連続結晶構造解析実験のためのエンドチアペプシン結晶の成長の最適化

結晶形態の最適化結晶形態を最適化するステップ1は、読者にその重要性を思い出させるために含まれています。回折が不十分な針球から完全な微結晶を作成することは可能かもしれません。ただし、著者は、2つを別々に最適化する方が良いと示唆しています。まず、蒸気拡散 によって よく回折する単結晶を生じる条件を見つけ、次にこれらの条件をバッチに変換し、2つのステップを組み合わせることを試みるのではなく、バッチに変換します。この段階では、高度に核形成する条件を発見する必要はありません。形態と回折品質が主な目標です。 エンドチアペプシンの微小結晶化を開始する前に、PDBから析出構造の結晶化条件の解析を行った。結晶化条件とおおよそのプロトコルは、エントチアペプシンの48の沈着のうち47について得ることができました。これらはすべて、Moews and Bunn (1970)46によって行われたエンドチアペプシンの最初の結晶化に大まかに基づいていました。これらの条件の類似性とそれらの「古典的な」起源を考慮して、96ウェルの蒸気拡散スパースマトリックススクリーンを実行して、より多様な結晶化条件を調査しました。エンドチアペプシンを70 mg/mLまで濃縮し、PACTスパースマトリックススクリーン47 を96ウェルシッティングドロッププレート中で20°Cで実施し、100 nLのタンパク質と100 nLのウェル溶液を混合しました。36時間後のこの実験からのすべての条件は結晶を生じさせた。しかし、結晶形態の分析は、いくつかの条件が微小結晶化の最適化に適していることを証明するかもしれないことを示しました。 図4A は、プレートの大部分で観察されたものを広く代表するPACTスクリーンからのドロップを示しています。一見すると、これらの結晶は微小結晶化のためにさらに最適化する価値があるかもしれないと考えたくなるかもしれません。結晶は大きく、かなりの核生成があるようです。しかしながら、全体的な結晶形態は理想的ではない。第一に、複数の結晶が単一の核形成点から成長しているように見えるため、結晶は観察可能なシングルトンではありません。第二に、結晶サイズは非常に非対称であり、成長は主に単一軸を下って発生します。このような結晶は、理論的には、X線ビームに送達されたときに優先的に整列する可能性が高い。どちらの特性も、シリアル結晶学的データの収集および処理中に問題を提示します。 しかしながら、図4Bは、MgCl2の存在下で成長したエンドチアペプシン結晶を示す。この形態は、MgCl2を含むすべての条件で一貫していたため、それらの形態はMgCl2によるものであることが示唆されました。MgCl2条件は、究極の連続実験のためのより良い標的を表す単一の、より箱のような結晶を生成した。 PACTスクリーン内には、MgCl2を含む4つの条件がありました。エンドチアペプシン結晶化に対するこれらの条件のすべての異なる成分の影響をよりよく理解するために、ランダム最適化を実行しました。緩衝液と沈殿剤をさまざまな濃度およびpHでランダムに組み合わせたスクリーンを作成しました。MgCl2 濃度も変化させ、得られた液滴を、視覚的な結晶品質と沈殿レベルの観点から、0〜5(0は結晶または沈殿なし)から任意に等級付けしました。 図5A は、降水レベルと結晶品質、およびスクリーン変数との間のピアソンの相関分析の結果のヒートマップを示しています(この実験からの低下の例は 図5B、 C 、 およびDに示されています)。その結果,溶液のpHは沈殿量と高い相関があり,アルカリ性緩衝液は沈殿量を増加させることが示された。MgCl2 濃度は、結晶品質に対するpHおよび沈殿剤濃度と同様に、沈殿レベルとわずかに相関していた。 これらの結果に基づいて、0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2、20%(w / v)PEG 6,000で成長させた結晶をプロトコルの次のステップであるバッチに移行することを決定しました。結晶の形態は許容範囲であり、これらの結晶からのX線回折およびデータ品質メトリックの分析は、Mg2+ の存在下で成長した結晶の間に有意差がないことを示唆した(図9)。 バッチへの移行多くのシリアル結晶構造解析のマイクロ結晶化の最適化では、ステップ2が出発点になります。目的のタンパク質はすでにクライオ結晶構造解析のために結晶化されており、結晶化プロトコルは微結晶スラリーを作成するために変換する必要があります。このプロトコルでは、蒸気拡散がPDBエントリ26の95%で使用されている結晶化方法であるため、バッチへの変換を実行するために96ウェル蒸気拡散プレートのみを使用しています。プロトコルは、この移行によって同様の最適化が発生する可能性があるため、マイクロバッチ34、35、37への移行を回避しています。これは、このプロトコルが蒸気拡散プレートでのみ実行できるということではありません。提示されたすべてのステップは、これが元の結晶化方法である場合、マイクロバッチでも機能します。 選択された条件におけるエンドチアペプシンの結晶化を評価するために、モルフォグラム – または大まかな状態図 – が作成された。モルフォグラム実験の目的は3つあります。まず、モルフォグラムの分析は、ステップ3 – スケーリングでスケーリングルートを評価するときに非常に役立ちます。第二に、モルフォグラムは最適化ツールとして機能し、バッチ(すなわち、急速に現れる結晶(<24時間))を介して結晶を生じる蒸気拡散条件を発見するのに役立ちます。第三に、結晶が急速に現れていない場合、播種された液滴の分析により、結晶学者は相図上の現在の状態のおおよその位置を知ることができます。たとえば、播種条件が結晶を与えるが、播種されていない条件が結晶を与えない場合、それらの条件は準安定領域にある可能性があります。 エンドチアペプシンのモルフォグラム実験は、0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2、20%(w / v)PEG 6,000条件に基づいて実施されました。タンパク質およびPEG濃度は、それぞれ100〜12.5 mg / mLおよび5〜40%(w / v)の範囲で変化しました。滴を分析し、提供されたワークシートを使用して結果をプロットした(図6A)。 また、結晶 形態の最適化 段階から、この条件で、これらのタンパク質濃度でのエンドチアペプシンの結晶成長は、24時間以内に結晶成長をもたらすこともすでに明らかでした。これは、結晶化が蒸気拡散駆動プロセスではなくバッチ を介して 発生していることを示していました。したがって、これらの条件で成長した結晶は、より大きな体積へのスケーリングに適していました。 24時間後に非播種液滴に結晶が見えなかった場合、結晶化は依然として遷移に依存しており(図1B)、したがってバッチに依存していない可能性があります。この場合、モルフォグラム実験の結果は依然として興味深いものです。それらは、相図上の結晶化の推定開始点を示し、したがって、その後の最適化がどのように進むべきかを示します。種をまいた滴を見てください。シードは、核生成に関係なく、準安定領域での結晶成長を可能にします。たとえば、播種された液滴では24時間以内に結晶が現れ、播種されていない液滴では現れない場合、これは準安定領域の一部が観察されることを示しています。シード液滴または非シード液滴のいずれにも結晶が観察されない場合、すべてのウェルは低飽和のままである。 スケーリングモルフォグラム(図6A)を見ると、いくつかの観察を行うことができました。核生成の量は、タンパク質濃度と沈殿物濃度の両方に影響されるようでした。また、タンパク質の沈殿につながる液滴の非常に明確な境界があり、液滴には何も含まれていないか、結晶または沈殿物が含まれていました(図6B)。種子の添加(図6D)はまた、種子なしの滴(図6C)と比較してXnを大幅に増加させた。これらすべての結果をまとめて、バッチプロトコルとシードバッチプロトコルの両方を30%(w / v)PEG 6,000および100 mg / mLエンドチアペプシンでスケーリングすることを試みることが決定されました。 最初のテストスケーリングは、24ウェルハンギングドロッププレートで行われました。結晶化挙動の変化を観察できるように、液滴量を徐々に増加させました(図7)。図からわかるように、非播種液滴と播種液滴の両方で結晶成長が起こっていた。播種されていないすべての液滴は、さまざまな結晶サイズを成長させましたが、主に大きな結晶(100〜200μm-最長寸法)でした。しかし、播種された液滴は、より小さな結晶(5〜50μm-最長寸法)を生成しました。これらの初期テストは、種子がXsを減らすために必要であることを示唆しましたが、この条件はより大きなボリュームに適しているはずであることも示唆しました。 体積を200μLに増加させると、結晶成長中に結晶化体積が連続的に攪拌された。この攪拌の主な理由は、結晶化溶液が均質なままであり、成長する結晶がチューブの底部または側面に沈殿しないようにするためでした。結晶の沈降は、非常に大きな結晶と小さな結晶の両方を持つ不均一な結晶集団につながる可能性があります。結晶化溶液を攪拌することは、核生成を促進することもできる44、45。 残念ながら、播種されていない30%(w / v)のPEG 6,000では結晶が生成されなかったため、PEG濃度は35%(w / v)に増加しました。この増加により結晶化が著しく改善され、最終的なXnとXsの範囲はそれぞれ3.6 ± 1.2 x 106結晶・mL-1と42 ± 4.1 μmになりました(図8AとB-黒)。大幅な改善と許容可能な結晶濃度でしたが、最終的な結晶は計画された実験には大きすぎたため、さらなる最適化が行われました。最終結晶のサイズを小さくするために、タンパク質濃度を下げて最終的な結晶成長を制限すること(図8AおよびB-ホットピンク)、およびPEG濃度を上げて核生成を増加させること(図8AおよびB-緑)の2つの方法が検討されました。 残念ながら、タンパク質濃度の低下はXnも劇的に減少させ、最終的にはさらに大きな結晶を生成しました。PEG濃度を40%に上げると、最終的なX、n、Xsの範囲はそれぞれ3.1 ± 0.7 x 106結晶・mL-1および39 ± 2.3 μmになりました。これらは35%と有意差はありませんでしたが、最終的な結晶サイズが小さくなったため、この条件をさらに最適化して継続しました。 Xnを増加させるために、種子を添加した。これにより、Xn(1.1 ± 1.8 x 108結晶・mL-1)が劇的に増加し、Xsが小さくなりました(4.2 ± 4.0 μm)(図8AおよびB-紫色の破線)。これらの結晶は、いくつかの連続結晶構造解析実験に非常に適していますが、小さすぎると見なされたため、添加されたシードの濃度が変更されました。 しかし、追加された種子ストックのこの調整は、確実に繰り返すことが困難であることが判明しました。そのため、急冷を試みた。シードストックの添加後、結晶サイズをモニターし、適切な結晶サイズ(約10〜20μm)が達成されたら、バッチ結晶化を急冷した(図8C および D)。急冷は、微小結晶化に関して、Kupitz et al. (2014)25で提案されている。おそらく理想的な方法ではないが、タンパク質溶液は最終的に無駄になるので26、結晶成長を制御することが困難であったため、この技術はこの状況で非常に有用であった。急冷の背後にある考え方は、結晶化混合物を溶解度線のすぐ上の点に迅速に戻すことです(図1F)。溶液が溶解度ラインに戻ると、溶液は安定した飽和溶液に戻り、それ以上の結晶成長は起こりません。 結晶化反応をクエンチしようとすることにはリスクがないわけではありません。添加するクエンチング溶液が多すぎると、溶液中のタンパク質が溶解度線を通過するほど希釈される可能性があります。この場合、溶液は過飽和になり、結晶は溶解し始めます。これを防止するために、モルフォグラムの結果に基づいて必要な急冷溶液の量を推定することができる。急冷の時点で、タンパク質溶液の濃度を取ります。溶解度線でのタンパク質濃度と溶液中のタンパク質濃度を比較することにより、必要な希釈率を推定できます。 40%(w / v)PEG 6,000、10 x希釈シード実験の急冷バージョンでは、最終的な結晶濃度とサイズ範囲は、それぞれ2.6 ± 3.1 x 106 結晶・mL-1 および15 ± 3.9 μmでした。 プロセス全体を通して、エンドチアペプシン結晶の試験X線データを収集し、スイス光源PXIIビームラインで、10 x 30 μmの焦点、80%減衰した12.4 keVのエネルギー、および低温条件下で収集しました。データはダイヤルを使用して処理され、 図9 はCC1/2の比較を示しています。最適化の過程でCC1/2 の劇的な変化は観察されませんでした。 図1:転移結晶化とバッチ結晶化の概要、および相図にマッピングされたスケーリング方法。 A.いいえ。原型タンパク質結晶化のゾーンと限界 状態図。沈殿剤とタンパク質の濃度は、純水を原点として、それぞれx軸とy軸にプロットされます。紫色の線はタンパク質の過飽和境界を示し、準安定、核生成、沈殿帯はそれぞれ青、緑、ピンクで示されています。イ.蒸気拡散などの’遷移相’結晶化法の核生成帯浸透限界の一例。この理論的実験では、滴下沈殿剤とタンパク質濃度は溶解度線のすぐ下で始まります-まだ過飽和ではありません。液滴が平衡化している間、液滴成分の濃度は上昇し、液滴が過飽和になり、核生成ゾーンに移動し続けます。結晶核形成により、溶液中のタンパク質濃度は低下し始める。濃度は、結晶が成長するにつれて低下し続け、最終的に溶解度線で停止します。青い点線は、核生成帯への移行の理論的限界を示しています。核形成が始まるとすぐに、タンパク質濃度は低下し、それ以上の浸透を防ぎます。ウ. バッチおよびシードバッチ結晶化軌道の例。バッチでは、タンパク質と沈殿剤の混合は、結晶成長が起こることができるように、核生成ゾーン内に過飽和溶液を生成する必要があります。シードバッチでは、マイクロシードの添加により核生成ゾーンにいる必要は厳密にはないため、準安定領域の場所も探索できます。D.Bに示す結晶化実験の蒸気拡散からバッチへの仮想的な最適化。元の蒸気拡散開始点は、結果の最適化ベクトルを介して新しい開始位置に遷移しました。核生成帯の内側。結果として得られるベクターは、タンパク質濃度と沈殿剤濃度の両方の増加という2つの最適化の産物です。E.バッチ条件をスケーリングして最終的な Xn と Xs を調整する場合の最適化の例。F.結晶化バッファーの添加による結晶化実験の急冷。クエンチは、タンパク質濃度を準安定領域から取り出さず、したがってタンパク質過飽和点を下回らないことが不可欠です。そうしないと、結晶が溶液に溶解し始めます。イ. およびC.は、著者の許可を得てBeale et al. (2019)26から改作されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:Xnの増加とXsの減少。 結晶化実験から生成された結晶の数とその平均最長寸法との間の理想的な関係。このグラフを作成するために、仮想の10 kDaモデルタンパク質の結晶化を使用しました。タンパク質は10 mg/mLの濃度で結晶化し、49x50x51 Åの寸法のP21 2 1 21結晶を生成しました。すべての核生成イベントは結晶を生成すると仮定されました。結晶成長はすべての面から均質であると仮定した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:小容量( 100 μL)のバッチ実験に最適化する手順を示すフローチャート。 結晶の最適化は、(1)結晶形態の最適化の3つの段階に分けられます。(2)バッチへの移行。(3)スケーリング。ステージ1では、微小結晶化に適した結晶を特定することが重要です。一部のタンパク質は、結晶化条件に関係なく単結晶形態でのみ存在します。ただし、単一の立方体のような結晶、または人間が可能な限りこれらに近い条件を探す価値があります。単一の立方体のような結晶は、仮説的および逸話的に、一般に、連続結晶学実験からより良い結果をもたらします。結晶形態を選択し、回折を確認したら、結晶化実験を蒸気拡散からバッチ(ステージ2)に移行する必要があります。ここで、結晶は核生成時間によって最適化されるべきである。目標は、急速に現れる結晶(> 24時間)を生成する条件を見つけることです これらの条件はすぐに核生成ゾーンに当たる可能性があり、したがってバッチです。核生成帯の条件が見つかると、モルフォグラムを作成できます。モルフォグラムにより、核生成ゾーンの大部分が、ステージ3で特定されたマッピングされた潜在的なスケーリングルートが可能になります。同定されたバッチ条件の容量は、徐々にまたは急速にサイズをスケーリングして、>100 μLの最終容量を得ることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:PACTスパースマトリックススクリーンからのエンドチアペプシン結晶化条件の分析。 A .および B. は、それぞれPACTスクリーンからのウェルA4およびC10の24時間後の写真である。結晶化バッファー成分は図上で強調表示されています。SPGバッファーは、コハク酸、リン酸二水素ナトリウム、およびグリシンを2:7:7のモル比で混合したものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:PACTMgCl2条件からのエンドチアペプシン結晶化最適化の解析。 A.いいえ。バッファーのpH、MgCl2濃度、沈殿剤濃度と沈殿レベルおよび結晶品質との間のピアソンの相関分析の結果のヒートマップ。沈殿レベルと結晶品質は、24時間後に0〜5のスケールで任意に評価されました(0は結晶または沈殿なし)。D.は、3つの異なる液滴における結晶化および沈殿の例を示す。結晶化条件と沈殿レベルと結晶品質の評価も示されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図6:0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2およびPEG 6,000で結晶化したときのエンドチアペプシンモルフォグラム。 A.いいえ。提供された「相図ジェネレータ」スプレッドシートから作成されたモルフォグラム。各液滴中の結晶の相対数は円の大きさで示され、滴1(タンパク質および沈殿剤)および滴2(タンパク質、沈殿剤および種子)の結果はそれぞれ緑および青で強調表示される。x軸とy軸のタンパク質濃度と沈殿剤濃度の値は、それぞれ最終体積ではなく、それぞれの事前混合値を示します。この結果に基づき、核生成帯と準安定帯の境界をそれぞれ示すために黒線と紫線が引かれました。紀元前 D.は実験の結果の例をいくつか示しています。A.にマークされた赤と青の点は、B.とC.の位置を示しています。 とD.、それぞれ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図7:24ウェルハンギングドロッププレートでのエンドチアペプシンの初期スケーリング試験。 すべてのトレイルで同じタンパク質および沈殿剤濃度を使用しました:0.1 M Na 酢酸pH 4.6および0.1 M Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2、および30%(w / v)PEG 6,000中の100 mg/mLエンドチアペプシン。表示されたすべての画像は24時間後に撮影されたもので、最終的なドロップボリュームは各画像にラベル付けされています。左のパネル(A、 D、および G)はタンパク質と沈殿剤の1:1の混合物であり、中央のパネル(B、 E、 およびH)は種子、沈殿剤、およびタンパク質の1:2:3の混合物であり、右のパネル(C、 F、 およびI)は中央のパネルの拡大画像です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図8:200〜300 μLの容量でのエンドチアペプシン微小結晶化の分析。 A.およびC.は、実験時間にわたってXnがどのように変化したかを示す。イ. D.は、Xs(最長次元)が時間とともにどのように変化したかを示しています。実験の結果は、わかりやすくするために分離されています。C.とD.の赤い点線は、急冷が行われたポイントを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図9:回折品質を評価するための微結晶化プロセスの各段階で得られた結晶のCC1/2結果と画像。 A.いいえ。成長した結晶から収集されたデータからの分解能に対してプロットされたCC1/2:Mgの有無-ステージ1の最適化の一部、200 nL容量、10 μL容量、および最終300 μL容量。B.C.およびD.は、それぞれ200nL、10μLおよび300μLの容量からの結晶を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 タンパク質情報 蛋白質 エンドチアペプシン 分子量(kDa) 33.8 スペースグループ P12 11 a, b, c (Å) 45.2, 73.3, 52.7 α, β, ɣ (°) 90.0, 109.2, 90.0 固定ターゲット パラメーター チップあたりの負荷量(μL) 150 チップあたりのアペラチャ 25,600 必要結晶濃度(結晶/mL) 500,000 サンプル情報 200 μLのサンプルを作るのに使用したタンパク質量(mg) 10 結晶最長寸法(μm) 15 結晶濃度(結晶/mL) 2,500,000 実験変数 必要な時間ポイントの数 5 時点ごとに必要な画像の数 50,000 ヒット率(統合されたパターン/画像が収集されます) 0.3 時点ごとに必要な固定目標 (切り上げ) 7 サンプル要件 時点ごとに必要なサンプル量(μL) 1,050 実験に必要な総サンプル量(mL) 5.25 必要なタンパク質の総質量(mg) 52.5 表1:固定ターゲットを使用して実行された架空の光ポンププローブ実験のサンプル要件の例。この理論実験で使用したタンパク質はエンドチアペプシンでした。固定ターゲットパラメータは、Ebrahim et al. (2019)48およびDavy et al. (2019)49で報告された実験に基づいている。サンプル情報は、このビデオ記事で報告されたプロトコルからのものであり、実験変数は、実際の経験に基づく控えめな推定値でした。以下のサンプル要件は、前述の仮定を考慮して後で計算されました。