Metabolisches High-Throughput-Profiling für Modellverfeinerungen von Mikroalgen

Phänotyp Microarray Screening der Modellalge Chlamydomonas reinhardtiiDie PM-Assays testen die Fähigkeit der Alge, verschiedene Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor in einem minimalen Medium zu nutzen. In dieser Methodenbeschreibung zeigten wir, wie PM-Assays verwendet wurden, um den Kohlenstoff- und Stickstoffstoffwechsel zu identifizieren. Die Kohlenstoff- und Stickstoffnutzungskinetik wurde mit einem Mikrotiterplattenleser gemessen. Die Daten wurden mit einer PMI-Software analysiert. Die zusammenfassende Kinetik ausgewählter PM-Assay-Platten (PM01 und PM03) ist in Abbildung 1 dargestellt. Die “xy-Diagramme” zeigen die Atmungsmessungen im Laufe der Zeit, die für die Assays der 96-Well-Platten gezeichnet wurden, wobei die y-Achse und die x-Achse die Werte der Rohmessungen bzw. der Zeit darstellen. Die Daten wurden in ein Heatmap-Muster umgewandelt, um die Zusammenstellung der kinetischen Daten vergleichend zu analysieren. Die Pipeline zur Verfeinerung des metabolischen Netzwerks im Genommaßstab unter Verwendung von PM-Daten (Abbildung 2) veranschaulicht die Integration der Hochdurchsatz-PM-Assays mit experimentellen Beweisen aus genomischen Suchen, die ein metabolisches Netzwerkmodell erweitern können. Um die Reproduzierbarkeit der PM-Daten aus PM01- 04- und PM10-Platten zu bestimmen, wurde eine lineare Regression analysiert, um die Daten aus zwei unabhängigen Replikationsexperimenten gegeneinander darzustellen (Abbildung 3). Abbildung 3 zeigt, dass die Mehrzahl der Daten nahezu ähnlich war, da sie auf die 45°-Linie fallen, wobei nur wenige Ausreißer vorhanden waren und ihr BestimmtheitskoeffizientR2 0,9 betrug. Die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Experimente für die Alge wird durch dieses Diagramm verifiziert. Identifizierung neuer MetabolitenDer PM-Assay identifizierte 662 Metaboliten in sieben Platten; PM01-PM04 und PM06-PM08, während die Gaschromatographie Time-Of-Flight (GC-TOF) 77 Metaboliten identifiziert hatte32 (Abbildung 4). Beim Vergleich dieser beiden Sätze mit den 1068 Metaboliten, die im iRC1080 berücksichtigt wurden, überlappten sich nur sechs Metaboliten zwischen den drei Sätzen und 149 überlappten sich zwischen dem iRC1080 und dem PM. Dieses Ergebnis zeigt, dass die metabolische Profiling-Plattform eine bedeutende Quelle für neue metabolische Informationen sein kann. Essigsäure war die einzige Kohlenstoffquelle, die in der Platte PM01 als Unterstützender Kohlenstoff nachgewiesen wurde, nachdem das Hintergrundsignal subtrahiert wurde. Dieser Befund stimmt mit der Literatur33 überein und zeigt die Spezifität der PM-Assays. Die PM-Assays zeigten neue Schwefel-, Phosphor- und Stickstoffquellen, die C. reinhardtii für das Wachstum nutzen kann. Die Schwefelmetaboliten waren Sulfat, Thiosulfat, Tetrathionat und DL-Lipoamid. Die Phosphorquellen waren Thiophosphat, Dithiophosphat, D-3-Phospho-Glycerinsäure und Cysteamin-S-Phosphat. Die Stickstoffquellenmetaboliten waren L-Amino- und D-Aminosäuren, einschließlich weniger häufiger Aminosäuren; L-Homoserin, L-Pyroglutamin, Methylamin, Ethylamin, Ethanolamin und D, L-α-Aminobuttersäure und 108 Dipeptide und fünf Tripeptide (Tabelle 1). Alle 128 neu identifizierten Metaboliten wurden in KEGG und MetaCyc auf ihre assoziierten Reaktionen, EC-Nummern und Signalwege untersucht. Die neuen 128 Metaboliten waren mit 49 eindeutigen EC-Nummern assoziiert. Von diesen wurden 15 ECs mit ihren genomischen Beweisen in Verbindung gebracht, indem sie fünf Quellen verwendeten, darunter: Phytozome Version 10.0.234 JGI Version 435, AUGUSTUS 5.0 und 5.210 Anmerkungen von Manichaikul et al. 36 und KEGG13. Metaboliten ohne genomische Evidenz wurden in die Universal Protein Resource Website (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38 eingegeben, wo ihre verwandten Sequenzen in anderen Organismen gefunden wurden. Homologe Sequenzen in C. reinhardtii wurden durch Ausführen von positionsspezifischem iteriertem BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) von der NCBI-Website identifiziert, wobei nur Sequenzen berücksichtigt wurden, die signifikante Alignments erzeugten (E-Wert <0,005). ModellverfeinerungReaktionen, die mit den neuen 128 Metaboliten assoziiert sind, wurden zusammen mit ihren kodierten Genen dem iRC1080-Modell hinzugefügt, wodurch das Netzwerk erweitert wurde. Das resultierende Modell iBD1106 umfasst 2.444 Reaktionen, 1.959 Metaboliten und 1.106 Gene (Tabelle 2). Die neuen 254 hinzugefügten Reaktionen waren 20 Aminosäureoxidationsreaktionen, 108 Dipeptidhydrolysereaktionen, fünf Tripeptidhydrolysereaktionen und 120 Transportreaktionen, kodiert von vier Genen (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3). Insgesamt 113 hinzugefügte neue Reaktionen sind für die Hydrolyse von Dipeptiden und Tripeptiden verantwortlich. Die Hydrolyse von Dipeptiden und Tripeptiden ist mit zwei Genen assoziiert, einem für Dipeptide (Cre02.g078650.t1.3) und einem für Tripeptide (Cre16.g675350.t1.3). In Bezug auf Phosphorquellen wurde eine Reaktion zur Hydrolyse von Cysteamin-S-Phosphat in Cysteamin und Phosphat hinzugefügt, die mit dem Gen JLM_162926 assoziiert ist. Das WoLF PSORT-Tool39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) und die von Ghamsari et al. berichteten Ergebnisse. 35 wurden angewendet, um die Spezifikation der zellulären Kompartimente zu erhalten, in denen die neuen Reaktionen stattfinden. Durch die Analyse von Proteinsequenzen, die mit den neuen Reaktionen assoziiert sind, sagte WoLF PSORT Zytosol als zelluläres Kompartiment für die Reaktionen voraus. Ein generiertes Stoffwechselmodell kann Lücken enthalten, wenn die biochemischen Informationen unvollständig sind. In solchen Fällen wird gapFind, ein COBRA-Befehl, verwendet. Es listet Wurzellücken auf und ermöglicht die Identifizierung neuer Lücken, die in das neue Modell eingeführt werden. Die Metaboliten, die in einem Stoffwechselmodell nicht produziert werden können, werden als Wurzellücken40,41bezeichnet. Die Analyse der Wurzellücke ergab, dass sowohl die Modelle iRC1080 als auch iBD1106 die gleichen 91 Lücken enthalten. Dies zeigt, dass die Zugabe der neuen Metaboliten und der damit verbundenen Reaktionen keine zusätzlichen Wurzellücken verursachte. Es sollte beachtet werden, dass die in diesem Protokoll verwendete Phänotypisierungsmethode keine Wurzellücken schließt, da den ursprünglichen Wurzellückenmetaboliten Transport- oder Produktionsmechanismen fehlen, die in den Phänotypisierungsassays nicht behandelt wurden. Die Flussbilanzanalyse wurde durchgeführt, um das Stoffwechselverhalten von iBD1106 unter hellen und dunklen Bedingungen zu testen; (kein Acetat) bzw. (mit Acetat). Der Algorithmus maximiert die Biomasse-Vorläuferreaktionen für eine objektive Funktion (Biomassewachstum). Um die Beteiligung jedes Metaboliten an der eingestellten Zielfunktion zu bewerten, wurden “Schattenpreise” für alle Metaboliten berechnet. Die Änderung der Zielfunktion bezüglich der Flussänderungen des Metaboliten definiert den Schattenpreis eines Metaboliten30,42. Der Hinweis, ob ein Metabolit die Zielfunktion “überzählig” oder “einschränkt”, kann durch Schattenpreisanalyse, z.B. Biomasseproduktion, bestimmt werden. Negative oder positive Schattenpreiswerte zeigen Metaboliten, die bei Addition die Zielfunktion verringern oder erhöhen. Nullwerte von Schattenpreisen zeigen Metaboliten, die die Zielfunktion nicht beeinflussen. Der Vergleich der Schattenpreise zwischen iBD1106 und iRC1080 in Abbildung 5 zeigt, dass bei den meisten Metaboliten keine signifikante Veränderung beobachtet wird; Unterschiede finden sich jedoch in 105 bzw. 70 Fällen unter hellen bzw. dunklen Wachstumsbedingungen. Tabelle 4 enthält Beispiele für solche Metaboliten. Abbildung 1: Phänotypische Microarray-Profilierung von C. reinhardtii. Atmungs-XY-Plots und Level-Plots der PM01 (Kohlenstoffquellen; A, C) und PM03 (Stickstoffquellen; B, D) Assay-Platten werden gezeigt. Die Abbildung ist ein 8×12-Array, bei dem jede Zelle eine Well-Plate und damit einen gegebenen Metaboliten oder eine Wachstumsumgebung darstellt. Innerhalb jeder Zell- oder Vertiefungsdarstellung stellen Kurven die Farbstoffumwandlung durch Reduktion (y-Achse) als Funktion der Zeit (x-Achse) dar. PM-Atmungskurven aus dem CC-503 und den rohen Vertiefungen sind in jeder Zelle dargestellt und werden durch Farbe angezeigt (türkisfarbene Farbe steht für leere Vertiefungen und violette Farbe für CC-503). Das Level-Diagramm stellt jede Atmungskurve als dünne horizontale Linie dar, die sich im Laufe der Zeit verfärbt (oder unverändert bleibt). Heatmap-Farbänderungen reichen von hellgelb (wenig bis keine Atmung hat stattgefunden) zu dunkelorange oder braun (signifikante Atmung hat stattgefunden). Die von C. reinhardtii (CC-503) verwendeten Metaboliten und die leeren Platten sind dargestellt. Diese Abbildung stammt aus einer zuvor veröffentlichten Arbeit von Chaiboonchoe et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.  Abbildung 2:Genom-dimensionale metabolische Netzwerkverfeinerungspipeline unter Verwendung von PM-Daten. Nachdem eine neue Verbindung in einem PM-Assay positiv getestet wurde, werden ihre Enzymkommissionsnummer (EC), reaktion und ihr Signalweg aus verfügbaren Datenbanken, z. B. KEGG und MetaCyc, identifiziert. Genomische Beweise werden dann aus Genom- und Annotationsressourcen extrahiert, sofern verfügbar und stellen eine Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp dar. Wenn der direkte genomische Nachweis nicht verfügbar ist, wird die Proteinsequenz anhand der EC-Nummern identifiziert und der genetische Nachweis wird über PSI-Blast identifiziert. Das rekonstruierte Stoffwechselnetzwerk wird dann auf Basis neu identifizierter Verbindungen verfeinert, jedoch erst nach einem Qualitätskontrollschritt, bei dem die Proteindomänen anhand relevanter Datenbanken abgefragt werden. Diese Zahl wurde gegenüber zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.  Abbildung 3: Reproduzierbarkeit von PM-Tests. Die PMI-Werte wurden über einen Zeitraum von 168 Stunden gesammelt und die maximalen PMI-Werte wurden für zwei Wiederholungsstudien aufgetragen. Jede Achse stellt die maximalen PMI-Werte für jede Studie dar (die x-Achse ist eine Replikatstudie und die y-Achse eine andere). Reproduzierte Werte sind von jeder Achse gleich weit entfernt. Jeder Punkt stellt einen einzelnen Maximalwert dar. Die lineare Regression wurde von einer Tabellenkalkulationssoftware durchgeführt, und der resultierende Bestimmtheitskoeffizient(R2)wird angezeigt. Diese Zahl wurde gegenüber zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.  Abbildung 4: Venn-Diagramm der Metaboliten. Das Venn-Diagramm listet Metaboliten auf, diedurch PM-Platten, das i RC1080-Stoffwechselmodell und Gaschromatographie-Time-of-Flight-Experimente (GC-TOF) identifiziert wurden. Jeder Kreis gibt die Gesamtzahl der Metaboliten an, die in der jeweiligen Untersuchungsmethode vorhanden sind. Gleichzeitig stellen die überlappenden Regionen die Anzahl der Metaboliten dar, die zwischen diesen Methoden geteilt werden. Das iRC1080 Stoffwechselmodell enthält insgesamt 1.068 einzigartige Metaboliten. Der GC-TOF identifizierte insgesamt 77 Metaboliten32, während insgesamt 662 Metaboliten mit den PM-Platten identifiziert wurden. Diese Zahl stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Schattenpreise von Metaboliten in iRC1080 und iBD1106 unter verschiedenen Bedingungen für die Biomassemaximierung. Jeder Kreis auf den “Radardiagrammen” entspricht einem Schattenpreiswert, während jede Linie, die sich von der Mitte eines Diagramms erstreckt, einen Metaboliten anzeigt. (A) Schattenpreise und Stoffwechselverhalten von iRC1080 und iBD1106 unter leichten Wachstumsbedingungen; (B), unterschiedliche Stoffwechselverhalten von iRC1080 und iBD1106 unter einer dunklen Wachstumsbedingung. Diese Zahl stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. 12Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Biologie Chemie EG* Gen-Annotation PSI-BLAST Cysteamin-S-Phosphat 3.1.3.1 JLM_1629261,2,3,4 Tetrathionat 1.8.2.2 unbedeutender E-Wert 1.8.5.2 unbedeutender E-Wert D-Alanin 1.4.1.1 XP_001700222.1 1.5.1.22 fehlgeschlagene manuelle QC 2.1.2.7 unbedeutender E-Wert 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 2.3.2.10 unbedeutender E-Wert 2.3.2.14 unbedeutender E-Wert 2.3.2.16 unbedeutender E-Wert 2.3.2.17 unbedeutender E-Wert 2.3.2.18 unbedeutender E-Wert 2.6.1.21 fehlgeschlagene manuelle QC 3.4.13.22 XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1 3.4.16.4 Chlre2_kg gerüst_ 140000391,2,3 3.4.17.8 fehlgeschlagene manuelle QC 3.4.17.13 unbedeutender E-Wert 3.4.17.14 unbedeutender E-Wert 4.5.1.2 unbedeutender E-Wert 6.1.1.13 fehlgeschlagene manuelle QC 6.1.2.1 fehlgeschlagene manuelle QC 6.3.2.4 au.g14655_t11,2,3 6.3.2.10 fehlgeschlagene manuelle QC 6.3.2.16 unbedeutender E-Wert 6.3.2.35 unbedeutender E-Wert D-Asparagin 1.4.5.1 unbedeutender E-Wert 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 3.1.1.96 unbedeutender E-Wert 2.3.1.36 unbedeutender E-Wert 1.4.99.1 XP_001692123.1 3.5.1.77 e_gwW.1.243.11,2 3.5.1.81 unbedeutender E-Wert 5.1.1.10 fehlgeschlagene manuelle QC D-Asparaginsäure 6.3.1.12 unbedeutender E-Wert 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 D-Glutaminsäure 1.4.3.7 unbedeutender E-Wert 1.4.3.3 unbedeutender E-Wert D-Lysin 5.4.3.4 unbedeutender E-Wert 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 6.3.2.37 fehlgeschlagene manuelle QC D-Serin 2.7.11.8 unbedeutender E-Wert 2.7.11.17 Cre12.g486350.t1.31,2,3,4 3.4.21.78 fehlgeschlagene manuelle QC 3.4.21.104 fehlgeschlagene manuelle QC 4.3.1.18 g6244.t14 fehlgeschlagene manuelle QC 6.3.2.35 unbedeutender E-Wert 6.3.3.5 unbedeutender E-Wert 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 D-Valin 1.21.3.1 fehlgeschlagene manuelle QC 6.3.2.26 fehlgeschlagene manuelle QC 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 L-Pyroglutaminsäure Thiophosphat Dithiophosphat Ethylamin 6.3.1.6 D,L-a-Amino-Buttersäure 2.1.1.49 unbedeutender E-Wert 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 Dipeptid 3.4.13.18 Cre02.g078650.t1.31 Tripeptid 3.4.11.4 Cre16.g675350.t1.31 Tabelle 1: Liste der identifizierten Metaboliten zur positiven Substratverwertung (C, P, S, N), die im metabolischen Modell iRC1080 nicht vorhanden sind.  *Die Reaktion war nicht eingeschlossen, wenn kein Gen identifiziert wurde.  1. Phytozom Version 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   arabische Ziffer JGI Version 4 35.  Nr. 3 Augustus Version 510.  Nr. 4 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  Nr. 5 JGI Version 3.136.  Diese Tabelle stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. Nr. 12 Modell Reaktionen Metaboliten Gene iRC1080 2,191 1,706 1,086 iBD1106 2,445 1,959 1,106 Tabelle 2: Inhalt von iRC1080 und iBD1106.  Diese Tabelle stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. Nr. 12 Kategorie oder Klasse von Reaktionen Anzahl der Reaktionen Aminosäuren 20 Dipeptide 108 Tripeptide 5 Transportreaktion 120 Tabelle 3: Zusammenfassung der neuen Reaktionen in iBD1106. Diese Tabelle stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. Nr. 12 Wachstumsbedingung Metabolit Name iRC1080 iBD1106 4r5au 4-(1-D-Ribitylamino)-5-Aminouracil 0 0.168 5aprbu 5-Amino-6-(5′-phosphoribitylamino)uracil -0.009 0.158 Licht pa1819Z18111Z 1-(9Z)-Octadecenoyl,2-(11Z)-Octadecenoyl-sn-glycerin3-phosphat -0.009 -0.65 Dunkel 4abut 4-Aminobutanoat 0.18 -0.05 Tabelle 4: Beispiel für signifikante Schattenpreise für iRC1080 und iBD1106. Diese Tabelle stammt aus zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. Nr. 12