JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

التنميط الأيضي عالي الإنتاجية لتحسينات نموذج الطحالب الدقيقة

Published: December 04, 2021
doi:
10.3791/61913
, , , , , , , ,
1Center for Genomics and Systems Biology (CGSB),New York University Abu Dhabi Research Institute, 2Department of Biology,United Arab Emirates University, 3Laboratory of Algal, Systems, and Synthetic Biology (LASSB), Division of Science and Math,New York University Abu Dhabi, 4Department of Marine Science, Ocean College,Zhejiang University

Summary

يوضح هذا البروتوكول استخدام منصة تقنية microarray النمط الظاهري (PM) لتحديد المتطلبات الأيضية ل Chlamydomonas reinhardtii ، وهو ميكروالغا خضراء ، وصقل نموذج شبكة التمثيل الغذائي الحالي.

Abstract

يتم إعادة بناء نماذج التمثيل الغذائي على أساس الشرح الجينوم الكائن الحي المتاحة وتوفير أدوات تنبؤية لدراسة عمليات التمثيل الغذائي على مستوى النظم. قد تتضمن نماذج التمثيل الغذائي على نطاق الجينوم ثغرات وكذلك ردود الفعل التي لم يتم التحقق منها تجريبيا. وستؤدي النماذج المعاد بناؤها لأنواع الطحالب الدقيقة المعزولة حديثا إلى نقاط ضعف بسبب هذه الفجوات، حيث توجد عادة أدلة كيميائية بيولوجية متناثرة متاحة لعملية التمثيل الغذائي لهذه العزلات. التكنولوجيا microarray النمط الظاهري (PM) هو فعال, طريقة عالية الإنتاجية التي تحدد وظيفيا الأنشطة الأيضية الخلوية استجابة لمجموعة واسعة من الأيض دخول. الجمع بين عالية الإنتاجية فينوتيبيك المقايسات مع النمذجة الأيضية يمكن أن تسمح نماذج شبكة التمثيل الغذائي القائمة لإعادة بناء بسرعة أو الأمثل من خلال توفير الأدلة الكيميائية الحيوية لدعم وتوسيع الأدلة الجينومية. هذا العمل سوف تظهر استخدام المقايسات PM لدراسة الطحالب الدقيقة باستخدام الأنواع نموذج الطحالب الدقيقة الخضراء Chlamydomonas reinhardtii كمثال على ذلك. تم استخدام الأدلة التجريبية لأكثر من 254 ردود الفعل التي حصل عليها رئيس الوزراء في هذه الدراسة لتوسيع وصقل نموذج شبكة التمثيل الغذائي C. reinhardtii على نطاق الجينوم، iRC1080، بنسبة 25 في المئة تقريبا. يمكن استخدام البروتوكول الذي تم إنشاؤه هنا كأساس للتنميط الوظيفي لعملية التمثيل الغذائي للطحالب الدقيقة الأخرى ، بما في ذلك المسوخ المعروفة بالطحالب الدقيقة والعزلات الجديدة.

Introduction

يتطلب تحسين عملية التمثيل الغذائي للطحالب من أجل إنتاج معزز ومستقر من الأيض المستهدف تطوير استراتيجيات هندسية استقلابية معقدة من خلال تحليلات على مستوى الأنظمة لشبكات التمثيل الغذائي. نماذج شبكة الأيض يمكن أن توجه تصاميم عقلانية للتطوير السريع لاستراتيجيات التحسين1،2،3،4. على الرغم من أن ما يقرب من 160 نوعا من الطحالب الدقيقة قد تم تسلسل5، وهناك ، على حد علمنا ، فقط 44 نماذج التمثيل الغذائي الطحالب المتاحة4،6،7. نظرا لصعوبة الحصول على بيانات التمثيل الغذائي عالية الإنتاجية للتحقق التجريبي من المعلومات الجينومية ، فإن إعادة بناء نماذج الشبكة عالية الجودة متخلفة عن التطور السريع لتسلسل الجينوم الطحالب.

C. reinhardtii هو نظام نموذج جذاب للدراسات القائمة على الطحالب. هذا النوع يمكن أن تنمو فوتوتوتروفيكالي أو غير مداري، وقد استخدمت على نطاق واسع ككائن حي نموذجي في البحوث الأساسية والتطبيقية. وقد نشرت تسلسل الجينوم في 20078, مع نماذج التمثيل الغذائي على نطاق الجينوم أعيد بناؤها في وقت لاحق للأنواع9,10,11. تم إعادة بناء نموذج الجينوم على نطاق C. reinhardtii (iRC1080) من قبل تشانغ وآخرون. 10 استنادا إلى أدلة الجينوم والأدب (التي تنطوي على مصادر ~ 250). لديها 1,706 الأيض مع 2,190 ردود الفعل10; ومع ذلك، لم يكن من الممكن التحقق من اكتمال النموذج بما يتجاوز الأدلة التجريبية المنشورة المتاحة في ذلك الوقت.

التكنولوجيا microarrays النمط الظاهري (PMs) هي منصة عالية الإنتاجية التي يمكن أن توفر معلومات التنميط الأيضي للكائنات الحية الدقيقة غير المتغايرة وكذلك خلايا زراعة الأنسجة. على وجه الخصوص ، يمكن استخدامه لمعالجة الفجوة المعرفية من النمط الظاهري إلى النمط الجيني في الطحالب الدقيقة ، كما ذكرت لأول مرة ل Chlamydomonas reinhardtii12 وبعد ذلك لنوع من الكلورويديوم13 وكلوريلا14. من خلال دراسة استجابات الخلايا لآلاف الأيضات ، والجزيئات الإشارات ، الأوسموليت ، وجزيئات التأثير ، يمكن أن توفر مقايسات PM التنميط الأيضي الوظيفي وتقدم رؤى حول الوظيفة والتمثيل الغذائي والحساسية البيئية15و16و17. على وجه التحديد، PM المقايسات الكشف عن استخدام الخلايا المستقلب في 96-جيدا microplates مع مختلف المواد الغذائية، المستقلبات، أو الأوسموليت الواردة في كل بئر. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أيضا أن تقس الجزيئات النشطة بيولوجيا، مثل المضادات الحيوية والهرمونات. كما تحددها كثافة إنتاج الألوان من خلال الحد من NADH من صبغة الأكسدة المستندة إلى رباعي الزوليوم ، يتم تقييم الاستخدام الأيضي للركائز من حيث تنفس الخلية15،16،17. يمكن مراقبة التجارب في 96 لوحة صغيرة بشكل جيد وتحديدها تلقائيا بمرور الوقت باستخدام منصة أداة microarray النمط الظاهري (PMI). تم تصميم 20 لوحة صغيرة من 96 بئرا لتمثيل الأيضات المشتركة لدراسة الأنماط الظاهرية الخلوية للاستفادة من مصادر الكربون والنيتروجين والكبريت والفوسفور ، إلى جانب تأثيرات مختلفة من التناضح / الأيونات والأساتذة. وقد استخدمت بنجاح التكنولوجيا PM لتحديث ورفع مستوى عدد من النماذج الأيضية القائمة على نطاق الجينوم للكائنات الحية الدقيقة15،16،17،18.

يستند البروتوكول والبيانات المعروضة هنا إلى أعمال نشرت سابقا لشيبوونتشو وآخرون. 12 العمل المعروض تفاصيل استخدام طريقة الفحص PM لتوصيف الأنماط الظاهرية الأيضية من الطحالب الدقيقة وتوسيع نموذج التمثيل الغذائي الطحالب القائمة من C. reinhardtii وكذلك لتوجيه إعادة بناء نماذج التمثيل الغذائي الجديدة.

Protocol

1. تجارب ميكرواراي النمط الظاهري الحصول على سلالة C. reinhardtii CC-503 من مركز موارد الكلاميدوموناس في جامعة مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكية (https://www.chlamycollection.org). تنمو الخلايا في الطازجة تريس أسيتات فوسفات (TAP) وسائل الإعلام19 مع تركيزات النهائي من 400 ميكروغرام / مل timentin، 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين، و 100 ميكروغرام / مل kanamycin (لمنع نمو البكتيريا) تحت 400 الفوتونات ميكرومول / م2ثانية، في 25 درجة مئوية، لمدة يومين إلى منتصف مرحلة السجل. تدور أسفل الثقافة في 2000 × ز لمدة 10 دقيقة في 22 درجة مئوية والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه. إعداد وسائل الإعلام TAP الطازجة التي تحتوي على 0.1٪ رباعي الزوليوم صبغة البنفسجي “D”.ملاحظة: تعديل وسائط TAP في هذه الخطوة لاستبعاد بعض العناصر الغذائية اعتمادا على فئة المستقلب التي تم اختبارها في كل لوحة (على سبيل المثال، استبعاد كلوريد الأمونيوم للوحات مصدر النيتروجين). Resuspend بيليه في وسائل الإعلام TAP الطازجة المعدة (من الخطوة 1.2) إلى تركيز النهائي من 1 × 106 خلايا / مل. استخدام لوحات المقايسة صفيف مركب كيميائي (مصادر الكربون، مصادر النيتروجين، الفوسفور والكبريت مصادر لوحات، ومصادر النيتروجين الببتيد). تلقيح a 100 ميكرولتر aliquot من الوسائط المحتوية على الخلية في كل بئر من لوحات المقايسة.ملاحظة: تأكد من تكرار المقايسات. الخلايا المتتالية على استخراج الخميرة / لوحات بيبتون وأداء تلطيخ غرام، كما هو الحال في سميث وآخرون. 20 قبل وبعد الفحص لرصد التلوث البكتيري. أدخل لوحات المقايسة صفيف المركب الكيميائي في نظام القارئ microplate. احتضان جميع لوحات في 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام وبرنامج نظام القارئ microplate لقراءة تغيير لون صبغ كل 15 دقيقة.ملاحظة: بما أن معظم قارئات اللوحات الدقيقة لا توفر مصدرا للضوء المستمر أثناء الحضانة ، يجب أن تكون الطحالب قادرة على تنفيذ التنفس غير التروفي. 2. تحليل البيانات تصدير البيانات الحركية الخام من قارئ microplate كملفات CSV ، والتي سيتم استخدامها لاحقا كمدخل لحزمة Omnilog Phenotype Microarray (OPM) في R. أضف المعلومات البيولوجية كبيانات تعريفية (على سبيل المثال ، تعيين السلالة ، وسائط النمو ، درجة الحرارة ، وما إلى ذلك). استخدام برنامج تحويل البيانات الحركية PM؛ تحميل ملفات البيانات D5E وتحويلها إلى ملفات OKA باستخدام أسطر الأوامر التالية في برنامج التحليل الحركي PM:تحميل | استيراد (تحديد موقع المجلد من ملفات OKA) | ملء عوامل التصفية | استيراد | إضافة جميع لوحات | غلق.تصدير | اختيار قراءة البيانات (الحركية)، واختيار تنسيق (CSV) (رأس جدولة)،واختيار لوحات (كل لوحة (ملفات فردية)) | تصدير البيانات | أنقذ. لتنفيذ تحليل البيانات Microarray النمط الظاهري (PM) ، استخدم حزمة البرامج OPM21،22 التي تعمل ضمن بيئة البرامج R. الحزمة، البرنامج التعليمي، والوثائق المرجعية متوفرة في: http://www.goeker.org/opm/. في RStudio، واجهة مستخدم رسومية ل R، قم بتثبيت حزمة opm وتبعياتها باستخدام الأوامر التالية:المصدر (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)المكتبة (opm) انتقل إلى الدليل الذي يحتوي على ملفات CSV من البيانات الحركية واستيراد البيانات باستخدام الدالةopm read_:x <-read_opm(",تحويل="grp", تضمين=قائمة ("csv:")) تجميع وتدفير البيانات الحركية باستخدام تقدير المعلمة المنحنية.ل (i في 1:length(x)) {x [i]] <افعل _aggre(x [i]] ، التمهيد = 0 لتر ، النوى = 1 لتر ، الطريقة ="splines" ، الخيارات = set_spline_options("smooth.spline"))x [i]] <-do_disc(x [i]، قطع = FALSE)}#Collection بيانات التعريفبيانات التعريف <-collect_template(".)"البيانات الوصفية $Strain <-c("BLANK"," CC-503")ل (I في 1 :length(x)) {x [i]] <-include_metadata(x [i]] md = بيانات التعريف، استبدال = TRUE)} استخدم الدالة xy_plot لتعيين قياسات التنفس (أو النمو) (المحور ص) كدالة للوقت (المحور س) للوحات 96 بئرا المقايسة.الطباعة (xy_plot(x [[ 1 ]] ، وتشمل =”سلالة” ، واسور .max = FALSE)) تصور البيانات كخريطة حرارية باستخدام الدالة level_plot للسماح بنظرة عامة مقارنة سريعة للبيانات الحركية.level_plot(x، الرئيسي = قائمة()، الألوان = opm_opt(“color.borders”)، لوحة.headers = البيانات الوصفية $سلالة، cex = NULL، strip.fmt = قائمة()، striptext.fmt = قائمة()، legend.sep =” “، الفضاء =”مختبر”، التحيز = 0.7، num.colors = 200 L) استخراج المعلومات البيولوجية الهامة، والمعلمات منحنى، من منحنيات الحركية الخام وتشمل مرحلة تأخر (λ)، ومعدل النمو (μ)، وتنفس الخلية القصوى (A)، والمنطقة تحت منحنى (AUC)21. لتحديد الأيض الإيجابي، استخدم القيم A للتحكم السلبي، والتي تمثل التفاعل اللاأحيائي للصبغة مع الوسط، بالإضافة إلى فارغة من كل لوحة ميكروويل كقيم طرح الخلفية. يتم استخدام الدالة استخراج للحصول على المعلمة A.opm_opt(“curve.param”)بارام <- استخراج (س، as.labels = قائمة ("سلالة"))) 3. تحديد ردود الفعل والجينات المرتبطة المستقلبات الجديدة البحث KEGG (موسوعة كيوتو للجينات والجينوم) (http://www.genome.jp/kegg/) و MetaCyc (http://metacyc.org/) لتحديد أرقام لجنة الإنزيم (ECs) لردود الفعل باستخدام الأيض وجدت من صفائف المركبات الكيميائية23,2423,24. استخدام أرقام EC المحددة كأساس للبحث في موارد الشرح الطحالب المتاحة متعددة مثل معهد الجينوم المشترك (JGI)، Phytozome (http://www.phytozome.net)، والمنشورات استعراض الأقران23،25،26،27. إذا كان الاستعلام لا يعود أي دليل وراثي لعدد المفوضية الأوروبية معينة، وتحديد البروتينات المرتبطة ذات الصلة في الكائنات الحية الأخرى، بدءا من الأنواع الأقرب إلى C. reinhardtii،ثم إجراء بحث القائم على ملف تعريف باستخدام خادم NCBI PSI-BLAST مع الإعدادات الافتراضية واستخدام البروتينات غير زائدة عن الحاجة (nr) في C. reinhardtii (taxid:3055) لتحديد الجينات المرشحة المرتبطة رد الفعل12. تنظيم يدويا PSI-BLAST يضرب مع القيم E من < 0.05 لأهمية لرقم EC بحثت من خلال الاستعلام عن تلك الزيارات BLAST من خلال EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search)، أو InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) خوادم التنبؤ مجال البروتين. لاحظ أن الفحصين الأخيرين هما خطوتان حاسمتان لضمان تحديد النشاط الأنزيمي الصحيح للبروتين. 4. نموذج التحسين والتقييم استخدام أحدث الأدوات COBRA v.3.028في ماتلاب29,30منصة لتنفيذ الخطوات التالية لتحسين النموذج. يمكن تثبيت مربع أدوات COBRA باتباع الخطوات التالية: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . بدلا من ذلك، لاحظ أن COBRA Toolbox يتم تنفيذه أيضا عبر لغات برمجة مفتوحة المصدر أخرى، مثل Python (COBRApy31) ومتاح في: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .بعد تثبيت مربع أدوات COBRA v.3.0 فتح MATLAB وتنفيذ الأمر التالي تهيئة مربع الأدوات:إينتكوبراتولبوكس; إضافة ردود الفعل المحددة مع الجينات المرتبطة بها إلى نموذج التمثيل الغذائي، مثل IRC1080، وذلك باستخدام وظائف COBRA Toolbox addReaction و changeGeneAssociation. انتقل إلى الدليل الذي يحتوي على طراز iRC1080، الذي تم تنزيله من http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 وتنفيذ الأوامر التالية لتحميل النموذج، وإعادة تسميته، وإضافة رد فعل جديد وجين مقترن به.تحميل(‘iRC 1080 .mat’)modelNew = iRC 1080;modelNew = addReaction (modelNew، ‘D-ALA 2’، …{‘d-ala[c]’ ، ‘ATP [ج]’ ، …’D-aladata [ج]’ ، ‘adp [ج]’ ، ‘بي [ج]’ ، …’ح [ج]’ }،[- 2 – 1 1 1 1 1 ]، كاذبة)؛modelNEW = التغييرالاختلاء(modelNew, …’D-ALA 2’،’au.g 14655 _t 1’؛ في بعض الحالات عندما لا يتم إنتاج المستقلب داخل الخلايا ولكن يتم تناوله من الوسط, إضافة ردود فعل النقل للمييضات الجديدة إلى النموذج. تمثل ردود فعل النقل هذه الانتشار السلبي لم المستقلب من الوسط خارج الخلية إلى السيتوسول. بالإضافة إلى ذلك، إضافة تفاعل تبادل اصطناعي المقابلة باستخدام الدالة addExchangeRxn لإدخال أو إخراج المستقلب في الوسط خارج الخلية.modelNew = addReaction (modelNew، ‘CYCPt’، …{‘cycp[e]’،’cycp[c]’ }،[- 1 ]،صحيح”modelNew = addExchangeRxn (modelNew، ‘cycp [ه]’ ،- 1000، 1000 )؛ اختبار سلوك النموذج الناتج الجديد، على سبيل المثال، iBD1106، من خلال إجراء تحليل توازن التدفق (FBA) باستخدام وظيفة optimizeCbModel في ظل ظروف الضوء والظلام لتحقيق أقصى قدر من الكتلة الحيوية كوظيفة الهدف. للنمو الخفيف، حدد الحدود السفلية والعليا لتفاعلات الضوء PRISM الشمسية إلى 646.07 (الحد الأقصى للسعر). للنمو المظلم، تعيين حدود جميع ردود الفعل ضوء PRISM إلى الصفر. استخدم وظيفة الكتلة الحيوية المحددة سابقا10 للنمو في ظل ظروف الظلام والضوء. سيؤدي حل FBA إلى إخراج ناقلين متوافقين مع تدفقات التفاعل (solution.v) وخفض التكلفة (solution.w) ، بالإضافة إلى ناقل واحد مقابل لأسعار ظل الأيض (solution.y).٪محاكاة النمو في ظل ظروف الإضاءة:modelNew = changeRxnBounds (modelNew،{ …٪ ‘PRISM_solar_litho’، …”PRISM_solar_exo” ، …’PRISM_incandescent_ 60 W’ ، …’PRISM_fluorescent_cool_ 215 W’ ، …”PRISM_metal_halide” ، …”PRISM_high_pressure_sodium” ، …”PRISM_growth_room” ، …”PRISM_white_LED” ، …’PRISM_red_LED_array_ 653 نانومتر’ ، …’PRISM_red_LED_ 674 نانومتر’ ، …’PRISM_fluorescent_warm_ 18 W’ ، …”PRISM_design_growth” ، …}, 0, ‘ب’);modelNew = التغييرالجهازة(modelNew, ‘BIOMASS_Chlamy_mixo’);FBAsolutionNew = الأمثلCbModel (modelNew، ‘ماكس’)؛ كرر الخطوة 4.1.4 ل iRC1080 لمقارنة حلول FBA التي تم الحصول عليها ل iBD1106 مع تلك التي تم الحصول عليها ل iRC1080. هناك مجموعة من أساليب COBRA المتاحة التي يمكن استخدامها لمقارنة النماذج (على سبيل المثال، تحليل تقلب التدفق، ودراسات حذف الجينات، وتحليلات المتانة، والتنبؤات انقسام التدفق، FBA، وأخذ العينات، وما إلى ذلك). يمكن العثور على دروس مفصلة في https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. هنا، يتم توفير مثال حيث تتم مقارنة نموذج IRC1080 مع نسخته المكررة، iBD1106، من خلال الحصول على أسعار الظل (حساسية الوظيفة الموضوعية للكتلة الحيوية للتغيرات في متغير النظام) من الأيضات التي تم حسابها في كل نموذج.الحصول على أسعار الظل للم المستقلبات:shadowPrices = الجدول (modelNew.mets، …modelNew.metNames، FBAsolutionNew.y)؛

Representative Results

عرض النمط الظاهري Microarray لنموذج الطحالب الكلاميدوموناس راينهارتيتختبر فحوصات رئيس الوزراء قدرة الطحالب على استخدام مصادر مختلفة من الكربون والنيتروجين والكبريت والفوسفور في الحد الأدنى من المتوسط. في وصف هذه الأساليب، أظهرنا كيف تم استخدام المقايسات PM لتحديد استقلاب الكربون والنيتروجين. تم قياس حركية استخدام الكربون والنيتروجين باستخدام قارئ ميكروبليت. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج PMI. تظهر الحركية الموجزة للوحة المقايسة المختارة من بعد الظهر (PM01 وPM03) في الشكل 1. تعرض “مؤامرات xy” قياسات التنفس بمرور الوقت المرسومة لمقاايسات اللوحات المكونة من 96 بئرا، حيث يمثل المحور ص ومحور س قيم القياسات الخام والوقت، على التوالي. تم تحويل البيانات إلى نمط خريطة الحرارة لتحليل تجميع البيانات الحركية نسبيا. خط أنابيب من شبكة التكرير الأيضية على نطاق الجينوم باستخدام بيانات PM (الشكل 2) يوضح تكامل المقايسات PM عالية الإنتاجية مع الأدلة التجريبية التي تقدمها عمليات البحث الجينومي يمكن توسيع نموذج شبكة التمثيل الغذائي. لتحديد إمكانية استنساخ بيانات PM التي تم الحصول عليها من لوحات PM01 – 04 و PM10 ، تم تحليل انحدار خطي لرسم البيانات من تجربتي تكرار مستقلتين ضد بعضها البعض(الشكل 3). ويبين الشكل 3 أن غالبية البيانات كانت متشابهة تقريبا لأنها تقع على خط 45 درجة، مع وجود عدد قليل فقط من القيم المتطرفة، وكان معامل تحديدها R2 هو 0.9. يتم التحقق من اتساق وقابلية استنساخ التجارب للطحالب من خلال هذه المؤامرة. تحديد الأيض الجديدوحدد فحص رئيس الوزراء 662 مستقلبات في سبع لوحات؛ PM01-PM04 وPM06-PM08، في حين أن الغاز كروماتوغرافيا وقت الطيران (GC-TOF) قد حددت 77 المستقلبات32 (الشكل 4). عند مقارنة هاتين المجموعتين مع 1068 الأيضات التي شكلت في IRC1080, تداخلت ستة فقط الأيض بين المجموعات الثلاث, و 149 تداخلت بين IRC1080 ورئيس الوزراء. هذه النتيجة يدل على أن منصة التنميط الأيضي يمكن أن يكون مصدرا هاما للمعلومات الأيضية الجديدة. كان حمض الخليك مصدر الكربون الوحيد الذي تم اكتشافه في لوحة PM01 ككربون داعم بعد طرح إشارة الخلفية. هذه النتيجة تتفق مع الأدب33 ويظهر خصوصية المقايسات PM. كشفت فحوصات رئيس الوزراء عن مصادر جديدة للكبريت والفوسفور والنيتروجين يمكن أن يستخدمها C. reinhardtii للنمو. وكانت الأيض الكبريت كبريتات، ثيوسلفيت، رباعي الثيرثيونات، وDL-ليبواميد. وكانت مصادر الفوسفور هي ثيوفوسفات، وديثيوفوسفات، وحمض د-3-فوسفو-غليسريك، وسيستامين-إس-فوسفات. وكانت الأيضات مصدر النيتروجين L-الأمينية والأحماض الأمينية D, بما في ذلك الأحماض الأمينية أقل شيوعا; L-homoserine, L-بيروجلوتاميك, ميثيلامين, الإيثيلامين, الإيثانولامين, و D,L-α-أمينية-بوتيريك, و 108 دي الببتيدات وخمسة ثلاثي الببتيدات (الجدول 1). تم البحث في جميع الأيضات التي تم تحديدها حديثا في KEGG و MetaCyc عن ردود الفعل المرتبطة بها وأرقام المفوضية الأوروبية والمسارات. وارتبطت المستقلبات الجديدة 128 مع 49 أرقام المفوضية الأوروبية فريدة من نوعها. ومن بين هذه الأجهزة، ارتبطت 15 شركة من هذه المركبات بالأدلة الجينومية باستخدام خمسة مصادر منها؛ و 15 من هذه المركبات، بما في ذلك المركبات التي تستخدمها في مجال المركبات؛ و 15 من هذه المصادر، بما في ذلك المركبات التي تستخدمها Phytozome الإصدار 10.0.234 JGI الإصدار 435، AUGUSTUS 5.0 ، و 5.210 التعليقات التوضيحية من Manichaikul وآخرون. 36 وKEGG13. تم إدخال الأيض دون أدلة الجينوم في موقع الموارد البروتين العالمي (UniProt، http://www.uniprot.org/)37،38 حيث تم العثور على تسلسلات ذات الصلة في الكائنات الحية الأخرى. تم تحديد التسلسلات المتجانسة في C. reinhardtii عن طريق تشغيل BLAST Iterated الخاص بالموقع (PSI-BLAST، https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) من موقع NCBI بالنظر فقط إلى التسلسلات التي أنتجت محاذاة كبيرة (القيمة E <0.005). تحسين النموذجتمت إضافة ردود الفعل المرتبطة بالميثابات ال 128 الجديدة ، إلى جانب جيناتها المشفرة ، إلى نموذج iRC1080 ، مما وسع الشبكة. النموذج الناتج iBD1106, تمثل 2,444 ردود الفعل, 1,959 الأيض, و 1,106 الجينات (الجدول 2). وكانت ردود الفعل الجديدة 254 وأضاف 20 تفاعلات أكسدة الأحماض الأمينية، 108 دي الببتيد التحلل المائي ردود الفعل، وخمسة ردود فعل التحلل المائي تريببتيد، و 120 ردود فعل النقل، المشفرة من قبل أربعة جينات (Cre02.g096350.t1.3، au.g14655_t1، e_gwW.1.243.1، Cre12.g486350.t1.3). وأضاف ما مجموعه 113 ردود فعل جديدة لحساب التحلل المائي من دي الببتيدات وثلاثي الببتيدات. ويرتبط التحلل المائي للدي الببتيدات وثلاثي الببتيدات مع اثنين من الجينات، واحدة لدي الببتيدات (Cre02.g078650.t1.3) وواحدة للببتيدات الثلاثية (Cre16.g675350.t1.3). وفيما يتعلق بمصادر الفوسفور، أضيف تفاعل للتحلل المائي للسيستامين – S – الفوسفات إلى السيستامين والفوسفات المرتبطة JLM_162926 الجينية. أداة WoLF PSORT39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) والنتائج التي أبلغ عنها غامساري وآخرون. 35 تم تطبيقها للحصول على مواصفات المقصورات الخلوية حيث تحدث ردود الفعل الجديدة. من خلال تحليل تسلسل البروتين المرتبطة ردود الفعل الجديدة، وتوقع WoLF PSORT السيتوسول كمقصورة الخلوية لردود الفعل. قد يحتوي نموذج التمثيل الغذائي المتولد على فجوات عندما تكون المعلومات الكيميائية الحيوية غير كاملة. في مثل هذه الحالات، يتم استخدام gapFind، وهو أمر COBRA. وهو يسرد الثغرات الجذرية ويسمح بتحديد الثغرات الجديدة في النموذج الجديد. ويشار إلى الأيض التي لا يمكن إنتاجها في نموذج الأيض والفجوات الجذرية40،41. تحليل الفجوة الجذرية أشار إلى أن كلا من IRC1080 و iBD1106 نماذج تحتوي على نفس الفجوات 91. وهذا يدل على أن إضافة الأيض الجديدة وردود الفعل المرتبطة بها لم يقدم أي فجوات الجذر إضافية. وتجدر الإشارة إلى أن طريقة phenotyping المستخدمة في هذا البروتوكول لا تسد الفجوات الجذرية، لأن الأيضات الفجوة الجذرية الأصلية تفتقر إلى آليات النقل أو الإنتاج، والتي لم تعالج في المقايسات phenotyping. تم إجراء تحليل توازن التدفق لاختبار السلوك الأيضي ل iBD1106 في ظل ظروف خفيفة ومظلمة؛ (لا خلات) و (مع خلات)، على التوالي. تزيد الخوارزمية من تفاعلات سلائف الكتلة الحيوية لوظيفة موضوعية (نمو الكتلة الحيوية). لتقييم مشاركة كل مستقلب إلى وظيفة الهدف المحدد, تم حساب “أسعار الظل” لجميع الأيض. التغير في الوظيفة الموضوعية المتعلقة بتغيرات التدفق للم المستقلب يحدد سعر الظل للم المستقلب30،42. ويمكن تحديد الإشارة إلى ما إذا كان المستقلب “زائدا” أو “يحد” من الوظيفة الموضوعية من خلال تحليل الأسعار الظلية، مثل إنتاج الكتلة الحيوية. القيم السلبية أو الإيجابية سعر الظل تكشف الأيض التي، عند إضافة، سوف يقلل أو زيادة وظيفة الهدف. صفر قيم أسعار الظل تكشف الأيض التي لن تؤثر على وظيفة الهدف. وتبين مقارنة أسعار الظل بين iBD1106 و iRC1080 في الشكل 5 أنه لا يلاحظ حدوث تغير كبير بالنسبة لمعظم الأيضات؛ على الرغم من ذلك، تم العثور على اختلافات في 105 و 70 حالة في ظل ظروف النمو الخفيفة والداكنة، على التوالي. ويتضمن الجدول 4 أمثلة على هذه الأيضات. الشكل 1: فينوتبيك microarray التنميط من C. reinhardtii. التنفس XY-المؤامرات والمؤامرات مستوى من PM01 (مصادر الكربون; A، C) وPM03 (مصادر النيتروجين؛ B, D) تظهر لوحات المقايسة. الرقم هو صفيف 8×12 حيث تمثل كل خلية لوحة جيدة ، وبالتالي ، بيئة مستقلب أو نمو معينة. داخل كل خلية أو تمثيل جيد، تمثل المنحنيات تحويل الصبغة عن طريق التخفيض (المحور ص) كدالة للوقت (المحور س). تظهر منحنيات التنفس PM من CC-503 والآبار الفارغة في كل خلية ويشار إليها بالألوان (يمثل لون البط البري آبار فارغة ويمثل اللون الأرجواني CC-503). يمثل مخطط المستوى كل منحنى تنفس كخط أفقي رفيع يتغير لونه (أو يبقى دون تغيير) بمرور الوقت. تغييرات لون خريطة الحرارة هي من الأصفر الفاتح (حدث القليل من التنفس أو لا) إلى البرتقالي الداكن أو البني (حدث تنفس كبير). يتم عرض الأيض المستخدمة من قبل C. reinhardtii (CC-503) ولوحات فارغة. هذا الرقم هو من عمل نشر سابقا من قبل Chaiboonchoe وآخرون. 12الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.  الشكل 2: الجينوم على نطاق خط أنابيب تحسين شبكة التمثيل الغذائي باستخدام بيانات PM. بعد إجراء اختبارات مركبة جديدة إيجابية في فحص PM ، يتم تحديد رقم لجنة الإنزيم (EC) ، والتفاعل ، والمسار من قواعد البيانات المتاحة ، على سبيل المثال ، KEGG و MetaCyc. ثم يتم استخراج الأدلة الجينومية من موارد الجينوم والشروح عندما تكون متاحة وتشكل حلقة وصل بين النمط الجيني والنمط الظاهري. عندما لا تتوفر الأدلة الجينومية المباشرة، يتم تحديد تسلسل البروتين من أرقام المفوضية الأوروبية، ويتم تحديد الأدلة الجينية عن طريق PSI-Blast. ثم يتم صقل شبكة التمثيل الغذائي التي أعيد بناؤها على أساس المركبات التي تم تحديدها حديثا ، ولكن فقط بعد خطوة مراقبة الجودة التي تنطوي على الاستعلام عن مجالات البروتين باستخدام قواعد البيانات ذات الصلة. وقد تم تعديل هذا الرقم من أعمال نشرت سابقا من قبل Chaiboonchoe وآخرون. 12الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.  الشكل 3: استنساخ اختبارات PM. تم جمع قيم مؤشر مديري المشتريات على مدى فترة 168 ساعة، وتم رسم الحد الأقصى لقيم مؤشر مديري المشتريات لدرايتين متماثلتين. يمثل كل محور قيم مؤشر مديري المشتريات القصوى لكل دراسة (محور س هو دراسة واحدة متماثلة والمحور ص آخر). القيم المستنسخة متساوية البعد عن كل محور. تمثل كل نقطة قيمة الحد الأقصى واحد. تم تنفيذ الانحدار الخطي بواسطة برنامج جدول بيانات، ويظهر معامل التحديد الناتج (R2). وقد تم تعديل هذا الرقم من أعمال نشرت سابقا من قبل Chaiboonchoe وآخرون. 12الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.  الشكل 4: رسم تخطيطي Venn من الأيض. يعدد الرسم البياني Venn الأيضات التي حددتها لوحات PM ، ونموذج الأيض iRC1080 ، ووقت كروماتوغرافيا الغاز للتجارب (GC-TOF). كل دائرة تشير إلى العدد الإجمالي من الأيض الموجودة في كل طريقة من طرق الدراسة. وفي الوقت نفسه، تمثل المناطق المتداخلة عدد الأيضات المشتركة بين تلك الأساليب. نموذج الأيض IRC1080 يحتوي على ما مجموعه 1,068 المستقلبات فريدة من نوعها. حددت GC-TOF ما مجموعه 77 المستقلبات32, في حين أن هناك ما مجموعه 662 الأيض التي تم تحديدها باستخدام لوحات PM. هذا الرقم مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبوونتشو وآخرون. 12الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: أسعار الظل من الأيض في IRC1080 و IBD1106 في ظل ظروف مختلفة لتحقيق أقصى قدر من الكتلة الحيوية. كل دائرة على “مؤامرات الرادار” يتوافق مع قيمة سعر الظل، في حين أن كل سطر يمتد من وسط مؤامرة يشير إلى المستقلب. (أ) أسعار الظل والسلوكيات الأيضية من iRC1080 و IBD1106 في ظل حالة نمو خفيفة؛ (ب) ، والسلوكيات الأيضية المختلفة من IRC1080 وIBD1106 في ظل حالة نمو مظلمة. هذا الرقم مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبوونتشو وآخرون. 12الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. البيولوجيا الكيميائية المفوضية الأوروبية* الشرح الجيني PSI-انفجار سيستامين-س-فوسفات 3.1.3.1 JLM_1629261،2،3،4 تتراثيونات 1.8.2.2 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 1.8.5.2 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة د ألانين 1.4.1.1 XP_001700222.1 1.5.1.22 فشل QC اليدوي 2.1.2.7 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 2.3.2.10 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 2.3.2.14 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 2.3.2.16 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 2.3.2.17 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 2.3.2.18 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 2.6.1.21 فشل QC اليدوي 3.4.13.22 XP_001698572.1، XP_001693532.1، XP_001701890.1، XP_001700930.1 3.4.16.4 Chlre2_kg.scaffold_ 140000391،2،3 3.4.17.8 فشل QC اليدوي 3.4.17.13 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 3.4.17.14 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 4.5.1.2 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 6.1.1.13 فشل QC اليدوي 6.1.2.1 فشل QC اليدوي 6.3.2.4 au.g14655_t11،2،3 6.3.2.10 فشل QC اليدوي 6.3.2.16 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 6.3.2.35 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة د-الهليونين 1.4.5.1 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 3.1.1.96 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 2.3.1.36 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 1.4.99.1 XP_001692123.1 3.5.1.77 e_gwW.1.243.11،2 3.5.1.81 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 5.1.1.10 فشل QC اليدوي حمض الأسبارتيك د 6.3.1.12 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 د-غلوتاميك حمض 1.4.3.7 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 1.4.3.3 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة د-ليسين 5.4.3.4 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 6.3.2.37 فشل QC اليدوي د-سيرين 2.7.11.8 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 2.7.11.17 Cre12.g486350.t1.31،2،3،4 3.4.21.78 فشل QC اليدوي 3.4.21.104 فشل QC اليدوي 4.3.1.18 g6244.t14 فشل QC اليدوي 6.3.2.35 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 6.3.3.5 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 د-فالين 1.21.3.1 فشل QC اليدوي 6.3.2.26 فشل QC اليدوي 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 حمض إل بيروغلوتاميك ثيوفوسفات ديثيوفوسفات الإيثيلامين 6.3.1.6 D،L-A-أمينو-بوتريك حمض 2.1.1.49 قيمة إلكترونية غير ذات قيمة 1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35 دي الببتيد 3.4.13.18 Cre02.g078650.t1.31 ثلاثي الببتيد 3.4.11.4 Cre16.g675350.t1.31 الجدول 1: قائمة من الأيض استخدام الركيزة الإيجابية المحددة (C, P, S, N) غير موجودة في نموذج التمثيل الغذائي IRC1080.   *لم يتم تضمين رد الفعل إذا لم يتم التعرف على أي جين.  1 Phytozome الإصدار 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   2 JGI الإصدار 4 35.  3 أوغسطس الإصدار 510.  4 كي جي جي (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 JGI الإصدار 3.136.  هذا الجدول مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبونشو وآخرون. 12 نموذج ردود الفعل الايضات جينات iRC1080 2,191 1,706 1,086 iBD1106 2,445 1,959 1,106 الجدول 2: محتويات IRC1080 و iBD1106.  هذا الجدول مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبونشو وآخرون. 12 فئة أو فئة ردود الفعل عدد ردود الفعل الأحماض الأمينية 20 ديببتيدات 108 تريببتيدات 5 رد فعل النقل 120 الجدول 3:ملخص ردود الفعل الجديدة في iBD1106. هذا الجدول مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبونشو وآخرون. 12 حالة النمو المستقلب اسم iRC1080 iBD1106 4r5au 4-(1-D-ريبيتيلامينو)-5-أمينوراسيل 0 0.168 5بربو 5-أمينو-6-(5′-فوسفوريبيلامينو)uracil -0.009 0.158 ضوء pa1819Z18111Z 1-(9Z)-أوكتاديسينويل،2-(11Z)-أوكتاديسينويل-سين-غليسيرول3-فوسفات -0.009 -0.65 داكن 4بوت 4-أمينوبوتانواتي 0.18 -0.05 الجدول 4: مثال على أسعار الظل الكبيرة ل iRC1080 و iBD1106. هذا الجدول مأخوذ من أعمال نشرت سابقا لشيبونشو وآخرون. 12

Discussion

وصف phenotyping الأيضية من الطحالب الخضراء، C. reinhardtii، هنا باستخدام لوحات عالية الإنتاجية PM المقايسة ومؤشر مديري المشتريات غير المعدلة. واستخدمت المقايسات لما مجموعه 190 مصدرا للكربون (PM01 وPM02)، و 95 مصدرا للنيتروجين (PM03)، و 59 مصدرا للفوسفور، و 35 مصدرا للكبريت (PM04)، إلى جانب مصادر النيتروجين الببتيد (PM06-08). ولوحظ تنفس إيجابي ل 148 من العناصر الغذائية (تقييم إيجابي واحد لاستخدام المصادر C، وأربعة مقايسات إيجابية لكل استخدام من مصادر S وP، و139 مقايسة إيجابية لاستخدام المصدر N). لا ينبغي إضافة المكونات الركيزية أو المواد المغذية (الكربون أو النيتروجين أو الفوسفور أو الكبريت) إلى الوسيط المحدد عند تطبيقها على لوحات PM الدقيقة ذات الصلة التي تختبر لكل من هذه المصادر.

الطريقة الموضحة هنا فعالة لتميز الأنماط الظاهرية للطحالب الدقيقة الأيضية التي يمكن استخدامها لتوسيع نماذج شبكة التمثيل الغذائي الحالية أو توجيه إعادة بناء نماذج جديدة. علاوة على ذلك ، بما أن المتطلبات الغذائية لمعظم الطحالب الدقيقة غير معروفة ، يمكن استخدام هذه المنصة لتحديد هذه بسرعة. نيلسون وآخرون. 43 قد طبقت بنجاح هذه الأساليب لتحديد المركبات الجديدة التي تدعم نمو الكلورويديوم الطحالب الدقيقة sp. UTEX 3007 واستخدمت المعلومات التي تم الحصول عليها لتحديد الأيض دخول الأنواع, التي, على عكس الكلاميدوموناس, وتشمل 40 مصادر الكربون المختلفة.

أحد القيود الرئيسية لرئيس الوزراء للتنميط الطحالب الدقيقة هو أن مؤشر مديري المشتريات ليس لديه إضاءة في غرفة الحضانة ، والطحالب الدقيقة تحتاج إلى أن تكون قادرة على تنفيذ عملية التمثيل الغذائي غير التروفيزيضي. يمكن أن يؤثر غياب الضوء على تفسير النماذج التي تتضمن الضوء لحساب التدفقات الأيضية. وقد تطورت أزواج الجينات مع وظائف التنسيق لتشكل محاور شبكة التمثيل الغذائي، ويمكن التمييز بين مراكز الشبكة التمثيل الضوئي وغير التمثيل الضوئي44. وبشكل عام، سيتم استبعاد محاور الشبكة التركيبية الضوئية (أي العقد المتصلة للغاية في النموذج) من النماذج غير التروتروفية. ولأغراض عملية، ينبغي أن تغفل نمذجة التغاير في الأنواع المخلطة ردود الفعل المعروفة بالضوء وأن تراعي الاختلافات في توازن الطاقة بين الظروف. وهكذا، النمذجة الأيض الخفيفة تعتمد ومستقلة الضوء هو الممارسة القياسية في النمذجة الأيضية الكلاميدوموناس6،45.

ومن المعروف أن بعض الطحالب الخضراء ، مثل Trebouxiophytes ، لاستيعاب مجموعة متنوعة من جزيئات الكربون للنمو ، ويعتقد أن هذا قد نشأ من تاريخها التطوري الطويل كأعضاء في الحزازات46. في حين الكلوروفيس مثل الكلاميدوموناس يمكن استخدام خلات للنمو, البني البحرية microalga تيسوخريسي lutea, المعروف لقدرته على إنتاج تجاريا سلسلة طويلة جدا الأحماض الدهنية غير المشبعة (VLC-PUFAs), لا يمكن استخدام خلات ولكن يمكن استخدام الجلسرين للنمو47. وقد تم تحقيق تركيز الكتلة الحيوية لأكثر من 100 غرام لتر-1 وزن الخلايا الجافة مع شلوريلا مع إضافة الأمثل من مصادر الكربون العضوي في وضع دفعة تغذية48. علاوة على ذلك ، يمكن لإضافة السكر إلى Chlorellavulgaris رفع عزله منثانيأكسيد الكربون، وبالتالي توفير فائدة مضافة خلال النمو الضوئي49. معظم الطحالب الدقيقة غير المتجانسة يمكن أن تنمو أيضا mixotrophically، ولكن وقد ثبت أن الكلوروفيت كروموكلوريس zofingiensis لاغلاق التمثيل الضوئي عند إضافة السكر50.

دياتومات، التي تنتمي إلى شعبة Bacillariophyta، هي مجموعة رئيسية من العوالق النباتية. على الرغم من أن معظم الدياتومات يمكن أن تنمو فقط photoautotrophically، يمكن زراعة بعضها بشكل مختلط أو غير استوائي51. على سبيل المثال، تم العثور على الجلسرين لدعم النمو في ضوء في غياب CO2 في بعض دياتومات، بما في ذلك نموذج الأنواع Phaeodactylum tricornutum52. أيضا، بعض الدياتومات القاعية مثل نيتسكيا linearis يمكن أن تنمو على الكربوهيدرات في الظلام53. ومن المرجح أن تمتد المقايسات PM إلى دياتومات وغيرها من مجموعات الطحالب عن طريق استكمال مصادر الكربون العضوية المناسبة لتمكين الخلايا من النمو غير الاستوائي، ويمكن أيضا أن تستخدم استراتيجية ضمور مختلط للطحالب الذاتية ملزمة توفير إمدادات الضوء المطلوبة الحد الأدنى.

لتقييم إمكانية إعادة إنتاج البيانات، يوصى بشدة بإجراء فحوصات مكررة لجميع اللوحات. يمكن اعتبار المقايسة إيجابية فقط إذا كان الامتصاص (قيمة PMI) إيجابيا بعد الطرح من التحكم السلبي والآبار الفارغة المعنية. هذا الوصف ، في وجود المركب المختبر ، هو انعكاس لرد فعل الصبغة اللاأحيائي مع الوسط.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد قدم الدعم الرئيسي لهذا العمل مركز جامعة نيويورك لعلم الجينوم وبيولوجيا النظم (CGSB)، بتمويل من تمكين في إطار منحة معهد أبوظبي للبحوث بجامعة نيويورك (73 71210 CGSB9) وصناديق أبحاث كلية أبوظبي بجامعة نيويورك (AD060). و. ف. بالإضافة إلى ذلك بدعم من برنامج مائة موهبة في جامعة تشجيانغ. نشكر أشيش جايسوال على المساعدة في تسجيل الفيديو. نشكر هونغ تساى على توليد بيانات النمط الظاهري الأيضي.

Materials

Ampicillin VWR 97062-796
Biolog assay plates [ PM01-08] Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog Instrument Biolog, Hayward, CA, USA
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503 Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA. Regents of the University of Minnesota
Kanamycin VWR 0408-EU-10G
Tetrazolium Violet Dye “D” Biolog, Hayward, CA, USA
Timentin GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd 42010012-2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oberhardt, M. A., Palsson, B. &. #. 2. 1. 6. ;., Papin, J. A. J. M. Applications of genome-scale metabolic reconstructions. Molecular Systems Biology. 5 (1), 320 (2009).
  2. Schmidt, B. J., Lin-Schmidt, X., Chamberlin, A., Salehi-Ashtiani, K., Papin, J. A. Metabolic systems analysis to advance algal biotechnology. Biotechnology Journal. 5 (7), 660-670 (2010).
  3. Koskimaki, J. E., Blazier, A. S., Clarens, A. F., Papin, J. A. J. I. B. Computational models of algae metabolism for industrial applications. Industrial Biotechnology. 9 (4), 185-195 (2013).
  4. Koussa, J., Chaiboonchoe, A., Salehi-Ashtiani, K. J. B. Computational approaches for microalgal biofuel optimization: a review. BioMed Research. 2014, 649453 (2014).
  5. Nelson, D. R., et al. Large-scale genome sequencing reveals the driving forces of viruses in microalgal evolution. Cell Host & Microbe. 29 (2), 250-266 (2021).
  6. Shene, C., Asenjo, J. A., Chisti, Y. Metabolic modelling and simulation of the light and dark metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal. 96 (5), 1076-1088 (2018).
  7. Tibocha-Bonilla, J. D., Zuñiga, C., Godoy-Silva, R. D., Zengler, K. Advances in metabolic modeling of oleaginous microalgae. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 241 (2018).
  8. Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318 (5848), 245-250 (2007).
  9. May, P., Christian, J. -. O., Kempa, S., Walther, D. J. B. G. ChlamyCyc: an integrative systems biology database and web-portal for Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 10 (1), 209 (2009).
  10. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), (2011).
  11. de Oliveira Dal’Molin, C. G., Quek, L. -. E., Palfreyman, R. W., Nielsen, L. K. AlgaGEM – a genome-scale metabolic reconstruction of algae based on the Chlamydomonas reinhardtii genome. BMC Genomics. 12 (5), (2011).
  12. Chaiboonchoe, A., et al. Microalgal metabolic network model refinement through high-throughput functional metabolic profiling. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, 68 (2014).
  13. Kanehisa, M., et al. Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic Acids Research. 42 (1), 199-205 (2014).
  14. Zuñiga, C., et al. Genome-scale metabolic model for the green alga Chlorella vulgaris UTEX 395 accurately predicts phenotypes under autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic growth conditions. Plant Physiology. 172 (1), 589-602 (2016).
  15. Bochner, B. R. New technologies to assess genotype-phenotype relationships. Nature Reviews Genetics. 4 (4), 309-314 (2003).
  16. Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 33 (1), 191-205 (2009).
  17. Bochner, B. R., Gadzinski, P., Panomitros, E. Phenotype microarrays for high-throughput phenotypic testing and assay of gene function. Genome Research. 11 (7), 1246-1255 (2001).
  18. Bartell, J. A., Yen, P., Varga, J. J., Goldberg, J. B., Papin, J. A. Comparative metabolic systems analysis of pathogenic Burkholderia. Journal of Bacteriology. 196 (2), 210-226 (2014).
  19. Gorman, D. S., Levine, R. J. P. o. t. N. A. o. S. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. PNAS. 54 (6), 1665-1669 (1965).
  20. Smith, A. C., Hussey, M. A. Gram stain protocols. American Society for Microbiology. , 1-9 (2005).
  21. Vaas, L. A. I., et al. opm: an R package for analysing OmniLog phenotype microarray data. Bioinformatics. 29 (14), 1823-1824 (2013).
  22. Vaas, L. A. I., Sikorski, J., Michael, V., Göker, M., Klenk, H. -. P. Visualization and Curve-Parameter Estimation Strategies for Efficient Exploration of Phenotype Microarray Kinetics. PLoS ONE. 7 (4), 34846 (2012).
  23. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes-a 2019 update. Nucleic Acids Research. 48 (1), 445-453 (2020).
  24. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Ishiguro-Watanabe, M., Tanabe, M. KEGG: integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Research. , (2020).
  25. Lopez, D., Casero, D., Cokus, S. J., Merchant, S. S., Pellegrini, M. Algal Functional Annotation Tool: a web-based analysis suite to functionally interpret large gene lists using integrated annotation and expression data. BMC Bioinformatics. 12 (1), 282 (2011).
  26. Caspi, R., et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes. Nucleic Acids Research. 46, 633-639 (2018).
  27. Sahoo, S., et al. dEMBF v2. 0: An Updated Database of Enzymes for Microalgal Biofuel Feedstock. Plant and Cell Physiology. 61 (5), 1019-1024 (2020).
  28. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 14 (3), 639-702 (2019).
  29. Heirendt, L., et al. Creation and analysis of biochemical constraint-based models using the COBRA Toolbox v. 3.0. Nature Protocols. 1, (2019).
  30. Orth, J. D., Thiele, I., Palsson, B. &. #. 2. 1. 6. ;. What is flux balance analysis. Nature Biotechnology. 28 (3), 245 (2010).
  31. Ebrahim, A., Lerman, J. A., Palsson, B. O., Hyduke, D. R. COBRApy: constraints-based reconstruction and analysis for python. BMC Systems Biology. 7 (1), 74 (2013).
  32. Bölling, C., Fiehn, O. Metabolite profiling of Chlamydomonas reinhardtii under nutrient deprivation. Plant Physiology. 139 (4), 1995-2005 (2005).
  33. Harris, E. H. . The Chlamydomonas sourcebook: introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).
  34. Goodstein, D. M., et al. Phytozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic Acids Research. 40, 1178-1186 (2012).
  35. Ghamsari, L., et al. Genome-wide functional annotation and structural verification of metabolic ORFeome of Chlamydomonas reinhardtii. BMC Genomics. 12 (1), 4 (2011).
  36. Manichaikul, A., et al. Metabolic network analysis integrated with transcript verification for sequenced genomes. Nature Methods. 6 (8), 589-592 (2009).
  37. Apweiler, R., et al. UniProt: the Universal Protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 32, 115-119 (2004).
  38. Consortium, T. U. Activities at the universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Research. 42 (11), 7486-7486 (2014).
  39. Horton, P., et al. PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Research. 35, 585-587 (2007).
  40. Becker, S. A., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox. Nature Protocols. 2 (3), 727-738 (2007).
  41. Schellenberger, J., et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox v2.0. Nature Protocols. 6 (9), 1290 (2011).
  42. Varma, A., Boesch, B. W., Palsson, B. O. Stoichiometric interpretation of Escherichia coli glucose catabolism under various oxygenation rates. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2465-2473 (1993).
  43. Nelson, D. R., et al. The genome and phenome of the green alga Chloroidium sp. UTEX 3007 reveal adaptive traits for desert acclimatization. eLife. , 25783 (2017).
  44. Chaiboonchoe, A., et al. Systems level analysis of the Chlamydomonas reinhardtii metabolic network reveals variability in evolutionary co-conservation. Molecular BioSystems. 12 (8), 2394-2407 (2016).
  45. Chang, R. L., et al. Metabolic network reconstruction of Chlamydomonas offers insight into light-driven algal metabolism. Molecular Systems Biology. 7 (1), 518 (2011).
  46. Rajendran, A., Hu, B. Mycoalgae biofilm: development of a novel platform technology using algae and fungal cultures. Biotechnology for Biofuels. 9 (1), 112 (2016).
  47. Hu, H., et al. Effect of cultivation mode on the production of docosahexaenoic acid by Tisochrysis lutea. AMB Express. 8 (1), 50 (2018).
  48. Bumbak, F., Cook, S., Zachleder, V., Hauser, S., Kovar, K. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations. Applied Microbiology and Biotechnology. 91 (1), 31 (2011).
  49. Fu, W., et al. Sugar-stimulated CO2 sequestration by the green microalga Chlorella vulgaris. Science of the Total Environment. 654, 275-283 (2019).
  50. Roth, M. S., et al. Regulation of oxygenic photosynthesis during trophic transitions in the green alga Chromochloris zofingiensis. The Plant Cell. , (2019).
  51. Villanova, V., et al. Investigating mixotrophic metabolism in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1728), 20160404 (2017).
  52. Cerón-García, M., et al. Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on fructose and glycerol in fed-batch and semi-continuous modes. Bioresource Technology. 147, 569-576 (2013).
  53. Tuchman, N. C., Schollett, M. A., Rier, S. T., Geddes, P. . Advances in Algal Biology: A Commemoration of the Work of Rex Lowe. , 167-177 (2006).

Tags

Metabolic ProfilingMicroalgaePhenotype Micro-arrayHigh-throughputChlamydomonas ReinhardtiiMetabolic Network ModelsTetrazolium-based Redox DyeCarbon SourcesNitrogen SourcesPhosphorusSulfurPeptide Nitrogen SourcesHeterotrophic RespirationMicroplate Reader

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Alzahmi, A., Daakour, S., El Assal, D. C., Dohai, B. S., Chaiboonchoe, A., Fu, W., Nelson, D. R., Mystikou, A., Salehi-Ashtiani, K. High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae. J. Vis. Exp. (178), e61913, doi:10.3791/61913 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image