Summary

Aislamiento de (micro) ARN fecal

Published: October 28, 2020
doi:

Summary

Este protocolo aísla ARN total de alta calidad de muestras fecales de sujetos animales y humanos. Se utiliza un kit de aislamiento de miARN comercial con una adaptación significativa para aislar ARN puro con cantidad y calidad optimizadas. Los aislados de ARN son buenos para la mayoría de los ensayos de ARN aguas abajo, como la secuenciación, la micromatriz y la RT-PCR.

Abstract

Cada vez está más claro que el ARN existe en la luz intestinal y las heces en animales y humanos. El protocolo descrito a continuación aísla el ARN total, incluidos los microARN, de muestras fecales de sujetos animales y humanos. El objetivo es aislar el ARN total con alta pureza y cantidad para análisis posteriores como secuenciación de ARN, RT-PCR y microarray. Las ventajas de este protocolo optimizado en el aislamiento de miARN son la capacidad de aislar productos de ARN altamente purificados con pasos de lavado adicionales descritos, una mayor cantidad de ARN obtenida con un método mejorado en la resuspensión de la muestra y consejos importantes de descontaminación. Una limitación es la incapacidad de procesar y purificar muestras más grandes de más de 200 mg, ya que estos tamaños de muestra causarían una dificultad en la formación clara de la interfase. En consecuencia, el gran tamaño de la muestra puede contaminar la fase acuosa a extraer como se describe en el protocolo con materias orgánicas que afectan la calidad del ARN aislado al final. Sin embargo, los aislados de ARN de una muestra de hasta 200 mg son suficientes para la mayoría de los análisis posteriores.

Introduction

El ARN extracelular está siendo reconocido como un factor significativo que media muchos procesos biológicos1. El ARN extracelular en las heces fue reportado por primera vez en 2008 como un marcador de cáncer de colon y colitis ulcerosa activa2, y recientemente se reveló como un componente normal de la luz intestinal y las heces y media las comunicaciones huésped-microbio 3,4,5. El propósito de este protocolo de aislamiento de ARN es extraer ARN extracelular de alta calidad de muestras fecales recolectadas de sujetos animales y humanos. El protocolo fue adaptado de un kit de aislamiento de miARN comercial. El ARN adquirido se utiliza para análisis posteriores como secuenciación de ARN, RT-PCR y microarrays. El protocolo incluye varios consejos importantes y útiles para maximizar la cantidad y calidad del ARN que se encuentra en las heces de animales y humanos. La razón para desarrollar y optimizar este método de aislamiento de ARN (incluido el microARN) es disminuir el ARN microbiano en las heces, limitar las variables en los estudios de investigación y analizar la composición del ARN en el intestino sin tener en cuenta varios factores de confusión y fuentes de contaminación. Cabe destacar que este aislamiento de ARN minimiza la liberación de ARN de células vivas y microbios vivos (ARN celular). Se centra en los ARN extracelulares que han sido liberados por las células intestinales o han sido adquiridos a través de la ingesta de alimentos. Principalmente, este método no es adecuado para estudios donde se investiga el transcriptoma microbiano.

Protocol

Todos los métodos que involucran animales de investigación descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital Brigham and Women’s, Escuela de Medicina de Harvard. Todos los métodos que involucran sujetos de investigación humanos descritos aquí están de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Investigación Humana de Partners. 1. Recogida de muestras fecales Autoclave o prepa…

Representative Results

Se aislaron ARN representativos de muestras fecales de ratón de 50 mg (2 gránulos fecales de ratón) y 100 mg de muestras de heces humanas respectivamente y se eluyeron en agua libre de nucleasas de 50 μL. El análisis espectrofotómetro de la concentración sugiere que se aisló una cantidad total de 49 μg y 16 μg de ARN respectivamente (Tabla 1). La pureza del ARN fue alta como lo indica una relación A260 / A280 de ~ 2.0 y una relación A260 / A230 de ~ 1.8 (Tabla 1). Como se inf…

Discussion

Es importante utilizar la técnica libre de RNasa para prevenir la contaminación por RNasa durante el aislamiento7. Después de la centrifugación y la formación de una interfase compacta, es clave evitar la interfase, la fase inferior y el contaminante de partículas flotando en la parte superior de la fase acuosa al recuperar la fase acuosa. Además, se agregan dos pasos de lavado con solución de lavado 2/3 de 500 μL y 250 μL para eliminar los contaminantes en la membrana del filtro y optim…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Recibimos asistencia técnica de la Instalación de Biopolímeros de la Escuela de Medicina de Harvard para el bioanalizador. Este trabajo fue apoyado por la beca de investigación de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple RG-1707-28516 (H.L.W. y SL).

Materials

Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Thermo Fischer Scientific AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fischer Scientific 14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fischer Scientific AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) Thermo Fischer Scientific AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer QIAGEN 13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fischer Scientific AM9780
Vortex Shaker

References

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Cite This Article
Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. Fecal (micro) RNA Isolation. J. Vis. Exp. (164), e61908, doi:10.3791/61908 (2020).

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