JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
español

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa mediante monitoreo fenológico, polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

Se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela, que combina polinizaciones de campo y laboratorio y observaciones de tubos de polen bajo la microscopía de fluorescencia con la identificación de genotipos Spor PCR y el monitoreo de la floración para la selección de polinizadores.

Abstract

Los cultivares de ciruela japonesa comúnmente cultivados son híbridos interespecíficos derivados de cruces entre el Prunus salicina original con otras especies de Prunus. La mayoría de los híbridos exhiben autoincompatibilidad gametofítica, que está controlada por un locus Súnico y altamente polimórfico que contiene múltiples alelos. La mayoría de los híbridos cultivados son autoincompatibles y necesitan polen de un donante compatible para fertilizar sus flores. El establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa es cada vez más importante debido al alto número de nuevos cultivares con requisitos de polinización desconocidos. En este trabajo, se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela. La autocompatibilidad se determina mediante polinizaciones manuales tanto en el campo como en el laboratorio, seguidas de un monitoreo del alargamiento del tubo polínico con microscopía de fluorescencia y también un monitoreo de la maduración de la fruta en el campo. La selección de cultivares polinizadores se evalúa combinando la identificación de genotipos Smediante análisis PCR con el seguimiento del tiempo de floración en campo. Conocer los requerimientos de polinización de los cultivares facilita la selección de cultivares para el diseño de nuevos huertos y permite la detección temprana de problemas de productividad relacionados con la deficiencia de polinización en huertos establecidos.

Introduction

La ciruela japonesa(Prunus salicina Lindl.) es originaria de China1. En elsiglo 19, este cultivo se introdujo desde Japón a los Estados Unidos, donde se cruzó con otras ciruelas diploides de América del Norte2. En elsiglo 20, algunos de estos híbridos se extendieron a regiones templadas de todo el mundo. Hoy en día, el término “ciruela japonesa” se refiere a una amplia gama de híbridos interespecíficos derivados de cruces entre el original P. salicina con hasta otros 15 Prunus diploides spp.3,4,5.

La ciruela japonesa, al igual que otras especies de la familia Rosaceae, exhibe autoincompatibilidad gametofítica (GSI), que está controlada por un locus Súnico y altamente polimórfico que contiene múltiples alelos6. El locus Scontiene dos genes que codifican una ribonucleasa(S-RNasa)expresada en el pistilo, y una proteína F-box (SFB) expresada en el grano de polen7. En la reacción de autoincompatibilidad, cuando el alelo Sexpresado en el grano de polen (haploide) es el mismo que uno de los dos expresados en el pistilo (diploide), el crecimiento del tubo polínico a través del estilo se detiene debido a la degradación del ARN del tubo polen por la acción de la S-RNasa8. Dado que este proceso impide la fertilización del gametofito femenino en el óvulo, GSI promueve el cruce entre cultivares.

Aunque algunos cultivares de ciruela japonesa son autocompatibles, la mayoría de los cultivares que se cultivan actualmente son autoincompatibles y necesitan polen de donantes intercompatibles para fertilizar sus flores3. En las especies de frutas de hueso del género Prunus como la almendra9,el albaricoque10,11,12 y la cereza dulce13,los requisitos de polinización de los cultivares se pueden establecer mediante diferentes enfoques. La auto(in)compatibilidad puede determinarse mediante la autopolinización de flores en el campo y el posterior monitoreo del cuajado de la fruta, o mediante autopolinizacións semi-in vivo en condiciones controladas en un laboratorio y la observación de tubos de polen bajo el microscopio14,15,16,17,18 . Las relaciones de incompatibilidad entre cultivares pueden determinarse mediante polinizaciones cruzadas en el campo o en el laboratorio utilizando polen del cultivar polinizador potencial, y mediante la identificación de alelos Sde cada cultivar mediante análisis de PCR14,15,16,19,20,21,22 . En especies como la cereza dulce o la almendra, la auto(in)compatibilidad también se puede evaluar mediante la identificación de alelos S particulares asociados a la autocompatibilidad, como S4‘ en cereza dulce13 o Sf en almendra23.

Varios programas de mejoramiento de ciruelas de los principales países productores están liberando una serie de nuevos cultivares2,14,muchos de ellos con requisitos de polinización desconocidos. En este trabajo, se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela. La auto(in)compatibilidad está determinada por autopolinizaciones tanto en el campo como en el laboratorio, seguidas de observaciones de tubos de polen bajo la microscopía de fluorescencia. La selección de cultivares polinizadores combina la identificación de genotipos Smediante análisis PCR con el seguimiento del tiempo de floración en campo.

Protocol

1. Polinización manual en el campo Extracción de polen Para obtener polen, recolectar capullos florales en la etapa D24,de acuerdo con la etapa 57 en la escala BBCH25,26.NOTA: Se necesitan más capullos florales en la ciruela japonesa que en otras especies de Prunus porque sus anteras producen menos polen. Retire las anteras con una malla de plástico (tamaño de poro de 2 mm …

Representative Results

Cada capullo de flor de ciruelo japonés contiene una inflorescencia con 1-3 flores. Al igual que en otras especies de frutas de hueso, cada flor se compone de cuatro verticilos: carpelo, estambres, pétalos y sépalos, que se fusionan formando una copa en la base de la flor. Las estructuras florales son más pequeñas que otras frutas de hueso, con un pistilo corto y frágil rodeado por los estambres que contienen una pequeña cantidad de granos de polen. En plena floración, las flores de cada inflorescencia aparecen s…

Discussion

La metodología descrita en este documento para los requisitos de polinización de los cultivares de ciruela japonesa requiere determinar la auto(in)compatibilidad de cada cultivar mediante polinizaciones controladas en el campo o el laboratorio, y la posterior observación del crecimiento del tubo de polen con microscopía de fluorescencia. Las relaciones de incompatibilidad se establecen mediante la caracterización de los alelos Smediante genotipado molecular. Por último, la selección de polinizadores se re…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 y RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón—Fondo Social Europeo, Unión Europea (Grupo Consolidado A12-17R), y Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT, 471839).

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hendrick, U. P. . The Plums of New York. , (1911).
  2. Okie, W. R., Hancock, J. F., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. , 337-357 (2008).
  3. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: a review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  4. Okie, W. R. Introgression of Prunus species in plum. New York Fruit Quarterly. 14 (1), 29-37 (2006).
  5. Okie, W. R., Weinberger, J. H., Janick, J., Moore, J. . Fruit Breeding, vol. 1. Tree and tropical fruits. , 559-608 (1996).
  6. Mccubbin, A. G., Kao, T. Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 333-364 (2000).
  7. Hegedűs, A., Halász, J. Recent findings of the tree fruit self-incompatibility studies. International Journal of Horticultural Science. 13 (2), 7-15 (2007).
  8. de Nettancourt, D. . Incompatibility and Incongruity in Wild and Cultivated Plants. , (2001).
  9. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38 (3), 304-311 (1997).
  10. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (5), 410-417 (2010).
  11. Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Self-incompatibility and S-allele identification in new apricot cultivars. Acta Horticulturae. (1231), 171-176 (2019).
  12. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
  13. Cachi, A. M., Wunsch, A. Characterization of self-compatibility in sweet cherry varieties by crossing experiments and molecular genetic analysis. Tree Genetics & Genomes. 10, 1205-1212 (2014).
  14. Guerra, M. E., Guerrero, B. I., Casadomet, C., Rodrigo, J. Self-compatibility, S-RNase allele identification, and selection of pollinizers in new Japanese plum-type cultivars. Scientia Horticulturae. 261, 109022 (2020).
  15. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 1-12 (2018).
  16. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of self-incompatibility alleles by specific PCR analysis and S-RNase sequencing in apricot. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3612 (2018).
  17. Sociasi Company, R., Kodad, O., Fernández i Martí, J. M., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: from deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  18. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot ‘Moniqui. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 71 (5), 801-805 (1996).
  19. Beppu, K., et al. Se-haplotype confers self-compatibility in Japanese plum (Prunus salicina Lindl). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 80 (6), 760-764 (2005).
  20. Guerra, M. E., Rodrigo, J., López-Corrales, M., Wünsch, A. S-RNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum. Plant Breeding. 128 (3), 304-311 (2009).
  21. Guerra, M. E., Wunsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower emasculation as the cause for lack of fruit set in Japanese plum crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  22. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Lack of fruit set caused by ovule degeneration in Japanese plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  23. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  24. Baggiolini, M. Les stades repérés des arbres fruitiers à noyau. Revue romande d’Agriculture et d’Arboriculture. 8, 3-4 (1952).
  25. Meier, U. Growth stages of mono-and dicotyledonous plants: BBCH Monograph. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. , (2001).
  26. Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower development in sweet cherry framed in the BBCH scale. Scientia Horticulturae. 192, 141-147 (2015).
  27. Fadon, E., Rodrigo, J. Combining histochemical staining and image analysis to quantify starch in the ovary primordia of sweet cherry during winter dormancy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  28. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  29. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 72 (1), 147-154 (1997).
  30. Dicenta, F., Ortega, E., Cánovas, J. A., Egea, J. Self-pollination vs. cross-pollination in almond: pollen tube growth, fruit set and fruit characteristics. Plant Breeding. 121, 163-167 (2002).
  31. Alonso, J. M., Socias i Company, R. Differential pollen tube growth in inbred self-compatible almond genotypes. Euphytica. 144, 207-213 (2005).
  32. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. The effect of temperature on pollen germination, pollen tube growth, and stigmatic receptivity in peach. Plant Biology. 7, 476-483 (2005).
  33. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. Warm temperatures at bloom reduce fruit set in sweet cherry. Journal of Applied Botany. 81, 158-164 (2007).
  34. Milatović, D., Nikolić, D. Analysis of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 82, 170-174 (2007).
  35. Jia, H. J., He, F. J., Xiong, C. Z., Zhu, F. R., Okamoto, G. Influences of cross pollination on pollen tube growth and fruit set in Zuili plums (Prunus salicina). Journal of Integrative Plant Biology. 50, 203-209 (2008).
  36. Herrero, M., Salvador, J. La polinización del ciruelo Red Beaut. Información Técnica Econónomica Agraria. 41, 3-7 (1980).
  37. Ramming, D. W. Plum. Register of new fruit and nut varieties: Brooks and Olmo, List 37. HortScience. 30 (6), 1142-1144 (1995).
  38. Hartmann, W., Neümuller, M. Plum breeding. Breeding plantation tree crops: Temperate species. , 161-231 (2009).
  39. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A. Improved S-genotyping and new incompatibility groups in Japanese plum. Euphytica. 186 (2), 445-452 (2012).
  40. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cDNA cloning for S-RNases in sweet cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124 (3), 224-233 (1999).
  41. Yamane, H., Tao, R., Sugiura, A., Hauck, N. R., Lezzoni, A. F. Identification and characterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of the American Society for Horticultural Science. 126, 661-667 (2001).
  42. López, M., Jose, F., Vargas, F. J., Battle, I. Self-(in)compatibility almond genotypes: a review. Euphytica. 150, 1-16 (2006).
  43. Bošković, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  44. Beppu, K., Syogase, K., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Inheritance of self-compatibility conferred by the Se-haplotype of Japanese plum and development of Se-RNase gene-specific PCR primers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 85, 215-218 (2010).
  45. Beppu, K., Kumai, M., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Molecular and genetic analyses of the S-haplotype of the self-compatible Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) “Methley”. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 87 (5), 493-498 (2012).
  46. Beppu, K., Konishi, K., Kataoka, I. S-haplotypes and self-compatibility of the Japanese plum cultivar ‘Karari’. Acta Horticulturae. 929, 261-266 (2012).
  47. Sapir, G., Stern, R. A., Shafir, S., Goldway, M. S-RNase based S-genotyping of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) and its implication on the assortment of cultivar-couples in the orchard. Scientia Horticulturae. 118, 8-13 (2008).
  48. Karp, D. Luther Burbank’s plums. HortScience. 50 (2), 189-194 (2015).

Tags

Pollination RequirementsJapanese PlumPhenological MonitoringHand PollinationsFluorescence MicroscopyMolecular GenotypingSelf-incompatible CultivarsPollen ExtractionBBCH ScaleFruit SetSelf-pollinationCross-pollinationPollen GerminationFixative SolutionMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image