JoVE Journal > Developmental Biology
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Abstract
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Developmental Biology

Établir les exigences de pollinisation dans la prune japonaise par surveillance phénologique, pollinisation manuelle, microscopie à fluorescence et génotypage moléculaire

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

Une méthodologie pour la détermination des besoins de pollinisation dans les hybrides japonais de type prune est décrite, qui combine les pollinisations sur le terrain et en laboratoire et les observations de tubes polliniques sous la microscopie à fluorescence avec l’identification des génotypes Spar PCR et la surveillance de la floraison pour la sélection des pollinisateurs.

Abstract

Les cultivars de prunes japonais couramment cultivés sont des hybrides interspécifiques dérivés de croisements entre le Prunus salicina original et d’autres espèces de Prunus. La plupart des hybrides présentent une auto-incompatibilité gamétophytique, qui est contrôlée par un S-locusunique et hautement polymorphe qui contient plusieurs allèles. La plupart des hybrides cultivés sont auto-incompatibles et ont besoin du pollen d’un donneur compatible pour fertiliser leurs fleurs. L’établissement des besoins de pollinisation dans la prune japonaise devient de plus en plus important en raison du nombre élevé de nouveaux cultivars dont les besoins en pollinisation sont inconnus. Dans ce travail, une méthodologie pour la détermination des besoins de pollinisation chez les hybrides japonais de type prune est décrite. L’autocompatibilité est déterminée par des pollinisations manuelles sur le terrain et en laboratoire, suivies de la surveillance de l’allongement du tube pollinique par microscopie à fluorescence et de la surveillance de la maturation des fruits sur le terrain. La sélection des cultivars polliniseurs est évaluée en combinant l’identification des génotypes Spar analyse PCR avec la surveillance du temps de floraison sur le terrain. Connaître les besoins de pollinisation des cultivars facilite la sélection des cultivars pour la conception de nouveaux vergers et permet la détection précoce des problèmes de productivité liés au déficit de pollinisation dans les vergers établis.

Introduction

La prune japonaise(Prunus salicina Lindl.) est originaire de Chine1. Au 19e siècle,cette culture a été introduite du Japon aux États-Unis, où elle a été croisée avec d’autres prunes diploïdes nord-américaines2. Au20ème siècle, certains de ces hybrides ont été répandus dans les régions tempérées du monde entier. De nos jours, le terme « prune japonaise » fait référence à une large gamme d’hybrides interspécifiques dérivés de croisements entre le P. salicina original avec jusqu’à 15 autres diploïdes Prunus spp.3,4,5.

La prune japonaise, comme d’autres espèces de la famille des Rosaceae, présente une auto-incompatibilité gamétophyte (GSI), qui est contrôlée par un S-locusunique et hautement polymorphe contenant plusieurs allèles6. Le S-locus contient deux gènes qui codent une ribonucléase(S-RNase)exprimée dans le pistil, et une protéine F-box (SFB) exprimée dans le grain de pollen7. Dans la réaction d’auto-incompatibilité, lorsque l’allèle Sexprimé dans le grain de pollen (haploïde) est le même que l’un des deux exprimés dans le pistil (diploïde), la croissance du tube pollinique à travers le style est arrêtée en raison de la dégradation de l’ARN du tube pollinique par l’action de la S-RNase8. Étant donné que ce processus empêche la fécondation du gamétophyte femelle dans l’ovule, GSI favorise le croisement entre les cultivars.

Bien que certains cultivars de prunes japonais soient autocompatibles, la plupart des cultivars actuellement cultivés sont auto-incompatibles et ont besoin du pollen de donneurs intercompatibles pour fertiliser leurs fleurs3. Dans les espèces de fruits à noyau du genre Prunus telles que l’amande9,l’abricot10,11,12 et la cerise douce13,les besoins en pollinisation des cultivars peuvent être établis par différentes approches. L’auto-(in)compatibilité peut être déterminée par l’autopollinisation des fleurs sur le terrain et la surveillance ultérieure de la fructification, ou par des autopollinisations semi-in vivo dans des conditions contrôlées en laboratoire et l’observation de tubes polliniques au microscope14,15,16,17,18 . Les relations d’incompatibilité entre cultivars peuvent être déterminées par des pollinisations croisées sur le terrain ou en laboratoire à l’aide du pollen du cultivar polliniseur potentiel, et par l’identification des allèles Sde chaque cultivar par analyse PCR14,15,16 , 19,20,21,22 . Chez des espèces telles que la cerise douce ou l’amande, l’auto-(in)compatibilité peut également être évaluée par l’identification d’allèles S particuliers associés à l’autocompatibilité, comme S4′ dans la cerise douce13 ou Sf dans l’amande23.

Plusieurs programmes de sélection de prunes des principaux pays producteurs libèrent un certain nombre de nouveaux cultivars2,14, dont beaucoup ont des besoins de pollinisation inconnus. Dans ce travail, une méthodologie pour la détermination des besoins de pollinisation chez les hybrides japonais de type prune est décrite. L’autocompatibilité est déterminée par des autopollinisations sur le terrain et en laboratoire, suivies d’observations de tubes polliniques sous microscopie à fluorescence. La sélection des cultivars polliniseurs combine l’identification des génotypes Spar analyse PCR avec le suivi du temps de floraison sur le terrain.

Protocol

1. Pollinisation manuelle sur le terrain Extraction du pollen Pour obtenir du pollen, collectez les boutons floraux au stade D24, selon le stade 57 sur l’échelle BBCH25,26.REMARQUE: Plus de boutons floraux sont nécessaires dans la prune japonaise que dans les autres espèces de Prunus parce que leurs anthères produisent moins de pollen. Retirez les anthères à l’aide d?…

Representative Results

Chaque bouton floral de prune japonaise contient une inflorescence avec 1–3 fleurs. Comme chez les autres espèces de fruits à noyau, chaque fleur est composée de quatre verticilles: carpelle, étamines, pétales et sépales, qui sont fusionnés formant une tasse à la base de la fleur. Les structures florales sont plus petites que les autres fruits à noyau, avec un pistil court et fragile entouré d’étamines qui contiennent une petite quantité de grains de pollen. À pleine floraison, les fleurs de chaque inflo…

Discussion

La méthodologie décrite ici pour les besoins de pollinisation des cultivars de prunes japonais nécessite de déterminer l’auto-(in)compatibilité de chaque cultivar par des pollinisations contrôlées sur le terrain ou en laboratoire, et l’observation ultérieure de la croissance des tubes polliniques par microscopie à fluorescence. Les relations d’incompatibilité sont établies par la caractérisation des S-allèles par génotypage moléculaire. Enfin, la sélection des pollinisateurs est effectuée…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par l’Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 et RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón —Fonds social européen, Union européenne (Grupo Consolidado A12-17R), et Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero a été soutenu par une bourse du Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología du Mexique (CONACYT, 471839).

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
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References

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Pollination RequirementsJapanese PlumPhenological MonitoringHand PollinationsFluorescence MicroscopyMolecular GenotypingSelf-incompatible CultivarsPollen ExtractionBBCH ScaleFruit SetSelf-pollinationCross-pollinationPollen GerminationFixative SolutionMicroscopy

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Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
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