يعزل هذا البروتوكول الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من عينات البراز من الحيوانات والبشر. يتم استخدام مجموعة عزل miRNA التجارية مع تكيف كبير لعزل الحمض النووي الريبي النقي بكمية وجودة محسنة. تعتبر عزلات الحمض النووي الريبي جيدة لمعظم فحوصات الحمض النووي الريبي النهائية مثل التسلسل والمصفوفات الدقيقة و RT-PCR.
أصبح من الواضح أن الحمض النووي الريبي موجود في تجويف الأمعاء والبراز في الحيوانات والبشر. يعزل البروتوكول الموصوف أدناه إجمالي الحمض النووي الريبي بما في ذلك الحمض النووي الريبي الميكروي من عينات البراز من الحيوانات والبشر. الهدف هو عزل الحمض النووي الريبي الكلي بنقاوة وكمية عالية للتحليلات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، RT-PCR ، والمصفوفات الدقيقة. تتمثل مزايا هذا البروتوكول الأمثل في عزل miRNA في قدرات عزل منتجات الحمض النووي الريبي عالية النقاء مع خطوات غسيل إضافية موصوفة ، وزيادة كمية الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها بطريقة محسنة في إعادة تعليق العينة ، ونصائح مهمة لإزالة التلوث. أحد القيود هو عدم القدرة على معالجة وتنقية عينة أكبر من أكثر من 200 ملغ لأن أحجام العينات هذه قد تسبب صعوبة في التكوين الواضح للطور البيني. وبالتالي ، فإن حجم العينة الكبير قد يلوث المرحلة المائية المراد استخراجها كما هو موضح في البروتوكول مع المواد العضوية التي تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي المعزول في النهاية. ومع ذلك ، فإن عزلات الحمض النووي الريبي من عينة تصل إلى 200 ملغ كافية لمعظم التحليلات النهائية.
يتم التعرف على الحمض النووي الريبي خارج الخلية كعامل مهم يتوسط العديد من العمليات البيولوجية1. تم الإبلاغ عن الحمض النووي الريبي خارج الخلية في البراز لأول مرة في عام 2008 كعلامة لسرطان القولون والتهاب القولون التقرحيالنشط 2 ، وتم الكشف عنه مؤخرا كمكون طبيعي لتجويف الأمعاء والبراز ويتوسط اتصالات ميكروب المضيف3،4،5. الغرض من بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي هذا هو استخراج الحمض النووي الريبي خارج الخلية عالي الجودة من عينات البراز التي تم جمعها من الحيوانات والبشر. تم تكييف البروتوكول من مجموعة عزل miRNA التجارية. يتم استخدام الحمض النووي الريبي المكتسب لتحليلات المصب مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، RT-PCR ، والمصفوفات الدقيقة. يتضمن البروتوكول العديد من النصائح المهمة والمفيدة لتعظيم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي الموجود في براز الحيوانات والبشر. السبب في تطوير وتحسين هذه الطريقة لعزل الحمض النووي الريبي (بما في ذلك microRNA) هو تقليل الحمض النووي الريبي الميكروبي في البراز ، والحد من المتغيرات في الدراسات البحثية وتحليل تكوين الحمض النووي الريبي في الأمعاء دون حساب مختلف العوامل المربكة ومصادر التلوث. تجدر الإشارة إلى أن عزل الحمض النووي الريبي هذا يقلل من إطلاق الحمض النووي الريبي من الخلايا الحية والميكروبات الحية (الحمض النووي الريبي الخلوي). وهو يركز على الحمض النووي الريبي خارج الخلية التي تم إطلاقها بواسطة خلايا الأمعاء أو تم الحصول عليها عن طريق تناول الطعام. بشكل أساسي ، هذه الطريقة ليست مناسبة للدراسات التي يتم فيها فحص النسخ الميكروبي.
من المهم استخدام تقنية خالية من RNase لمنع تلوث RNase أثناء العزل7. بعد الطرد المركزي وتشكيل الطور البيني المضغوط ، من المهم تجنب الطور البيني والمرحلة السفلية وملوث الجسيمات العائم على قمة الطور المائي عند استعادة المرحلة المائية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة خطوتين للغسيل بمحلو?…
The authors have nothing to disclose.
تلقينا مساعدة فنية من مرفق البوليمرات الحيوية في كلية الطب بجامعة هارفارد للمحلل الحيوي. تم دعم هذا العمل من خلال منحة أبحاث الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد RG-1707-28516 (H.L.W. و S.L.).
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
Gloves | |||
Microcentrifuge | |||
mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
Vortex Shaker |