JoVE Journal > Developmental Biology
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Abstract
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Developmental Biology

日本梅における花粉の要件を確立する:フェノロジーモニタリング、手受粉、蛍光顕微鏡と分子ジェノタイピング

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

蛍光顕微鏡下での蛍光顕微鏡下での花粉管のフィールド・受粉と観察と、PCRによる S-遺伝子型の同定、受粉者の選択のための開花のモニタリングを組み合わせた、日本の梅型ハイブリッドにおける受粉要件の決定方法論が記載されている。

Abstract

一般的に栽培されている日本の梅の品種は、元のプルヌスサリシナと他のプルヌス種との間の十字架に由来する特異性ハイブリッドです。ほとんどのハイブリッドは、複数の対立遺伝子を含む単一の非常に多形性S-locusによって制御される、ゲーム病の自己非適合性を示す。ほとんどの栽培ハイブリッドは自己互換性がなく、花を受精させるために互換性のあるドナーからの花粉が必要です。日本の梅の受粉要件の確立は、未知の受粉要件を持つ新しい品種の数が多いため、ますます重要になっています。本研究では、梅型ハイブリッド系の受粉要件の決定方法について説明する。自己(in)の適合性は、現場と研究室の両方で手受粉によって決定され、続いて蛍光顕微鏡による花粉管伸びをモニタリングし、フィールドにおける果実成熟をモニタリングします。受粉者品種の選択は、現場での開花時間のモニタリングとPCR分析によるS-遺伝子型の同定を組み合わせることにより評価される。品種の受粉要件を知ることは、新しい果樹園の設計のための品種の選択を容易にし、確立された果樹園の受粉欠損に関連する生産性の問題の早期発見を可能にする。

Introduction

日本の梅(プルヌスサリチーナリンブル.)は中国1原産です。19世紀には、この作物は日本からアメリカに導入され、そこで他の北米の二分性の梅2と交配した。20世紀には、これらのハイブリッドのいくつかは、世界中の温帯地域に広がりました。今日では、「日本の梅」という用語は、元のP.サリシナと最大15個の他のディプロイド・プルヌス属の間の十字架から導き出される幅広い異特異的ハイブリッドを指します。

日本の梅は、他の種の酒さファミリーと同様に、多方対立遺伝子を含む単一の高多形性S−軌跡によって制御されるGametophytic自己非適合性(GSI)を示す6。S-locusには、ピスティルで発現したリボヌクレアーゼ(S-RNase)をコードする2つの遺伝子と、花粉粒7に発現するFボックスタンパク質(SFB)が含まれている。自己非適合反応では、花粉粒(ハプロイド)で発現したS-アレスレが、ピスティル(ジプロイド)で発現した2つの中の1つと同じである場合、S-RNase8の作用により花粉管RNAの分解によりスタイル全体の花粉管の成長が抑制される。このプロセスは、排卵体中の女性のガテファイトの受精を防ぐため、GSIは、品種間の外交を促進する。

一部の日本の梅の品種は自己互換性がありますが、現在栽培されているほとんどの品種は自己互換性がなく、花を受精させるために互換性のあるドナーからの花粉が必要です。アーモンド9、アプリコット10、11、12、スウィートチェリー13などのプルヌス属の石実種では、品種の受粉要件は、異なるアプローチによって確立することができます。自己(in)互換性は、フィールド内の花の自己受粉とその後のフルーツセットの監視、または実験室での制御された条件での半生体自己受粉および顕微鏡14、15、16、17、18の下での花粉管の観察によって決定することができる.品種間の非適合性関係は、潜在的な受粉者品種の花粉を用いて現場または実験室でのクロス受粉によって決定され、PCR分析による各品種のS-対立アレスの同定14、15、16、19、20、21、22.例えば、甘い桜やアーモンドのような種では、自己(in)相溶性は、アーモンド23のスウィートチェリー13またはSfのS4′として、自己適合性に関連する特定のS対立アレスの同定によっても評価することができる。

主な生産国からのいくつかの梅の繁殖プログラムは、未知の受粉要件を持つ新しい品種2、14、それらの多くをリリースしています。本研究では、梅型ハイブリッド系の受粉要件の決定方法について説明する。自己(in)の適合性は、フィールドと研究室の両方で自己受粉によって決定され、続いて蛍光顕微鏡下での花粉管の観察が行われます。受粉者品種の選択は、現場での開花時間のモニタリングとPCR分析によるS-ジェノタイプの同定を兼ね備えています。

Protocol

1. 現場での手受粉 花粉抽出 花粉を得るためには、ステージD24で花芽を収集し、BBCHスケール25、26のステージ57に従って。注:彼らのアンサーがより少ない花粉を生成するので、他の プルヌス 種よりも日本の梅でより多くの花の芽が必要です。 プラスチックメッシュ(2mm x 2mmの細孔サイ?…

Representative Results

日本の梅の花の芽には、花1~3本の花が咲く花が入っています。他の石の果実種と同様に、各花は4つの花で構成されています:カルペル、雄人、花びら、セパル、花の基部にカップを形成して融合されています。花の構造は、花粉粒の少量を含むstamensに囲まれた短く、壊れやすいピスティルで、他の石の果物よりも小さいです。満開の時、各花序の花が短い茎に分離して現れ、麻酔前の日に緑?…

Discussion

本明細書に記載されている梅品種の受粉要件について述べる方法論では、現場や研究室での制御された受粉による各品種の自己(in)適合性を決定し、その後蛍光顕微鏡による花粉管成長の観察を行う必要がある。非非適合性関係は、分子ジェノタイピングによる S-対立遺伝子の特性化によって確立される。最後に、毎年開花で一致する品種を検出するためにモニタリングフェノロジーに…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、インスティトゥート・ナシオナル・デ・インベスティガシオン・イ・テクノロジア・アグラリア・イ・アリメンタリア(RFP2015-00015-00およびRTA2017-00003-00)によって資金提供されました。ゴビエルノ・デ・アラゴン—欧州社会基金、欧州連合(グルポ・コンソリデーションA12-17R)、ユンタ・デ・エストレマドゥーラ—フォンド・ヨーロッパ・デ・デサロロ地域(FEDER)、プラン地域デインベスティガシオン(IB16181)、グルーポ・デ・インベスティガシオン(AGA001、GR18196)。B.I. ゲレーロは、メキシコのコンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(CONACYT、471839)のフェローシップによって支えられていました。

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
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Pollination RequirementsJapanese PlumPhenological MonitoringHand PollinationsFluorescence MicroscopyMolecular GenotypingSelf-incompatible CultivarsPollen ExtractionBBCH ScaleFruit SetSelf-pollinationCross-pollinationPollen GerminationFixative SolutionMicroscopy

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Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
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