JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Установление требований к опылению японской сливы с помощью фенологического мониторинга, ручного опыления, флуоресцентной микроскопии и молекулярного генотипирования

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

Описана методика определения потребностей в опылении у гибридов японского сливового типа, сочетающая полевые и лабораторные опыления и наблюдения пыльцевых пробирок под флуоресцентной микроскопией с идентификацией S-генотипов методом ПЦР и мониторингом цветения для селекции опылителей.

Abstract

Японские сорта сливы, обычно выращиваемые, являются межвидовыми гибридами, полученными из скрещиваний между оригинальным Prunus salicina с другими видами Prunus. Большинство гибридов демонстрируют гейметофитную самосовместимость, которая контролируется одним и высокополиморфным S-локусом, содержащим несколько аллелей. Большинство культивируемых гибридов самонесоотсоотвращны и нуждаются в пыльце от совместимого донора для удобрения своих цветов. Установление требований к опылению японской сливы становится все более важным из-за большого количества новых сортов с неизвестными требованиями к опылению. В данной работе описана методология определения требований к опылению у гибридов японского сливового типа. Самосовместимость определяется ручным опылением как в полевых условиях, так и в лаборатории с последующим мониторингом удлинения пыльцевой трубки с помощью флуоресцентной микроскопии, а также мониторингом созревания плодов в полевых условиях. Селекция сортов опылителей оценивается путем совмещения идентификации S-генотипов методом ПЦР-анализа с мониторингом времени цветения в полевых условиях. Знание требований к опылению сортов облегчает отбор сортов для проектирования новых садов и позволяет своевременно выявлять проблемы продуктивности, связанные с дефицитом опыления в установленных садах.

Introduction

Японская слива (Prunus salicina Lindl.) родом из Китая1. В 19веке эта культура была завезена из Японии в США, где ее скрещивали с другими североамериканскими диплоидными сливами2. В20-м веке некоторые из этих гибридов были распространены в умеренных регионах по всему миру. В настоящее время термин «японская слива» относится к широкому кругу межвидовых гибридов, полученных из скрещива между оригинальным P. salicina с 15 другими диплоидами Prunus spp.3,4,5.

Японская слива, как и другие виды семейства Rosaceae, демонстрирует гаметофитную самонесовместимость (GSI), которая контролируется одним и высокополиморфным S-локусом, содержащим несколько аллелей6. S-локус содержит два гена, которые кодируют рибонуклеазу(S-РНКазу),экспрессируемую в пестике, и белок F-бокса (SFB), экспрессируемый в пыльцевомзерне 7. В реакции самосовместимости, когда S-аллель, экспрессируемый в пыльцевом зерне (гаплоиде), такой же, как один из двух, экспрессируемых в пестике (диплоид), рост пыльцевой трубки по всему стилю остановлен из-за деградации РНК пыльцевой трубки действием S-РНКазы8. Поскольку этот процесс препятствует оплодотворению женского гаметофита в яйцеклетке, GSI способствует ауткроссингу между сортами.

Хотя некоторые японские сорта сливы являются самосовместимыми, большинство выращиваемых в настоящее время сортов являются самонесостоятельными и нуждаются в пыльце от совместимых доноров для удобрения своих цветов3. У косточковых видов рода Prunus, таких как миндаль9,абрикос10,11,12 и черешня13,требования к опылению сортов могут быть установлены различными подходами. Самосовместимость может быть определена путем самоопыления цветов в поле и последующего мониторинга плодового заготовления, или путем полу-in vivo самоопыления в контролируемых условиях в лабораторных условиях и наблюдения пыльцевых трубок под микроскопом14,15,16,17,18 . Отношения несовместимости между сортами могут быть определены путем перекрестного опыления в полевых условиях или лаборатории с использованием пыльцы потенциального сорта опылителя, а также путем идентификации S-аллелей каждого сорта методом ПЦР-анализа14,15,16,19,20,21,22 . У таких видов, как черешня или миндаль, самосовместимость также может быть оценена путем идентификации конкретных аллелей S, связанных с самосовместимостью, таких как S4‘ в черешне13 или Sf в миндале23.

Несколько программ по разведению сливы из основных стран-производителей выпускают ряд новых сортов2,14,многие из которых с неизвестными требованиями к опылению. В данной работе описана методология определения требований к опылению у гибридов японского сливового типа. Самосовместимость определяется самоопылениями как в полевых условиях, так и в лаборатории с последующими наблюдениями пыльцевых трубок под флуоресцентной микроскопией. Селекция сортов опылителей сочетает в себе идентификацию S-генотипов методом ПЦР-анализа с мониторингом времени цветения в полевых условиях.

Protocol

1. Ручное опыление в полевых условиях Извлечение пыльцы Для получения пыльцы собирают цветочные почки на стадии D24,согласно стадии 57 по шкале BBCH25,26.ПРИМЕЧАНИЕ: У японской сливы необходимо больше цветочных почек, чем у др…

Representative Results

Каждая бутон цветка японской сливы содержит соцветие с 1–3 цветками. Как и у других видов косточковых фруктов, каждый цветок состоит из четырех мутовок: карпеля, тычинок, лепестков и чашелистиков, которые срослись, образуя чашечку у основания цветка. Цветочные структуры меньше, чем друг?…

Discussion

Методология, описанная в настоящем описании для потребностей в опылении японских сортов сливы, требует определения самосовместимости каждого сорта путем контролируемого опыления в полевых условиях или лаборатории и последующего наблюдения за ростом пыльцевой трубки с помощью флуор…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование финансировалось Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 и RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Европейский социальный фонд, Европейский союз (Grupo Consolidado A12-17R) и Хунта Эстремадура — Европейский фонд регионального развития (FEDER), Региональный план исследований (IB16181), Группа исследований (AGA001, GR18196). Б.И. Герреро был поддержан стипендией Национального совета по вопросам науки и технологии Мексики (CONACYT, 471839).

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hendrick, U. P. . The Plums of New York. , (1911).
  2. Okie, W. R., Hancock, J. F., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. , 337-357 (2008).
  3. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: a review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  4. Okie, W. R. Introgression of Prunus species in plum. New York Fruit Quarterly. 14 (1), 29-37 (2006).
  5. Okie, W. R., Weinberger, J. H., Janick, J., Moore, J. . Fruit Breeding, vol. 1. Tree and tropical fruits. , 559-608 (1996).
  6. Mccubbin, A. G., Kao, T. Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 333-364 (2000).
  7. Hegedűs, A., Halász, J. Recent findings of the tree fruit self-incompatibility studies. International Journal of Horticultural Science. 13 (2), 7-15 (2007).
  8. de Nettancourt, D. . Incompatibility and Incongruity in Wild and Cultivated Plants. , (2001).
  9. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38 (3), 304-311 (1997).
  10. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (5), 410-417 (2010).
  11. Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Self-incompatibility and S-allele identification in new apricot cultivars. Acta Horticulturae. (1231), 171-176 (2019).
  12. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
  13. Cachi, A. M., Wunsch, A. Characterization of self-compatibility in sweet cherry varieties by crossing experiments and molecular genetic analysis. Tree Genetics & Genomes. 10, 1205-1212 (2014).
  14. Guerra, M. E., Guerrero, B. I., Casadomet, C., Rodrigo, J. Self-compatibility, S-RNase allele identification, and selection of pollinizers in new Japanese plum-type cultivars. Scientia Horticulturae. 261, 109022 (2020).
  15. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 1-12 (2018).
  16. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of self-incompatibility alleles by specific PCR analysis and S-RNase sequencing in apricot. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3612 (2018).
  17. Sociasi Company, R., Kodad, O., Fernández i Martí, J. M., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: from deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  18. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot ‘Moniqui. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 71 (5), 801-805 (1996).
  19. Beppu, K., et al. Se-haplotype confers self-compatibility in Japanese plum (Prunus salicina Lindl). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 80 (6), 760-764 (2005).
  20. Guerra, M. E., Rodrigo, J., López-Corrales, M., Wünsch, A. S-RNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum. Plant Breeding. 128 (3), 304-311 (2009).
  21. Guerra, M. E., Wunsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower emasculation as the cause for lack of fruit set in Japanese plum crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  22. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Lack of fruit set caused by ovule degeneration in Japanese plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  23. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  24. Baggiolini, M. Les stades repérés des arbres fruitiers à noyau. Revue romande d’Agriculture et d’Arboriculture. 8, 3-4 (1952).
  25. Meier, U. Growth stages of mono-and dicotyledonous plants: BBCH Monograph. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. , (2001).
  26. Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower development in sweet cherry framed in the BBCH scale. Scientia Horticulturae. 192, 141-147 (2015).
  27. Fadon, E., Rodrigo, J. Combining histochemical staining and image analysis to quantify starch in the ovary primordia of sweet cherry during winter dormancy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  28. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  29. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 72 (1), 147-154 (1997).
  30. Dicenta, F., Ortega, E., Cánovas, J. A., Egea, J. Self-pollination vs. cross-pollination in almond: pollen tube growth, fruit set and fruit characteristics. Plant Breeding. 121, 163-167 (2002).
  31. Alonso, J. M., Socias i Company, R. Differential pollen tube growth in inbred self-compatible almond genotypes. Euphytica. 144, 207-213 (2005).
  32. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. The effect of temperature on pollen germination, pollen tube growth, and stigmatic receptivity in peach. Plant Biology. 7, 476-483 (2005).
  33. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. Warm temperatures at bloom reduce fruit set in sweet cherry. Journal of Applied Botany. 81, 158-164 (2007).
  34. Milatović, D., Nikolić, D. Analysis of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 82, 170-174 (2007).
  35. Jia, H. J., He, F. J., Xiong, C. Z., Zhu, F. R., Okamoto, G. Influences of cross pollination on pollen tube growth and fruit set in Zuili plums (Prunus salicina). Journal of Integrative Plant Biology. 50, 203-209 (2008).
  36. Herrero, M., Salvador, J. La polinización del ciruelo Red Beaut. Información Técnica Econónomica Agraria. 41, 3-7 (1980).
  37. Ramming, D. W. Plum. Register of new fruit and nut varieties: Brooks and Olmo, List 37. HortScience. 30 (6), 1142-1144 (1995).
  38. Hartmann, W., Neümuller, M. Plum breeding. Breeding plantation tree crops: Temperate species. , 161-231 (2009).
  39. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A. Improved S-genotyping and new incompatibility groups in Japanese plum. Euphytica. 186 (2), 445-452 (2012).
  40. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cDNA cloning for S-RNases in sweet cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124 (3), 224-233 (1999).
  41. Yamane, H., Tao, R., Sugiura, A., Hauck, N. R., Lezzoni, A. F. Identification and characterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of the American Society for Horticultural Science. 126, 661-667 (2001).
  42. López, M., Jose, F., Vargas, F. J., Battle, I. Self-(in)compatibility almond genotypes: a review. Euphytica. 150, 1-16 (2006).
  43. Bošković, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  44. Beppu, K., Syogase, K., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Inheritance of self-compatibility conferred by the Se-haplotype of Japanese plum and development of Se-RNase gene-specific PCR primers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 85, 215-218 (2010).
  45. Beppu, K., Kumai, M., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Molecular and genetic analyses of the S-haplotype of the self-compatible Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) “Methley”. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 87 (5), 493-498 (2012).
  46. Beppu, K., Konishi, K., Kataoka, I. S-haplotypes and self-compatibility of the Japanese plum cultivar ‘Karari’. Acta Horticulturae. 929, 261-266 (2012).
  47. Sapir, G., Stern, R. A., Shafir, S., Goldway, M. S-RNase based S-genotyping of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) and its implication on the assortment of cultivar-couples in the orchard. Scientia Horticulturae. 118, 8-13 (2008).
  48. Karp, D. Luther Burbank’s plums. HortScience. 50 (2), 189-194 (2015).

Tags

Pollination RequirementsJapanese PlumPhenological MonitoringHand PollinationsFluorescence MicroscopyMolecular GenotypingSelf-incompatible CultivarsPollen ExtractionBBCH ScaleFruit SetSelf-pollinationCross-pollinationPollen GerminationFixative SolutionMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image