Este protocolo isola RNA total de alta qualidade de amostras fecais de animais e seres humanos. Um kit comercial de isolamento de miRNA é usado com adaptação significativa para isolar o RNA puro com quantidade e qualidade otimizadas. Os isolados de RNA são bons para a maioria dos ensaios de RNA a jusante, como sequenciamento, micro-array e RT-PCR.
Está ficando claro que o RNA existe no lúmen intestinal e nas fezes em animais e humanos. O protocolo descrito abaixo isola o RNA total, incluindo microRNAs de amostras fecais de animais e seres humanos. O objetivo é isolar o RNA total com alta pureza e quantidade para análises a jusante, como sequenciamento de RNA, RT-PCR e microarray. As vantagens deste protocolo otimizado no isolamento de miRNA são as capacidades de isolar produtos de RNA altamente purificados com etapas de lavagem adicionais descritas, aumento da quantidade de RNA obtida com um método aprimorado na ressuspensão da amostra e importantes dicas de descontaminação. Uma limitação é a incapacidade de processar e purificar amostras maiores de mais de 200 mg, pois esses tamanhos de amostra causariam uma dificuldade na formação clara da interfase. Consequentemente, o grande tamanho da amostra pode contaminar a fase aquosa a ser extraída conforme descrito no protocolo com matérias orgânicas que afetam a qualidade do RNA isolado no final. No entanto, os isolados de ARN de uma amostra de até 200 mg são suficientes para a maioria das análises a jusante.
O RNA extracelular está sendo reconhecido como um fator significativo que medeia muitos processos biológicos1. O RNA extracelular em fezes foi relatado pela primeira vez em 2008 como um marcador para câncer de cólon e colite ulcerativa ativa2, e foi recentemente revelado como um componente normal do lúmen intestinal e fezes e medeia as comunicações hospedeiro-micróbio 3,4,5. O objetivo deste protocolo de isolamento de RNA é extrair RNA extracelular de alta qualidade de amostras fecais coletadas de animais e seres humanos. O protocolo foi adaptado de um kit comercial de isolamento de miRNA. O RNA adquirido é utilizado para análises a jusante, como sequenciamento de RNA, RT-PCR e microarray. O protocolo inclui várias dicas importantes e úteis para maximizar a quantidade e a qualidade do RNA encontrado nas fezes de animais e humanos. A razão para desenvolver e otimizar este método de isolamento de RNA (incluindo microRNA) é diminuir o RNA microbiano nas fezes, limitar as variáveis nos estudos de pesquisa e analisar a composição de RNA no intestino sem contabilizar vários fatores de confusão e fontes de contaminação. De notar, este isolamento de RNA minimiza a liberação de RNA de células vivas e micróbios vivos (RNA celular). Ele se concentra em RNAs extracelulares que foram liberados pelas células intestinais ou foram adquiridos através da ingestão de alimentos. Principalmente, este método não é adequado para estudos em que o transcriptoma microbiano é investigado.
É importante o uso da técnica livre de RNase para evitar a contaminação por RNase durante o isolamento7. Após a centrifugação e a formação de uma interfase compacta, é fundamental evitar a interfase, a fase inferior e o contaminante de partículas flutuando no topo da fase aquosa ao recuperar a fase aquosa. Além disso, duas etapas de lavagem com solução de lavagem 2/3 de 500 μL e 250 μL são adicionadas para eliminar contaminantes na membrana do filtro para uma qualidade otimizada. …
The authors have nothing to disclose.
Recebemos assistência técnica da Biopolymers Facility da Harvard Medical School para bioanalisador. Este trabalho foi apoiado pela bolsa de pesquisa da National Multiple Sclerosis Society RG-1707-28516 (H.L.W. e S.L.).
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
Gloves | |||
Microcentrifuge | |||
mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
Vortex Shaker |