سلك إلى سلك (بالإضافة إلى R3-560Ω في حالة بناء دائرة الجهد المنخفض ، يتم وضع الموصل من سلك إلى سلك في الفتحة قبل المقاوم). ب: موصل أنثى من سلك إلى سلك. (ج) لتسهيل تركيب المقاوم والموصل من سلك إلى سلك في الفتحة ، يتم ثني 3-5 خيوط من السلك المضفر. (د) يتم قطع الخيوط بقواطع سلكية قريبة من العزل قدر الإمكان. (ه) سلك أحمر مدرج لموصل أنثى من سلك إلى سلك من خلال فتحة A5 (بالنسبة لدائرة الجهد المنخفض ، أدخل R3 من خلال نفس الفتحة من خلالها). (F) منظر سفلي للمقاوم وموصل سلك إلى سلك قبل اللحام. (ز) صورة المقاوم R3 الملحوم المتصل بالأرض (F = أنثى). الشكل التكميلي 8: لحام الموصل من سلك إلى سلك لمقياس الجهد على الأرض. (أ) خريطة إحداثيات الوصلة الأرضية للموصل من سلك إلى سلك لمقياس الجهد. (B) منظر علوي لموصل مقياس الجهد من سلك إلى سلك بالتوازي مع R3 (F = أنثى). الشكل التكميلي 9: لحام المتحكم الدقيق وموصلات LED من سلك إلى سلك. (أ) خريطة إحداثيات الموصل من سلك إلى سلك لتوصيل 2N222A والأرض بوحدة التحكم الدقيقة. (ب) موصل ملحوم من سلك إلى سلك. (ج) المنظر العلوي لل(ب). (د) خريطة إحداثيات الموصل الأنثوي من سلك إلى سلك لتوصيل مدخلات الدائرة والأرض بمصباح LED. (ه) موصل أنثى ملحوم من سلك إلى سلك (F = أنثى ، M = ذكر). الشكل التكميلي 10: لحام العبور لدائرة إمداد الطاقة. أ: خريطة إحداثيات الوصلة البرتقالية لتوصيل مصدر الطاقة بالأرض. ب: الوصلة البرتقالية الملحومة في مكانها. (ج) المنظر السفلي للوصلة الملحومة في مكانها. الشكل التكميلي 11: لحام مفتاح الطاقة وموصلات مصدر الطاقة من سلك إلى سلك. (أ) خريطة إحداثيات الموصل الأنثوي من سلك إلى سلك لتوصيل مفتاح الطاقة. (ب) الموصل الأنثوي من سلك إلى سلك ملحوم في مكانه. (ج) وجهة نظر أخرى للبند (ب). (د) خريطة إحداثيات الموصل الذكري من سلك إلى سلك لتوصيل مصدر الطاقة. (ه) موصل ملحوم من سلك إلى سلك. (و) وجهة نظر أخرى ل (ه) (و = أنثى ، م = ذكر). الشكل التكميلي 12: توصيل مصدر الطاقة بموصل ذكر من سلك إلى سلك. (أ) مصدر الطاقة غير المعدل. ب: قطع أسلاك الإمداد بالطاقة. (ج) تجريد أسلاك الإمداد بالطاقة وقطع العزل الزائد. (د) وضع أنبوب الانكماش حول أسلاك إمداد الطاقة. أنبوب يفصل بين الوصلتين (الأسهم الحمراء) وأنبوب لتثبيت الأسلاك المنفصلة (السهم الأصفر). (ه) أسلاك ملتوية تربط مصدر الطاقة بالموصل الأنثوي من سلك إلى سلك. الشكل التكميلي 13: لحام وعزل اتصال مصدر الطاقة بموصل ذكر من سلك إلى سلك. (أ) الوصلة الملحومة بين أرضية مصدر الطاقة وموصل أنثى من سلك إلى سلك. (ب) الوصلة الملحومة بين الطرف الموجب لمصدر الطاقة وموصل أنثى من سلك إلى سلك. (ج) أنبوب الانكماش المسحوب فوق الوصلات الفردية الملحومة (السهم الأحمر). (د) كل من وصلات إمداد الطاقة ملحومة ومزودة بأنبوب انكماش معالج حراريا. (ه) وضع أنبوب الانكماش فوق الوصلات الفردية (السهم الأصفر). (و) إمدادات الطاقة المكتملة. الشكل التكميلي 14: لحام مفتاح الطاقة بموصل ذكر من سلك إلى سلك. (أ) مفتاح الطاقة بأسلاك مجردة وأنبوب انكماش يوضع فوق الأسلاك (الأسهم الحمراء). (ب) الأسلاك التي تربط المفتاح والموصل الذكري من سلك إلى سلك ملتوية معا قبل اللحام. (ج) وضع أنبوب الانكماش فوق الوصلات الملحومة. د: الوصلات المغطاة بأنبوب الانكماش المعالج حراريا. (ه) مفتاح طاقة مجمع بموصل ذكر من سلك إلى سلك. الشكل التكميلي 15: توصيل مقياس الجهد بموصل ذكر من سلك إلى سلك. أ: أجزاء مقياس الجهد. (ب) موصل ذكر من سلك إلى سلك ملتوي ومنحني للربط حول الطرف الأوسط لمقياس الجهد. (ج) موصل ذكر من سلك إلى سلك ملتف حول الطرف الأوسط لمقياس الجهد. (د) وصلات سلكية ملحومة. (ه) سهم أحمر يشير إلى اللسان المعدني قبل إزالته. (و) مقياس الجهد بعد إزالة اللسان المعدني. الشكل التكميلي 16: توصيل توصيل المتحكم الدقيق. (أ) أسلاك الموصلات الأنثوية من سلك إلى سلك تم تجريدها وقطعها استعدادا للعقص. (ب) وضع التجعيد على الموصل من سلك إلى سلك. (ج) تجعيد الموصل من سلك إلى سلك. (د) موصل مجعد من سلك إلى سلك. (ه) اتصال متحكم مجمع بالكامل. الشكل التكميلي 17: أسلاك اللحام و LED على قاعدة LED الجزء 1. (أ) المواد اللازمة لحام LED بقاعدة LED. ب: تعليب طرف السلك المجرد. (ج) تطبيق التدفق على ملامسة قاعدة LED. (د) إضافة لحام إلى طرف اللحام الكبير لتعليب قاعدة LED. (ه) وضع اللحام على التلامس لتسخين قاعدة LED. (F) قاعدة LED بعد سحب طرف اللحام عبر جهة الاتصال. (ز) نفس الإجراء على جهة الاتصال الأخرى. الشكل التكميلي 18: أسلاك اللحام و LED على قاعدة LED الجزء 2. (أ) سلك معلب مثبت على التلامس باستخدام مشبك شعر. لاحظ أن السلك الأسود ملحوم بالكاثود “C-“. (ب) إضافة كمية وفيرة من اللحام إلى طرف اللحام. (ج) طرف اللحام يضغط لأسفل على السلك ، ويذوب اللحام على قاعدة LED والسلك. د: الضغط باستمرار على السلك بحيث يظل في مكانه عند إزالة مكواة اللحام. ه: تثبيت السلك في مكانه حتى تصلب اللحام. الشكل التكميلي 19: أسلاك اللحام و LED على قاعدة LED الجزء 3. (أ) استخدام طرف حاد لوضع معجون اللحام على قاعدة LED لتركيب LED. (ب) قاعدة LED مع معجون اللحام في مكانه. (ج) وضع مؤشر LED على قاعدة LED بحيث تتطابق جهات اتصال LED وقاعدة LED. الشكل التكميلي 20: أسلاك اللحام و LED على قاعدة LED الجزء 4. (أ) لا يزال السلك الأسود مشدودا إلى نقطة التلامس بواسطة مشبك الشعر. (ب، ج) باستخدام مشبك شعر ثان ، يتم تثبيت السلك الأحمر في مكانه. لاحظ أن السلك الأحمر ملحوم بالأنود “A +”. د: إضافة كمية وفيرة من اللحام إلى طرف اللحام. (ه) طرف اللحام يضغط لأسفل على السلك ، ويذوب اللحام على قاعدة LED والسلك وكذلك معجون اللحام أسفل LED. (F) تبريد قاعدة LED الساخنة بعد اللحام. (ز) قاعدة LED مع الأسلاك ومصباح LED ملحوم. (ح، ط) تشير الأسهم الحمراء إلى منصات اللحام. بعد اللحام ، يظهر اللحام معدنيا / لامعا (مقارنة باللون الرمادي قبل اللحام (الشكل التكميلي 16D)). الشكل التكميلي 21: توصيل سلك LED بموصل ذكر من سلك إلى سلك. (أ) الأسلاك المجردة وموصل السلك إلى الذكر بجوار أنبوب الانكماش المقطوع إلى النصف (1/8 بوصة و 3/16 بوصة). (ب) تقليص وضع الأنبوب فوق الأسلاك قبل اللحام. ج: الأسلاك ملتوية معا قبل اللحام. (د) الوصلة الملحومة من السلك إلى الموصل من سلك إلى سلك. ه: السلكان الأحمر والأسود ملحومان معا. (F) وضع أنبوب الانكماش 1/8 بوصة فوق الوصلة الملحومة. (ز) أنبوب الانكماش بعد الانكماش بالمسدس الحراري. (ح) وضع أنبوب الانكماش 3/16 بوصة فوق أنبوب الانكماش الأصغر. (I) الوصلة ملحومة ومختومة بأنبوب الانكماش. الشكل التكميلي 22: تثبيت الأسلاك ومصابيح LED بقاعدة LED باستخدام الإيبوكسي. (أ) استخدام قضيب خشبي لوضع الإيبوكسي في قاعدة LED. يتم وضع شريط أدناه للقبض على أي إيبوكسي يقطر. (ب) ينتشر الإيبوكسي بالتساوي على السطح بأكمله. (ج) يترك مؤشر LED طوال الليل للعلاج. الشكل التكميلي 23: تركيب مصابيح LED داخل غطاء صندوق. (أ) مصباح LED مع قطعة قفل تعمل باللمس متصلة لسهولة التركيب. (ب) مصابيح LED ملونة مختلفة مثبتة داخل الصندوق الأسود باستخدام قفل يعمل باللمس. (ج) شق على غطاء الصندوق الأسود مصنوع بواسطة أداة دوارة عالية السرعة لإفساح المجال لسلك LED. (د) صندوق أسود لتحفيز الخلايا بمثبتات تعمل باللمس لتركيب LED. (ه) وضع طبق متعدد الآبار داخل إصدار قفل اللمس لصندوق LED. الشكل التكميلي 24: تركيب مصابيح LED خارج غطاء الصندوق. (أ) ثقب محفور في غطاء الصندوق الأسود بشق من الأداة الدوارة عالية السرعة لإفساح المجال للسلك (السهم الأحمر). (ب) وضع LED في الفتحة مع وجود السلك في الشق ، مثبت في مكانه بشريط كهربائي. (ج) يتم استخدام قطعتين أخريين من الشريط لتأمين LED. يتعرض الجانب الخلفي من المشتت الحراري لزيادة التبادل الحراري. (د) فيلم الخصوصية المسجل فوق الفتحة حيث سيتم وضع مؤشر LED. يشير السهم الأحمر إلى فيلم الخصوصية. (ه) صندوق أسود لتحفيز الخلايا مع مصباح LED مثبت خارج الصندوق ومع فيلم خصوصية لنشر الإضاءة. (F) وضع طبق متعدد الآبار داخل إصدار فيلم الخصوصية LED + الخارجي لصندوق LED. الشكل التكميلي 25: حفر ثقوب على غطاء الصندوق لمفتاح الطاقة ومقاييس الجهد. (أ) رسم CAD بأبعاد مشروحة لغطاء الصندوق. (ب) غطاء الصندوق مع مقياس الجهد وفتحات مفتاح الطاقة. الشكل التكميلي 26: تحضير فتحة مخرج السلك. (أ) رسم CAD بأبعاد مشروحة. (ب) صورة الحفرة المحفورة مع لقمة الحفر. (ج) تجانس فتحة المخرج باستخدام أداة دوارة عالية السرعة أو أداة إيداع. د: وضع جروميت في فتحة المخرج. الشكل التكميلي 27: وضع المتحكم الدقيق وثنائي الفينيل متعدد الكلور في الصندوق. (أ) حامل المتحكم الدقيق (برتقالي) وحاملات ثنائي الفينيل متعدد الكلور داخل الصندوق. (ب) المتحكم الدقيق وثنائي الفينيل متعدد الكلور مثبتان في الصندوق. الشكل التكميلي 28: وضع مقاييس الجهد ومفتاح الطاقة. (أ) منظر أمامي لغطاء صندوق مزود بمفتاح طاقة وأربعة POTs. (ب) منظر أمامي لغطاء الصندوق مع إضافة مقابض مقياس الجهد. (ج) منظر خلفي لغطاء الصندوق مع المكونات المرفقة. الشكل التكميلي 29: نظام التحكم LED المجمع. (أ) صندوق تحكم مفتوح مع أسلاك تحمل طابعة ملصقات وسحاب مربوط للتنظيم. (ب) الصندوق بمجرد تجميعه بالكامل مع كل وعاء مكتوب عليه مع رقم التعريف الشخصي. الشكل التكميلي 30: وضع الموصل المجعد من سلك إلى سلك. (أ) صورة للموصلات المجعدة من سلك إلى سلك لنظام متحكم دقيق بأربعة LED. (ب) وضع الموصل المجعد في منافذ المتحكم الدقيقة. الشكل التكميلي 31: وضع أسلاك العبور. (أ) لوحة دائرة كهربية مكتوب عليها إحداثيات أسلاك العبور الحمراء. ب: لوحة دائرة كهربية مكتوب عليها إحداثيات أسلاك العبور الصفراء. الشكل التكميلي 32: وضع أسلاك العبور. لوحة دائرة كهربائية تعرض إحداثيات أسلاك العبور الصفراء. الشكل التكميلي 33: إضافة منظمات الجهد. تتم إضافة منظمات الجهد LM317T إلى الدائرة مع إحداثياتها المسماة في المخططات. الشكل التكميلي 34: إدخال مقاومات 820Ω. تضاف مقاومات R1 إلى الدائرة مع تحديد إحداثياتها في المخططات. الشكل التكميلي 35: إدخال الترانزستورات. تتم إضافة الترانزستورات 2N2222A إلى الدائرة مع إحداثياتها الموضحة في المخططات. الشكل التكميلي 36: إدخال الموصلات والمقاومات الأنثوية من سلك إلى سلك (اختياري) لتوصيل POT. تضاف الأسلاك والمقاومات إلى الدائرة الكهربية مع تحديد إحداثياتها في الشكلين. (أ) أدخل السلك الأحمر ، متبوعا بالمقاوم R2 (560Ω) (لدائرة الجهد المنخفض فقط). (ب) أدخل الطرف الآخر من المقاومة في فتحة الأرض المشار إليها. (ج) أدخل الأسلاك السوداء في الثقوب المحددة لتوصيلها بالأرض. ملاحظة: R2 (560Ω) مواز لمقياس الجهد. الشكل التكميلي 37: إدخال موصلات من سلك إلى سلك لتوصيل المتحكم الدقيق وإمدادات الطاقة. تضاف الأسلاك إلى الدائرة مع الإشارة إلى إحداثياتها الموضحة في الشكلين. (أ) أدخل الأسلاك الحمراء في الثقوب المشار إليها. (ب) أدخل الأسلاك السوداء في الثقوب المحددة. الشكل التكميلي 38: إضافة موصلات LED من سلك إلى سلك. (أ) موصلات أنثى من سلك إلى سلك مع تمييز إحداثيات الرصاص الحمراء. (ب) موصل أنثى من سلك إلى سلك مع تمييز إحداثيات الرصاص الأسود. الشكل التكميلي 39: إعداد تجربة تبديل الجينات PhyB-PIF3. (أ) جدول مثال لمزيج رئيسي يحتوي على رينيلا للرقابة الداخلية. (ب) جدول أمثلة لإعداد خليط الحمض النووي (DNA) لمقايسة مراسل لوسيفيراز المزدوج لتجربة علم البصريات الوراثي PhyB-PIF3. (ج) جدول أمثلة لإعداد كاشف نقل PEI واقتباس الخليط على الخلايا (قطرة قطرة). (د) وضع مقياس الضوء لضبط سطوع LED.

Discussion

تم استخدام نظام LED الموصوف هنا في مختبرنا لتحسين وتوصيف والعمل مع العديد من أدوات علم البصريات الوراثية. في Kyriakakis et al.4 ، اختبرنا العديد من مجموعات مفاتيح الجينات PhyB-PIF بالتوازي. ثم استخدمنا هذا النظام لاختبار نبضات الضوء على ترددات مختلفة لقياس حركية تبديل الجينات وشدة الضوء الفعالة. تم استخدام هذا النظام أيضا لتحسين وتوصيف نظامين بصريين وراثيين يستخدمان الضوء الأزرق للتحفيز 5,6. نظرا لأن مصباح LED واحد فقط يحتاج إلى أن يكون ساطعا بدرجة كافية لتنشيط معظم أدوات علم البصريات ، فإن شراء نظام به أعداد كبيرة من مصابيح LED فوق كل بئر ليس ضروريا دائما. هذا الإعداد غير مكلف وموثوق وسهل إعادة التكوين ولا يتطلب خبرة كهربائية مسبقة لاتباع بروتوكول التجميع.

في الأشكال التكميلية التكميلية 31-38 ، نصف كيفية دمج ما يصل إلى أربعة مصابيح LED في النظام. في حين أن هذا قد يحد من بعض التجارب التي تتطلب عددا كبيرا من الظروف المتوازية ، يمكن إضافة المزيد من مصابيح LED عن طريق استبدال مصدر الطاقة 9 فولت المستخدم في هذا البروتوكول بمصدر قوة كهربائية أعلى. وبالمثل ، يمكن توصيل العديد من مصابيح LED منخفضة الطاقة بالتوازي مع كل دائرة. في هذا الترتيب الأخير ، لن يتم التحكم في بعض مصابيح LED بشكل فردي ، ولكن هذا يمكن أن يكون مفيدا عندما تكون هناك حاجة إلى العديد من مصابيح LED لتغطية مساحة أكبر. بمجرد التعرف على إلكترونيات هذا النظام ، هناك العديد من الطرق لتخصيصه. تتضمن الاستراتيجيات الإضافية لتخصيص النظام وضع مؤشر LED بعيدا أو أقرب إلى العينة والإضاءة من خلال المرشحات / الناشرات لظروف الإضاءة المتجانسة أو لمنع التسخين كما في (الشكل التكميلي 23) و Allen et al.5. ميزة أخرى ملحوظة لتصميم LED الخاص بنا هي أنه مغلف بالإيبوكسي وله قفل يعمل باللمس في الخلف. يتيح ذلك وضع LED بشكل آمن في أي مكان تقريبا: في الحاضنات ، وخزانات الأسماك ، وأقفاص الحيوانات ، والجدران ، وما إلى ذلك.

غالبا ما تتطلب العديد من التجارب التي تستخدم علم البصريات الوراثي للتحكم في الجينات ومسارات الإشارات والأنشطة الخلوية الأخرى النبض أو تمتد على نطاقات زمنية كبيرة أو تحتاج إلى إجراؤها في حاضنة ، وبالتالي تتطلب الأتمتة أو التلاعب عن بعد بدون مجهر. تم اختبار نظام LED هذا بشكل مستمر لعدة أشهر داخل حاضنة CO2 مرطبة دون أي مشاكل. بالإضافة إلى ذلك ، مع الأنظمة القابلة للانعكاس مثل أنظمة PhyB البصرية الوراثية ، قد يحتاج المجرب إلى جداول إضاءة نابضة خاصة بالبرنامج. في عملنا السابق4 ، استخدمنا برامج النبض لاختبار ديناميكيات الانعكاس لمفتاح PhyB-PIF3 في خلايا الثدييات من خلال واجهة المستخدم. باستخدام المنهجية الموضحة في هذه المخطوطة ، تعد برمجة بروتوكول النبض أمرا سهلا ، مما يوفر المرونة والاستقلالية اللازمة للعديد من أنواع التجارب البصرية الوراثية بطريقة سهلة الاستخدام.

تشمل أهم الخطوات في بناء هذا النظام تجميع الدائرة الكهربائية على لوحة ثنائي الفينيل متعدد الكلور وتوصيل المكونات ، والتي تم تفصيلها في القسم 1 والقسم 2. من الضروري اتباع كل خطوة في هذه الأقسام بعناية والتحقق مرة أخرى من أرقام الثقب سطرا تلو الآخر قبل لحام كل مكون. يشرح القسم 2 كيفية إعداد المكونات التي سيتم توصيلها بالدائرة. حتى يتم توصيل المكونات في الاتجاه الصحيح ، من المهم بشكل خاص التأكد من تطابق ألوان الأسلاك السوداء والحمراء على الموصلات من سلك إلى سلك. من المحتمل جدا أن تؤثر عمليات الإشراف الصغيرة في هذين القسمين على وظائف النظام. في الواقع ، ستكون الخطوة الأولى في استكشاف أخطاء هذه الطريقة وإصلاحها هي التحقق من أن الدائرة قد تم بناؤها بشكل صحيح وأن جميع التوصيلات في مكانها الصحيح. ثانيا ، يعد التحقق من جودة اللحام بحثا عن التوصيلات السائبة والأسلاك الخاصة بحرق الشعيرات السلكية التي قد تقصر الدائرة ذات أهمية خاصة. تتمثل الخطوة الثالثة في التأكد من أن مصابيح LED تعمل بشكل صحيح ، والتي يمكن القيام بها باستخدام مصدر طاقة أو بطارية 1.5 فولت عن طريق قص طرفي LED بمشابك التمساح. هناك اعتبار آخر يحتمل أن يكون حاسما وهو منع التسخين (عند استخدام مصابيح LED بطاقة عالية) أو نشر الضوء للحصول على إضاءة أوسع انتشارا. لمعالجة هذه الاعتبارات ، يمكن تركيب مصابيح LED خارج الصندوق الأسود مع “فيلم الخصوصية” في الداخل ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 23 و Allen et al.5. نظرا لبساطة هذا النظام ، فإن تفكيكه للتحقق من المكونات المعيارية أو تعديلها أو ترقيتها أو إصلاحها ليس بالأمر الصعب.

عامل حاسم آخر لأنظمة الجينات المستحثة هو النظر في مقدار التنشيط المطلوب أو مقدار التسرب المقبول للنظام البيولوجي الذي يتم التحكم فيه. كما هو موضح في الشكل 6 ، يمكن أن تختلف هذه مع كمية الحمض النووي للمراسل. بالإضافة إلى ذلك ، ستختلف كفاءة النقل ، وبالتالي ، سيختلف عدد نسخ بنيات المراسل في كل خلية. قد يكون من المفيد لبعض التجارب إنشاء خط خلوي بكمية ثابتة من مكونات تبديل الجينات PhyB أو PhyB وفحص الحيوانات المستنسخة ذات النطاق المطلوب من التعبير المستحث ، كما هو شائع مع الأنظمة المحرضة للأدوية. نظرا لحجم وعدم استقرار البلازميد العدسي الفيروسي pPK-2304 ، فقد صنعنا أيضا إصدارات بلازميد غير فيروسية من مفتاح PhyB في العمود الفقري ل pcDNA pPK-351 (Addgene # 157921) و pPK-352 (Addgene # 157922).

من خلال بناء نظام إضاءة LED هذا باتباع هذا البروتوكول ، يكون لدى المستخدمين جميع المكونات اللازمة لإجراء مجموعة واسعة من تجارب البصريات الوراثية في المختبر وفي الجسم الحي. إلى جانب تعليمات استخدام PhyB-PIF3 في خلايا الثدييات ، سيسمح هذا البروتوكول لغير المهندسين وعلماء الأحياء ، بمرونة وفعالية ، باستخدام علم البصريات الوراثي القائم على PhyB في مجموعة متنوعة من السياقات.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر Yingxiao (Peter) Wang و Ziliang Huang و Molly Allen لاختبار إصدارات مختلفة من نظام LED أثناء تطويره. تم دعم هذا العمل من قبل معهد كافلي للدماغ والعقل في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو ومعهد سالك ، والمؤسسة الوطنية للعلوم من خلال مركز NSF لعلوم المعلومات بموجب منحة CCF-0939370 و NIH Grant NS060847 و NIH Grant R21DC018237.

Materials

18AWG 2pin RED Black wire Amazon 15M-28AWG-2468 Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit.
https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1
1K Ohm potentiometer Amazon 52161500 2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob.
https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
20 Gauge Silicone JST Connector Amazon SIM&NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
22 AWG solid jumper wires Amazon WJW-60B-R Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length.
https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
560 ohm 1/2watt 1% tolerance Amazon a14051600ux0301 Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W.
https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN
820 ohm 1/2watt 1% tolerance Amazon TTL-A-8035-50Ea Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W).
https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor
A Male to B Male Cable (10 Feet) Amazon Part# 30-001-10B The cable that comes with the Arduino doesn't fit well in the box.
https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Ardiuino UNO equivilent Amazon Elegoo EL-CB-001 UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino.
https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1
Arduino holder Digikey X000018 Fits very snug.
https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632
Black boxes for circuits and light chambers Amazon 1591ESBK Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black.
https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Blue LED Digikey LXML-PB01-0040 LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134
Cable ties Amazon sd027 Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White).
https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Command Fridge Clips Amazon 17210CLR Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used.
https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
Cyan LED Digikey LXML-PE01-0070 LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd
Electrical tape – 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack Amazon 03429NA Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft.
https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK
Farred LED 720nm Luxeon Star LEDs LXML-PF01 Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW
Farred LED 740nm Ushio EDC740D-1100-S5 Uses "STAR XP 3535" base
https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf
Farred LED 780nm Ushio EDC780D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf
Farred LED 810nm Ushio EDC810D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf
Farred LED 850nm Ushio EDC850D-1100 Uses "STAR XP 3535" base
http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf
Grommets Amazon Pico 6120D These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G
Hair/Alligator Clips Amazon 1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs.
https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
LED base Luxeon Star LEDs LXB-RS20A Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs
https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds
LED PCB fopr Ushio LEDs Adura LED solutions STAR XP 3535 Package LED Fits many other LEDs by Ushio
http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led
Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe Amazon 1943587 Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe.
https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C
NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS Amazon B000FIDTYG These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Picture Hanging Velcro Strips Amazon PH204-16NA With these you can hang the LEDs in many places.
https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H
Power supply Amazon tb013 Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway.
https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1
Power switch Rocker Switch Amazon SIXQJZML These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011
Rectangular Connectors – for crimped wires Digikey 2183-1905-ND 6 Rectangular Connectors – Housings Black 0.100" (2.54mm)
https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB
Red LED Digikey LXM3-PD01 LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base"
https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd
Sandpaper Amazon B002NEV6GS 3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch.
https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1
Solder for soldering wires and circuit components Amazon Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY
Solder-able Breadboard for building the circuit Amazon GK1007 Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007.
https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1
Spade drill bit Amazon Irwin 88811 These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit
Transistor Newark 2N2222A Can buy from many places.
http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197
Voltage regulator Newark LM317T Equivilent to NTE956.
https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC
Windows 10 tablet Amazon B08BYTT79Y Any Windows 10 PC will do.
https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1
Cell Culture Reagents
Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 ATCC ATCC CRL-1573 Common Cell line.
https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 26140079 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose ThermoFisher 11965−092 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118
10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin ThermoFisher 15140122 These are very common and there are many equivalents.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122
White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates ThermoFisher 07-200-589 White plates are preferred. Do not use clear plates.
https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) PolySciences 24765-1 Can be replaced with another transfection reagent.
https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/
Name of Equipment
Diagonal Cutting Plier (110mm) Amazon Proskit 1PK-037S These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11
Dremil 3000 with cutting tool and grinder Amazon Dremel 3000 Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver.
https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3
Dremil cutting and grinding tool Amazon Dremel 200-1/15 Any similar Dremil will work.
https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Dremil grinding tip Amazon Dremel 84922 Silicon Carbide Grinding Stone.
https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922
EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT Amazon DS017 For removing solder/mistakes.
https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI
Helping Hand with Magnifying Glass Amazon SE MZ101B These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch
Pointed Nose Micro Pliers Amazon Hakko CHP PN-20-M Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose.
https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Small screw drivers Amazon Wiha 26197 These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set
Soldering iron Amazon Yihua 939D+ Digital Soldering Station These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR
TraceTech No-Clean Flux Pen Amazon 2507-N Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL.
https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1
Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber Amazon WSA350 For soldering safety.
https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK
Wire strippers Amazon CSP-30-7 These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG
IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG Amazon IWS-3220M These are very common and there are many equivalents.
https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klewer, L., Wu, Y. W. Light-induced dimerization approaches to control cellular processes. Chemistry – A European Journal. 25 (54), 12452-12463 (2019).
  2. Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms. Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).
  3. Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology. Advanced Science. 6 (1), 1800952 (2019).
  4. Kyriakakis, P., et al. Biosynthesis of orthogonal molecules using ferredoxin and ferredoxin-NADP+ reductase systems enables genetically encoded PhyB optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 706-717 (2018).
  5. Allen, M. E., et al. An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics. ACS Synthetic Biology. 8 (10), 2359-2371 (2019).
  6. Huang, Z., et al. Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy. Science Advances. 6 (8), (2020).
  7. Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production. Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).
  8. Hernández-Candia, C. N., Wysoczynski, C. L., Tucker, C. L. Advances in optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using cryptochrome 2 (CRY2). Methods. 164-165, 81-90 (2019).
  9. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  10. Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Reports. 31 (10), 107737 (2020).
  11. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch. Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).
  12. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  13. Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nature Communications. 4, 1779 (2013).
  14. Chen, D., Gibson, E. S., Kennedy, M. J. A light-triggered protein secretion system. The Journal of Cell Biology. 201 (4), 631-640 (2013).
  15. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  16. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chemical Biology. 13 (2), 443-448 (2018).
  17. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
  18. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nature Communications. 6, 6256 (2015).
  19. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).
  20. Gong, X., et al. An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques. Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).
  21. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  22. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  23. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  24. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 41 (7), 77 (2013).
  25. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
  26. Levskaya, A., et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature. 438 (7067), 441-442 (2005).
  27. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nature Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  28. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nature Chemical Biology. 13 (6), 633-639 (2017).
  29. Ong, N. T., Olson, E. J., Tabor, J. J. Engineering an E. coli near-infrared light sensor. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 240-248 (2018).
  30. Zhang, W., et al. Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl. Nature Methods. 14 (4), 391-394 (2017).
  31. Lee, D., et al. Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain. Nature Methods. 14 (5), 495-503 (2017).
  32. Kim, M. W., et al. Time-gated detection of protein-protein interactions with transcriptional readout. eLife. 6, (2017).

Tags

Illumination SystemOptogenetic ExperimentsLEDElectrical CircuitArduinoSolderingWire ConnectorResistorCathodeAnodeSolder PasteShrink TubeFlux

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kyriakakis, P., Fernandez de Cossio, L., Howard, P. W., Kouv, S., Catanho, M., Hu, V. J., Kyriakakis, R., Allen, M. E., Ma, Y., Aguilar-Rivera, M., Coleman, T. P. Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments. J. Vis. Exp. (167), e61914, doi:10.3791/61914 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image