Fekal (mikro) RNA İzolasyonu
Summary
Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA’yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA’yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.
Abstract
RNA’nın bağırsak lümeninde ve hayvanlarda ve insanlarda dışkıda var olduğu netleşiyor. Aşağıda açıklanan protokol, mikroRNA’lar da dahil olmak üzere toplam RNA’yı hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden izole eder. Amaç, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için toplam RNA’yı yüksek saflık ve miktarda izole etmektir. Bu optimize edilmiş protokolün miRNA izolasyonundaki avantajları, yüksek oranda saflaştırılmış RNA ürünlerini tarif edilen ek yıkama adımlarıyla izole etme yetenekleri, numunenin yeniden süspansiyonunda geliştirilmiş bir yöntemle elde edilen RNA miktarının artması ve önemli dekontaminasyon ipuçlarıdır. Bir sınırlama, 200 mg’dan daha büyük numunenin işlenememesi ve saflaştırılamamasıdır, çünkü bu numune büyüklükleri interfazın net oluşumunda bir zorluğa neden olacaktır. Sonuç olarak, büyük örneklem büyüklüğü, protokolde açıklandığı gibi ekstrakte edilecek sulu fazı, sonunda izole edilen RNA’nın kalitesini etkileyen organik maddelerle kirletebilir. Bununla birlikte, 200 mg’a kadar bir numuneden RNA izolatları, aşağı akış analizlerinin çoğu için yeterlidir.
Introduction
Hücre dışı RNA, birçok biyolojik sürece aracılık eden önemli bir faktör olarak kabul edilmektedir1. Dışkıda hücre dışı RNA ilk olarak 2008 yılında kolon kanseri ve aktif ülseratif kolit2 için bir belirteç olarak bildirilmiştir ve yakın zamanda bağırsak lümeninin ve dışkının normal bir bileşeni olarak ortaya çıkmıştır ve konakçı-mikrop iletişimine aracılık eder 3,4,5. Bu RNA izolasyon protokolünün amacı, hayvan ve insan deneklerden toplanan dışkı örneklerinden yüksek kaliteli hücre dışı RNA’yı çıkarmaktır. Protokol, ticari bir miRNA İzolasyon Kitinden uyarlandı. Elde edilen RNA, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için kullanılır. Protokol, hayvanların ve insanların dışkısında bulunan RNA’nın miktarını ve kalitesini en üst düzeye çıkarmak için birkaç önemli ve yararlı ipucu içerir. RNA (mikroRNA dahil) izolasyonunun bu yöntemini geliştirmenin ve optimize etmenin nedeni, dışkıdaki mikrobiyal RNA’yı azaltmak, araştırma çalışmalarındaki değişkenleri sınırlamak ve çeşitli kafa karıştırıcı faktörleri ve kontaminasyon kaynaklarını hesaba katmadan bağırsaktaki RNA bileşimini analiz etmektir. Not olarak, bu RNA izolasyonu, RNA’nın canlı hücreden ve canlı mikroplardan (hücresel RNA) salınımını en aza indirir. Bağırsak hücreleri tarafından salınan veya gıda alımı yoluyla edinilen hücre dışı RNA’lara odaklanır. Temel olarak, bu yöntem mikrobiyal transkriptomun araştırıldığı çalışmalar için uygun değildir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İzolasyon sırasında RNaz kontaminasyonunu önlemek için RNase içermeyen tekniğin kullanılması önemlidir7. Santrifüjleme ve kompakt bir interfazın oluşumundan sonra, sulu fazı geri kazanırken interfaz, alt faz ve sulu fazın üstünde yüzen partikül kirleticisinden kaçınmak önemlidir. Ek olarak, optimize edilmiş kalite için filtre membranındaki kirleticileri ortadan kaldırmak üzere 500 μL ve 250 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 ile iki yıkama adımı eklenir. Ayrıca, 200 mg’da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Harvard Tıp Fakültesi’ndeki Biyopolimerler Tesisi’nden biyoanalizör için teknik yardım aldık. Bu çalışma Ulusal Multipl Skleroz Derneği araştırma hibesi RG-1707-28516 (H.L.W. ve S.L.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
References
- Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
- Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
- Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
- Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
- Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
- Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
- Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
- Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn’s disease biomarkers. Crohn’s & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
- Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
- Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
- Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
- Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
- Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
- Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
