Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

John  H. Beale; May E. Marsh

doi:10.3791/61896

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي

Published: February 04, 2021

doi:

10.3791/61896

John H. Beale¹, May E. Marsh¹

¹Swiss Light Source,Paul Scherrer Institut

Summary

الهدف من هذه المقالة هو إعطاء المشاهد فهما قويا لكيفية تحويل بروتوكول انتشار البخار صغير الحجم ، لزراعة بلورات بروتينية كبيرة مفردة ، إلى طريقة تبلور دقيق دفعة كبيرة الحجم لعلم البلورات التسلسلي.

Abstract

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتسهيل إنشاء كميات كبيرة (> 100 ميكرولتر) من الملاط البلوري الدقيق المناسب لتجارب علم البلورات التسلسلي في كل من السنكروترونات و XFELs. تعتمد الطريقة على فهم مخطط الطور البلوري للبروتين ، وكيف يمكن استخدام هذه المعرفة. تنقسم الطريقة إلى ثلاث مراحل: (1) تحسين التشكل البلوري ، (2) الانتقال إلى الدفعة ، و (3) التحجيم. تتضمن المرحلة 1 العثور على بلورات مفردة حيود بشكل جيد ، نأمل ولكن ليس بالضرورة ، في شكل يشبه المكعب. في المرحلة 2 ، يتم تحسين حالة المرحلة 1 من خلال وقت نمو البلورة. يمكن لهذه الاستراتيجية تحويل البلورات المزروعة عن طريق انتشار البخار إلى دفعة. بمجرد أن يحدث نمو بلوري في غضون 24 ساعة تقريبا ، يمكن رسم مورفوجرام للبروتين وخليط الراسب واستخدامه كأساس لاستراتيجية التحجيم (المرحلة 3). عندما يمكن زراعة البلورات دفعة واحدة ، يمكن محاولة التحجيم ، وتحسين حجم البلورة وتركيزها مع زيادة الحجم. تم استخدام Endothiapepsin كبروتين توضيحي لهذا البروتوكول. بعض القرارات المقدمة خاصة بالإندوثيابسين. ومع ذلك ، من المأمول أن تلهم الطريقة التي تم تطبيقها بها طريقة للتفكير في هذا الإجراء يمكن للآخرين تكييفها مع مشاريعهم الخاصة.

Introduction

درجة حرارة الغرفة (RT) علم البلورات الجزيئية شعبية مرة أخرى في مجتمع البيولوجيا الهيكلية. حفز تطوير مصادر ضوء ليزر الإلكترون الخالي من الأشعة السينية (XFEL) تطوير طرق توصيل عينات RT¹،²،³،⁴ ، وقد تم تطبيق هذه الطرق الآن على السنكروترونات⁵،⁶،⁷^،⁸. لا تفتح طرق RT فقط إمكانية وجود خيوط تجريبية لمسبار المضخة⁹،10،11،12 ، ولكن هناك أيضا أدلة متزايدة على أنها تعزز حالات مطابقة بديلة داخل البروتينات 13،¹⁴،15،¹⁶^،¹⁷.

ومع ذلك ، فإن السبب الرئيسي وراء اكتساب طرق التبريد قوة جذب على نهج RT في أواخر تسعينيات القرن العشرين كان تباطؤ الضرر الإشعاعي بسبب درجات حرارة الكريستال دون الصفر¹⁸. بدأت طرق التبريد¹⁹ في السماح بجمع مجموعة بيانات كاملة من بلورة بروتين واحدة. حلت طرق RT الحديثة في XFELs والسنكروترونات مشكلة تلف الإشعاع أحادي البلورة من خلال تطوير استراتيجيات توصيل بلورية سريعة (> 100 هرتز)¹،²،³^،⁴. تسمح هذه الطرق بجمع مجموعة بيانات كاملة من آلاف البلورات المكشوفة بشكل فردي. لذلك تتطلب مناهج توصيل RT هذه إنتاج كميات كبيرة من المحاليل التي تحتوي على بلورات دقيقة متجانسة (> 100 ميكرولتر من بلورات < 50 ميكرومتر). ومع ذلك ، نظرا لأن طرق التبريد تميل إلى طلب بلورات مفردة فقط ، فإن طرق إنشاء مثل هذه الملاط البلوري الدقيق ليست موجودة حاليا في كل مكان عبر مختبرات علم بلورات البروتين.

هناك أمثلة في الأدبيات حول كيفية القيام بأجزاء من إجراء تحسين التبلور الدقيق لعينات علم البلورات التسلسلي. هنا ، يجب التمييز بين الغشاء والبروتينات القابلة للذوبان. تم وصف بروتوكولات تحسين نمو بلورات البروتين الغشائية الدقيقة المزروعة في monoolein (أو بعض الدهون الأخرى) ، للمرحلة المكعبة الدهنية (LCP) ، بشكل جيد²⁰،²¹^،²². ومع ذلك ، فإن طرق التبلور الدقيق للبروتينات القابلة للذوبان ، بما في ذلك البروتينات الغشائية المزروعة في ظروف غير LCP ، غير موجودة بشكل عام. ركزت الدراسات السابقة على أجزاء محددة من العملية ، مثل فحص البلورات الدقيقة ^23,24 ، وتعزيز التنوي ²⁴ ، والقياس باستخدام انتشار الواجهة الحرة²⁵ ، ولكن ليس طريقة كاملة.

ومع ذلك ، تم وصف طريقة مؤخرا²⁶ تحاول تقديم بروتوكول كامل. مثل العديد من جوانب علم بلورات البروتين ، فهي ليست جديدة. وقد وصف رايمنت (2002)²⁷ بالفعل العديد من الأفكار المقترحة. تهدف الطريقة إلى إظهار علماء البلورات كيفية إجراء التحويل من بلورة واحدة نمت باستخدام انتشار البخار ، إلى منهجية دفعية لزراعة الآلاف من البلورات الدقيقة. تركز الطريقة على انتشار البخار كنقطة انطلاق مشتركة ، حيث أن 95٪ من جميع ترسبات بنك بيانات البروتين (PDB) تأتي من بلورات تزرع في ألواح انتشار البخار²⁶. ومع ذلك ، فإن انتشار البخار ليس الطريقة المثالية للتبلور الدقيق²⁶ ، لذلك يتم وصف منهجية لتحويل انتشار البخار إلى بلورة دفعية. بمجرد أن يمكن زراعة البلورات دفعة واحدة ، يصبح توسيع المسارات إلى أحجام أكبر أكثر قابلية للتطبيق. بالنظر إلى تقلبات تبلور البروتين ، يؤكد المؤلفون أن هذه الطريقة ليست آمنة من الفشل. ومع ذلك ، يجب أن يوفر البروتوكول ، على الأقل ، نظرة ثاقبة على “مساحة التبلور” للبروتين.

تعتمد هذه الطريقة على مخطط مرحلة بلورة البروتين وكيف يمكن أن يكون فهم هذا المخطط بمثابة دليل أثناء تحسين التبلور الدقيق. عادة ما يتم تصوير مخطط طور البروتين على أنه مخطط x / y مع تركيزات المرسب والبروتين على المحورين x و y ، على التوالي (الشكل 1A). من نقطة الماء النقي (الزاوية اليسرى السفلية – الشكل 1 أ) ، يزداد تركيز كل من البروتين والراسب حتى يتم الوصول إلى خط الذوبان. يشير خط الذوبان إلى نقطة التشبع الفائق (الخط الأرجواني – الشكل 1 أ). عندما يكون البروتين مفرط التشبع ، يصبح المحلول غير مستقر ديناميكيا حراريا وسيبدأ في الانفصال إلى مرحلتين: “غني بالبروتين” ومحلول مشبع مستقر. يمكن أن يحدث هذا الفصل في أي مكان خارج خط الذوبانية وتعتمد حركيته على خصائص البروتين ومكونات المحلول.

عندما يكون البروتين وتركيزات المرسب كبيرة جدا ، سوف يتحلل البروتين بشكل غير مستقر من المحلول وينتج عنه راسب غير متبلور (المنطقة الوردية – الشكل 1 أ). ومع ذلك ، يمكن أن يحدث فصل الطور المرتب في منطقة النواة [انظر Garcia-Ruiz (2003) ²⁸ للحصول على وصف مفصل] والنيوكليات البلورية لديها ميل للتكوين (المنطقة الخضراء – الشكل 1 أ). يزيل التنوي والنمو البروتين من المحلول وينقلان الهبوط إلى المنطقة شبه المستقرة حيث يمكن أن يستمر النمو حتى يتم الوصول إلى خط الذوبان [انظر McPherson and Kuznetsov (2014) ²⁹ لمناقشة مفصلة]. الرسم البياني هو ، بالنسبة للغالبية العظمى من ظروف التبلور ، تبسيط مفرط^{إجمالي 30}. بغض النظر عن هذا ، لا يزال الرسم البياني ذا فائدة كبيرة لعلماء البلورات الدقيقة لأن تعيين الرسم البياني يسمح بتحديد خط الذوبان وحركية النواة.

من حيث إنشاء بلورات دقيقة ، فإن العاملين أثناء التبلور اللذين يحتاجان إلى تحسين هما عدد البلورات (X_n) ومتوسطها الأطول بعدا (X_s). X n سيكون متناسبا مع عدد أحداث التنوي (_n ) (مكافئ 1).

مكافئ 1

X s يتناسب مع تركيز البروتين الحر فوق خط الذوبان (P_s) مقسوما على X_n (مكافئ 2).

مكافئ 2

في الوضع المثالي ، سينتج عن كل حدث نواة بلورة محتملة وكل واحدة من هذه البلورات ، سيكون لها وصول متساو إلى البروتين المتاح في المحلول. الشكل 2 هو تمثيل رسومي من سيناريو مثالي للعلاقة بين X_n و X_s. من الناحية العملية ، فإن التحكم الرئيسي الذي يمتلكه عالم البلورات على X_n و X_s هو التأثير على كمية النوى أو عن طريق إضافة بلورات البذور. يجب أن يحكم عالم البلورات الدقيقة على كيفية زيادة X_n بحيث يمكن إنشاء تركيز بلوري مناسب وحجم بلوري.

تتطلب غالبية تقنيات التبلور “فترة انتقالية” (الشكل 1 ب). على سبيل المثال ، في تجربة انتشار البخار ، عند خلط البروتين والمحاليل المرسبة ، ستتغير تركيزات كل منهما مع توازن القطرة مع محلول البئر. يأمل المرء أن تؤدي هذه التغييرات إلى نقل الانخفاض تدريجيا إلى منطقة النواة حيث سيزداد الميل إلى التبلور. عندما تبدأ البلورات في النواة والنمو ، ستبدأ كمية البروتين في المحلول في الانخفاض ، مما يقلل من احتمال حدوث المزيد من النواة. ستكون الكمية النهائية من التنوي محددة البروتين والحالة ، وتعتمد أيضا على عمق الاختراق في منطقة النواة. بالنظر إلى الاختراق المحدود لمنطقة التنوي للطرق التي تتطلب خطوة انتقالية ، فإن مستوى التنوي سيقتصر في النهاية على معدل التنوي عند حدود منطقة التنوي شبه المستقرة.

نظرا لأهمية القدرة على تحسين مستوى التنوي لعالم البلورات الدقيقة ، من المهم الانتقال إلى منهجية تبلور الدفعات. يمكن أن تستفيد الدفعة بشكل أكبر من منطقة التنوي بأكملها (الشكل 1C). في طرق الدفعات ، تتمثل الفكرة في خلط البروتين والراسب معا بحيث يتم إنشاء محلول مفرط التشبع دون الحاجة إلى أي تغييرات في تركيزات المكونات. يجب أن تكون النواة ممكنة فور الخلط. لذلك تسمح طرق الدفعات بالوصول إلى منطقة التنوي بأكملها نظريا. يمكن بعد ذلك استخدام أي زيادة في حركية التنوي تتجاوز حدود النوى المستقرة.

إذا لم يكن المستوى القاعدي للنواة البلورية كافيا لتوليد X_n كبير ، فيمكن استخدام طرق البذر الدقيق. في البذر الدقيق ، يتم تكسير البلورات المزروعة مسبقا لإنشاء ملاط من الشظايا البلورية التي يمكن أن تكون بمثابة سقالة لنمو البلورات الطازجة^31,32. تم استخدام البذر الدقيق على نطاق واسع في تحضير العينات البلورية التسلسلية كطريقة لزيادة X_n دون الحاجة إلى زيادة النوى البلورية (الشكل 1C).

يمكن تصور الانتقال من الانتشار البخاري إلى الدفعة على مخطط الطور على أنه نقل نقطة البداية التجريبية من المناطق غير المشبعة أو شبه المستقرة إلى منطقة النواة. يمكن القيام بذلك عن طريق زيادة تركيزات البروتين و / أو المرسب ، و / أو نسبة الاثنين داخل القطرة (الشكل 1 د) ، ومراقبة الظروف التي تنتج بلورات تظهر بسرعة (< 24 ساعة)²⁶. يمكن أن يستغرق التوازن الكامل لانخفاض انتشار البخار أياما أو أسابيع³³. لذلك ، من خلال البحث عن الظروف التي تظهر بلورات سريعة الظهور ، يمكن العثور على ظروف الدفعات دون الحاجة إلى الانتقال إلى تنسيقات فحص التبلور البديلة مثل الدفعة الدقيقة³⁴،³⁵،³⁶^،³⁷.

بمجرد العثور على منطقة التنوي ، تم العثور على حالة دفعة ويمكن إنشاء مورفوغرام – هنا ، مخطط طور تقريبي. يعد الرسم البياني ذا فائدة كبيرة عند التفكير فيما إذا كان سيتم استخدام بروتوكول دفعة مصنفة أو دفعة مستقيمة. من خلال رسم X_n كدالة للبروتين وتركيز الراسب ، يمكن إجراء تقييم لحركية التنوي²⁶. إذا ظل X n منخفضا عبر منطقة التنوي بأكملها ، فقد تكون هناك حاجة إلى دفعة مصنفة لجعل X_n كبيرا بما يكفي للحد من نمو البلورات. هذا التقييم هو الخطوة الأولى في عملية التوسع إلى أحجام أكبر (> 100 ميكرولتر).

تم تصميم هذه الطريقة بحيث يمكن إجراؤها في غالبية مختبرات التبلور باستخدام معدات بلورة انتشار البخار القياسية. كما أجريت العديد من الدراسات التي تصف التقنيات لتسهيل أجزاء كثيرة من هذه العملية ، إذا كانت المعدات متوفرة. وتشمل هذه ، على سبيل المثال لا الحصر ، تشتت الضوء الديناميكي (DLS) 25،27 ، والتصوير غير الخطي 20،24،²⁵ ، وحيود المسحوق 20،24،27 ^، والمجهر الإلكتروني 26 [انظر Cheng et al. (²⁰²⁰) ⁴⁰ للحصول على مراجعة لطيفة].

الهدف من هذا العمل هو تقديم عرض مرئي لطريقة الانتقال من تبلور انتشار البخار صغير الحجم ( 100 ميكرولتر). تم استخدام Endothiapepsin من Cryphonectria parasitica كنظام مثال لتوضيح هذه الترجمة. سيؤثر نوع التجربة وطريقة تسليم العينات المطلوبة للبلورات الدقيقة على ناتج X^{s المثالي 26}. بالنسبة لتجارب الخلط التي تتطلب دقة زمنية ميلي^{ثانية 41} أو فوهات افتراضية ديناميكية للغاز⁴² ، قد يكون من المرغوب فيه الحصول على X_s نهائي يبلغ < 5 ميكرومتر. في هذه الحالة ، كان الهدف هو إنتاج بلورات بروتينية تنحرف إلى حوالي 1.5 Å ، لتجربة مسبار المضخة المنشط بالفوتون ، واستخدام نهج توصيل الهدف الثابت.

لإعطاء توضيح لمتطلبات العينة لتجربة علم البلورات التسلسلية هذه باستخدام endothiapepsin ، يوضح الجدول 1 المعلمات التجريبية لتجربة افتراضية. استندت معلومات العينة إلى البروتوكول الموضح أدناه. بالنظر إلى بعض التقديرات المتحفظة حول معدلات الإصابة ومتطلبات جمع البيانات ، فإن 50 مجم هو إجمالي تقدير استهلاك العينة للتجربة بأكملها.

يوضح الشكل 3 مخططا انسيابيا لعملية التحسين الكاملة من تبلور انتشار البخار الأولي صغير الحجم إلى الدفعة واسعة النطاق. بالنسبة لغالبية مشاريع علم البلورات التسلسلي ، سيبدأ هذا البروتوكول في الخطوة 2: “الانتقال إلى الدفعة” ، حيث أن البروتين المستهدف سيكون قد تبلور بالفعل. ومع ذلك ، تم تضمين الخطوة 1 للتأكد من اكتمالها ولتذكير القراء بأهميتها. إن العثور على حالة تؤدي إلى حيود جيد ، بلورة مفردة ، كبيرة هو أفضل نقطة انطلاق لتحسين البلورات الدقيقة. في الخطوة 2 ، يمكن بعد ذلك تحسين هذه الحالة من انتشار البخار إلى الدفعة ، ويمكن رسم مورفوغرام للمناطق النواة وشبه المستقرة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، يمكن إجراء تغيير حجم حالة الدفعات إلى أحجام أكبر في الخطوة 3. بحلول نهاية المخطط الانسيابي ، سيكون عالم البلورات قد أنشأ بروتوكولا قابلا للتكرار ، كبير الحجم (> 100 ميكرولتر) ، تبلور دقيق ، بروتوكول دفعي للإندوثيابسين. يمكن بعد ذلك تطبيق هذه الطريقة على البروتين الخاص الذي يهمهم.

Protocol

ملاحظة: تم إعداد جميع تجارب التبلور بالجلوس والإسقاط البالغ عددها 96 بئرا باستخدام ألواح 2 أو 3 قطرات. تم استخدام روبوت مناولة السوائل وتصوير التبلور / الفندق لتسهيل إعداد ومراقبة جميع شاشات الآبار البالغ عددها 96 بئرا. يتم إعطاء جميع تركيزات الكاشف لتجارب التبلور بتركيزاتها الأولية قبل الخلط. 1. تحسين مورفولوجيا الكريستال ملاحظة: الخطوات 1.1.1. و 1.1.6. وصف كيفية العثور على ظروف تبلور الإندوثياببسين، وكيف تم تحسين هذه الظروف لإيجاد حالة واحدة تنتج بلورات مفردة جيدة الحيود تحسين المصفوفة المتفرقة تحضير محلول إندوثيابسين طازج.ملاحظة: يجب نقل الإندوثيابسين ، عند شرائه باسم Superan 600 ، إلى المخزن المؤقت من محلول التخزين الخاص به وتركيزه.تحضير 3 لتر من 0.1 M Na Acetate pH 4.6 عند 4 درجات مئوية. قطع 20 سم من أنابيب غسيل الكلى ويغسل لفترة وجيزة في العازلة. أغلق أحد طرفي الأنبوب باستخدام مشبك ، ضع 50 مل من محلول endothiapepsin في الأنبوب ثم أغلق الطرف الآخر. اترك المحلول لغسيل الكلى لمدة 4 ساعات على الأقل (أو طوال الليل) عند 4 درجات مئوية في 1 لتر من محلول خلات الصوديوم. نظرا لمكونات المخزن المؤقت للتخزين ، سيكون المحلول الموجود في كيس غسيل الكلى الآن حوالي 100 مل. انقل كيس غسيل الكلى الذي يحتوي على الإندوثيابسين إلى لتر طازج من 4 درجات مئوية ، 0.1 م Na Acetate pH 4.6. كرر هذه الخطوة مرة أخرى بحيث يتم تخفيف المخزن المؤقت الأصلي 2000x مقابل Na Acetate. سيكون الإندوثياببسين الآن عند حوالي 10 مجم / مل. ركز حتى 100 مجم / مل باستخدام مكثف طرد مركزي 10 كيلو دالتون وجهاز طرد مركزي. قم بتبريد محلول endothiapepsin في النيتروجين السائل في 50 ميكرولتر من القسامات وتخزينها في -80 درجة مئوية. قم بإعداد شاشة مصفوفة متفرقة PACT Premier 96 جيدا. باستخدام روبوت مناولة السوائل ، قم بتوزيع 100 نانولتر من 70 مجم / مل من الإندوثيابسين و 100 نانولتر من محلول البئر في بئر فرعي واحد لكل بئر. امزج البروتين ومحلول البئر 3 مرات عند إضافة المخزن المؤقت للتبلور. أغلق اللوحة واتركها لمدة 28 يوما عند 20 درجة مئوية لالتقاط الصور كل يوم للأسبوع الأول ثم كل أسبوع بعد ذلك لمدة 4 أسابيع. تحليل المصفوفة المتفرقة تحديد النتائج التي تنتج بلورات إندوثيابسين مفردة. من شاشة PACT ، نمت الظروف التي تحتوي على MgCl2 كمفردات بدلا من مجموعات إبرة. تحسين المصفوفة المتفرقة من MgCl2 الذي يحتوي على الظروف المحددة في الخطوة 1.1.3.1 ، قم بإنشاء شاشة 96 بئرا تجمع بشكل عشوائي وتغير مكونات البئر المختلفة. باستخدام روبوت مناولة السوائل ، قم بتوزيع 100 نانولتر من 70 مجم / مل من الإندوثيابسين و 100 نانولتر من محلول البئر في بئر فرعي واحد لكل بئر. امزج البروتين ومحلول البئر 3 مرات عند إضافة المخزن المؤقت للتبلور. أغلق اللوحة واتركها لمدة 28 يوما عند 20 درجة مئوية لالتقاط الصور كل يوم للأسبوع الأول ثم كل أسبوع بعد ذلك لمدة 4 أسابيع. تحليل التحسين باستخدام برنامج جداول البيانات المناسب ، قم بترتيب ظروف التبلور التي تؤدي إلى ظهور البلورات بناء على جودة البلورة ومستوى هطول الأمطار ، ولا توجد بلورات (0) إلى مثالية (5) ومنخفضة (0) إلى عالية (5) ، على التوالي. فيما يتعلق بجودة الكريستال ، فإن المعايير العامة هي بلورات مفردة ذات شكل يشبه الصندوق. إجراء تحليل ارتباط بيرسون بين محتويات حالة التبلور وكمية البلورة ومستوى الترسيب. ارسم هذه البيانات كخريطة حرارية. ابحث عن المكونات والشروط التي كانت مرتبطة بالنتائج المفضلة. تحليل الحيود. تأكد من أن البلورات المزروعة من الظروف المحددة في الخطوة 1.1.5 مناسبة لعلم البلورات التسلسلي عن طريق إجراء تجربة حيود الأشعة السينية. قم بتحميل عينة من بلورات endothiapepsin من كل حالة من الحالات المحددة على دعامات تسمح بجمع البيانات إما عند 100 أو 293 K وإجراء تجربة حيود الأشعة السينية. إذا كنت تعمل تحت التبريد ، فاستخدم 25٪ جلايكول الإيثيلين كواقي من التبريد. معالجة هذه البيانات عبر مجموعة برامج مناسبة. يجب أن تنحرف بلورات Endothiapepsin إلى ما بعد 1.5 Å. تحقق من وجود توأمة ، حيث يمكن للبلورات التوأمة أن تعقد بشكل كبير معالجة البيانات البلورية التسلسلية. إذا كانت البلورات مفردة وانحراف إلى 1.5 Å ، فانتقل إلى الخطوة 2. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فارجع إلى الخطوة 1.1.2 وجرب المزيد من شاشات المصفوفة المتفرقة لتحديد الظروف الواعدة. بعد التحليلات التي أجريت في الخطوات 1.1.5. و 1.1.6 ، كان يجب العثور على حالة تبلور 25٪ (وزن / حجم) PEG 6000 و 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2 كمثال تقريبي. 2. الانتقال إلى الدفعة تجربة مورفوجرام إنشاء مخزون بذور الكريستال الدقيق.ملاحظة: من أفضل الممارسات عند صنع مخزون البذور ، صنع البذور من بلورات نمت خصيصا لهذه المهمة. هذا يساعد كثيرا في التكاثر. ومن الأفكار الأخرى المقدمة في الخطوات من 2-1-1-1 إلى 2-1-1-11 أن تستخدم دائما البلورات المزروعة من عدد قياسي من الآبار – هنا 5 – وأن تقسم المخزونات بمجرد صنعها لإبطال دورات التجميد والذوبان.قم بإعداد لوحة تبلور 96 بئرا مع آبار تحتوي على مخزن التبلور: 25٪ (وزن / حجم) PEG 6000 ، 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2. باستخدام روبوت مناولة السوائل ، قم بتوزيع 200 nL من الإندوثياببسين المذاب 70 مجم / مل و 200 nL من محلول البئر في بئر فرعي واحد لكل بئر. امزج البروتين ومحلول البئر 3 مرات عند إضافة المخزن المؤقت للتبلور. ختم اللوحة واتركها لمدة 24 ساعة. املأ أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ب 250 ميكرولتر من محلول التبلور وخرز زجاجي 10-15 مم. اترك أنبوب الطرد المركزي على الثلج ليبرد لمدة 5-10 دقائق. حدد 5 آبار بها بلورات ، وافتح الآبار بمشرط ، وباستخدام طرف ماصة ، سحق البلورات في الآبار. نضح 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت من أنبوب الطرد المركزي المثلج واستخدمه لتجانس ملاط الكريستال المسحوق. بمجرد أن تصبح متجانسة ، قم بشفط الملاط بالكامل وجمعها في أنبوب الطرد المركزي المبرد. كرر الخطوة 2.1.2.6 لكل بئر من الآبار الفرعية الخمسة. دوامة أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على المخزن المؤقت والملاط المجمع والخرز عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. أعد أنبوب الطرد المركزي إلى الثلج لمدة 30 ثانية. كرر الخطوتين 2.1.2.8 و2.1.2.9 مرتين أخريين. مخزون البذور جاهز الآن ويمكن تحويله إلى دفعات 10 ميكرولتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية. إجراء تجربة مورفوغرام. قم بإعداد شاشة شبكة 2-drop 96-well. قم بتغيير تركيز PEG 6000 من 5 إلى 40٪ (وزن / حجم) على طول أعمدة اللوحة ، مع الحفاظ على المخزن المؤقت والملح عند 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2 ، على التوالي. تحضير تخفيف متسلسل من إندوثيابسين في 0.1 M Na Acetate pH 4.6 من 100 إلى 12.5 ملغ / مل على مدى 8 خطوات. سيتم استخدام تركيز مختلف من الإندوثيابسين لكل صف من اللوحة. باستخدام روبوت معالجة السوائل ، قم بتوزيع 150 nL من endothiapepsin في كل من الآبار الفرعية 1 و 2. في البئر الفرعي 1 ، قم بتوزيع 150 nL من محلول البئر. في البئر الفرعي 2 ، قم بشفط 50 nL من مخزون البذور المذاب و 100 nL من محلول البئر ، ثم قم بتوزيع كليهما في محلول البروتين. امزج المحاليل 3 مرات عند إضافة المخزن المؤقت للتبلور. أغلق اللوحة واتركها عند 20 درجة مئوية لالتقاط الصور كل 0 ، 3 ، 6 ، 12 ، 18 ، 24 ساعة ، ثم كل يوم للأسبوع الأول ، وكل أسبوع للأربعة التالية. إذا لم يكن التصوير التلقائي ممكنا ، فلا تقلق بشأن التصوير بالساعة في اليوم 1. تحليل مورفوغرام بالنظر إلى الصور التي تم التقاطها بعد 24 ساعة ، قم بتقدير عدد البلورات الموجودة في كل بئر وسجل هذه التقديرات في ورقة عمل “مولد المورفوغرام” المتوفرة. وليس من الضروري أن تكون هذه التقديرات دقيقة؛ بل يجب أن تكون دقيقة. إن عد الآلاف من البلورات الدقيقة بشكل فردي ، إن وجد ، ليس عمليا أو ضروريا. حاول بشكل أساسي التأكد من أن التقديرات متسقة على اللوحة بأكملها.ملاحظة: استندت قاعدة 24 ساعة إلى الملاحظات الواردة في Beale et al . (2019) 26. يمكن أن تستغرق ظروف تبلور انتشار البخار أياما أو أسابيع لتحقيق التوازن. من المرجح أن تكون البلورات التي تظهر بسرعة قد نمت عبر عملية دفعية بدلا من التوازن التدريجي لمكونات القطرة. وبالتالي ، فإن معيار 24 ساعة تعسفي إلى حد ما وسيعتمد وقت القطع الدقيق بين تجربة الدفعة وانتشار البخار على الخليط المحدد للحالة [انظر Beale et al. (2019) 26 للحصول على التفاصيل الكاملة]. أدخل تركيزات البداية من endothiapepsin و PEG 6000 في الصناديق المشار إليها. ستقوم ورقة العمل تلقائيا برسم النتائج بتنسيق مخطط الطور التقليدي مع تركيز المرسب والبروتين على المحورين x و y ، على التوالي. تشير الظروف الجيدة التي تؤدي فقط إلى ظهور بلورات في قطراتها المصنفة إلى المنطقة شبه المستقرة من الرسم البياني (الأزرق الشفاف) ، في حين أن الظروف التي تحتوي على بلورات في كل من القطرات المصنفة وغير المصنفة تشير إلى منطقة النواة (خضراء صلبة).ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن تكون غالبية منطقة التنوي موجودة في الرسم البياني (أي أن هناك بعض الآبار الصافية في أسفل الرسم البياني ويجب أن تكون بعض الرواسب مرئية عند تركيزات عالية من البروتين والراسبات). إذا لم يكن الأمر كذلك ، فربما كرر التجربة ولكن قم بزيادة تركيز البروتين و / أو الراسب (إن أمكن). إذا ظهرت البلورة في أقل من 24 ساعة ، فانتقل إلى الخطوة 2.3.1. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فانتقل إلى الخطوة 2.4 واستمر في التحسين نحو الدفعة. تحليل الكريستال كما قيل في نهاية الخطوة 1 ، قبل الانتقال إلى الخطوة التالية ، تأكد من أن هذه البلورات تتمتع بالتشكل المطلوب وجودة الحيود المطلوبة. فيما يتعلق بالتشكل ، هل البلورات غير متشابكة بشكل ملحوظ وتتشكل كمفردات بدلا من هياكل تشبه كرة الإبرة أو تشبه المروحة؟ فيما يتعلق بالحيود ، اجمع بيانات الحيود من البلورات إن أمكن. إذا لم تنحرف هذه البلورات ، فمن غير المحتمل أن تنحرف البلورات المزروعة في حجم أكبر. قم بتحميل عينة من بلورات endothiapepsin من تجربة التشكل على دعامات تسمح بجمع البيانات إما عند 100 أو 293 K وإجراء تجربة حيود الأشعة السينية. إذا كنت تعمل تحت التبريد ، فاستخدم 25٪ جلايكول الإيثيلين كواقي من التبريد. معالجة هذه البيانات عبر مجموعة برامج مناسبة. يجب أن تنحرف بلورات Endothiapepsin إلى ما بعد 1.5 Å. عبر عينة البلورات ، لاحظ حجم الخلية ، والعدد الإجمالي للملاحظات ، والفسيفساء. ستعطي هذه المقاييس مؤشرا على تجانس بلورات الحيود . إذا كان التشكل البلوري وجودة الحيود كافيين ، فانتقل إلى الخطوة 3. تحسين وقت نمو الكريستال.ملاحظة: سيعطي تحليل المورفوغرام (الخطوة 2.2) إشارة إلى نقطة بداية التبلور (أي منطقة مخطط الطور حيث يقع الانخفاض عند خلط الراسب والمحاليل البروتينية). هل الانخفاض في المنطقة شبه المستقرة أم تحت خط الذوبان؟ يبدأ تبلور الدفعات في منطقة النواة (الشكل 1C). الهدف من هذه الخطوة هو نقل نقطة البداية هذه إما من أسفل خط الذوبانية أو المنطقة شبه المستقرة إلى منطقة النواة (الشكل 1 د). إذا انخفض المصنف من الخطوة 2.2. أنتجت بلورات بسرعة ، وهذا مؤشر على أن خليط القطرة موجود بالفعل في المنطقة شبه المستقرة ، وإذا لم يكن الأمر كذلك ، فمن المحتمل أن يكون القطرة غير مشبعة بشكل مفرط.تحسين وقت نمو الكريستال. باستخدام نفس الشاشة كما في الخطوة 2.1.3 ، قم بإعداد تجربة بلورة انتشار البخار 96 بئرا في لوحة 3 قطرات. زيادة تركيز البروتين الأولي للإندوثيابسين على المحور ص (أي تركيز البروتين بشكل أكبر ، ربما 120 مجم / مل للإندوثيابسين). قم بإجراء تخفيف تسلسلي ، كما في الخطوة 2.1.3.2 ، بحيث يحتوي كل صف من اللوحة على تركيز بروتين أقل بالتتابع. استخدم نسب سقوط مختلفة في كل من القطرات الثلاث على اللوحة: 1: 1 ، 1: 2 ، و 2: 1 ، البروتين: المرسب. اعرض اللوحة أو صورها في اليوم الأول عند 0 ، 3 ، 6 ، 12 ، 18 ، 24 ساعة ثم كل يوم للأسبوع الأول ، وكل أسبوع للأربعة التالية. إذا لم يكن التصوير التلقائي ممكنا ، فلا تقلق بشأن التصوير بالساعة في اليوم 1. حدد القطرات التي تنتج البلورات الأكثر ظهورا بسرعة واجعلها نقاط البداية للتحسينات المتكررة حتى يحدث نمو البلورة في غضون 24 ساعة. عندما يتم تحديد حالة بلورية سريعة الظهور ، ارجع إلى الخطوة 2.1 لإعادة رسم المورفوجرام كمقدمة لبدء التحجيم. 3. التحجيم ترتيب مسارات التحجيم. في هذه المرحلة ، ليس من الضروري اتخاذ قرار بشأن مسار قياس واحد ، فقط لتحديد الخيارات وترتيبها بحيث يمكن استكشافها بدورها. مع زيادة حجم خليط الدفعات أثناء إجراء التحجيم ، ستحدث تغييرات في معدل التنوي ونطاق أحجام البلورات. ومع ذلك ، يمكن التغلب عليها عن طريق التغيير والتبديل الدقيق لتركيزات المكونات مع زيادة الحجم المقياس.ملاحظة: تصف الخطوتان 3-1-1 و3-1-2 كيفية التمييز، من الرسم المورفوغرامي، ما إذا كان بروتوكول الدفعات أو الدفعات المصنفة أكثر ملاءمة.بروتوكول الدفعات المستقيمة هل Xn في منطقة التنوي يتناسب مع تركيز البروتين و / أو المرسب؟ أي هل يزيد Xn كدالة لتركيز المرسب و / أو البروتين؟ -نعم؟ انتقل إلى الخطوة 3.1.1.2. لا؟ انتقل إلى الخطوة 3.1.2. حدد الظروف التي تنتج بلورات بالحجم المطلوب وانتقل إلى الخطوة 3.2. بروتوكول الدفعات المصنفة هل Xn مسطح عبر منطقة النواة؟ أي، لا يزيد Xn كدالة لتركيز المرسب و / أو البروتين. حدد الظروف المصنفة التي تنتج بلورات بالحجم المطلوب وانتقل إلى الخطوة 3.2. إذا كانت جميع البلورات كبيرة جدا – انتقل إلى الخطوة 3.1.2.3. كرر تجربة المورفوجرام (الخطوة 2.1) ولكن هذه المرة قم بزيادة تركيز مخزون البذور المستخدم في الآبار المصنفة. يمكن زيادة مخزون البذور باستخدام المزيد من البلورات في إنشائها. على سبيل المثال ، بدلا من 5 آبار في الخطوة 2.1.1.5 ، استخدم 10 آبار. اعرض أو صور اللوحة خلال أول 0 ، 3 ، 6 ، 12 ، 18 ، 24 ساعة. يجب أن يكون Xn قد زاد وانخفض Xs في القطرات المصنفة. كرر هذه الدورة إذا كانت هناك حاجة إلى بلورات أصغر ثم اتبع بروتوكول الدفعات المصنفة. التحجيم التدريجي التحجيم في 96 لوحة بئر. من مورفوغرام endothiapepsin ، تم اختيار طريقة دفعة مستقيمة باستخدام حالة التبلور 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2 و 30٪ (w / v) PEG 6000 ، في البداية للتحجيم. 100 مجم / مل إندوثيابسين ممزوج بمحلول التبلور بنسبة 1: 1.قم بإعداد 2-3 آبار في صفيحة جلوس وإسقاط 96 بئرا مع 100 ميكرولتر من 0.1 متر Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2 و 30٪ (w / v) PEG 6,000. باستخدام محلول إندوثيابيبسين طازج الذوبان، قم بتوزيع 0.5 ميكرولتر من البروتين و0.5 ميكرولتر من المرسب لكل بئر، وأغلقه وخزنه عند 20 درجة مئوية. اعرض أو صور اللوحة خلال أول 0 ، 3 ، 6 ، 12 ، 18 ، 24 ساعة. لاحظ أي تغييرات في نطاق Xs و Xn. في حالة حدوث تغييرات، كرر الخطوات من 3-2-1-1 إلى 3-2-1-2 ولكن مع زيادة أو تقليل تركيز البروتين و/أو المرسب و/أو البذور لاستعادة أي تغييرات في نطاق Xs و Xn. عندما يكون نطاق Xs و Xn مقبولا ، انتقل إلى الخطوة 3.2.2. التحجيم في لوحات معلقة من 24 بئرا قم بإعداد بئر واحد من لوحة معلقة مكونة من 24 بئرا عن طريق تشحيم حواف البئر بشحم مفرغ. تحضير 0.5 مل من 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2 و 30٪ (وزن / حجم) PEG 6000 وملء البئر المدهون. باستخدام محلول endothiapepsin المذاب حديثا ، ماصة 1 ميكرولتر من البروتين على سطح غطاء زجاجي. ماصة 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتبلور على قطرة البروتين وتخلط باستخدام ماصة. اعرض أو صور اللوحة خلال أول 0 ، 3 ، 6 ، 12 ، 24 ساعة. لاحظ أي تغييرات في نطاق Xs و Xn. في حالة حدوث تغييرات، كرر الخطوات 3-2-2-1 إلى 3-2-2-4 ولكن قم بزيادة أو تقليل تركيز البروتين و/أو المرسب و/أو البذور لاستعادة أي تغييرات في نطاق Xs و Xn. عندما / إذا كان نطاق Xs و Xn مقبولا ، فانتقل إلى الخطوة 3.2.2.7. كرر الخطوات من 3.2.2.1 إلى 3.2.2.5 ، مع زيادة الحجم الكلي للتجربة تدريجيا إلى 10 ميكرولتر. بمجرد الوصول إلى حجم 10 ميكرولتر أو أكبر ، انتقل إلى أنابيب الطرد المركزي في الخطوة 3.2.3. التحجيم في أنابيب الطرد المركزيملاحظة: حدث تحسين حالة دفعة endothiapepsin بشكل أساسي عند نقطة أحجام 200 ميكرولتر (انظر النتائج ، التحجيم). بدأت العملية بحالة تبلور تبلغ 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2 و 30٪ (w / v) PEG 6000. ومع ذلك ، تغير تركيز PEG في النهاية إلى 40٪ (وزن / حجم). كانت البذور مطلوبة أيضا للتحكم في Xn ، ولمنع نمو البلورات بشكل كبير جدا ، كان لا بد من إخماد نمو البلورات. الخطوات 3.2.3.1 إلى 3.2.3.7 تفصل عملية تحسين الحالة. الخطوة 3.2.4. وصف بروتوكول الدفعات النهائية.تحضير 1 مل من محلول التبلور: 0.1 م Tris-HCl pH 7.0 ، 0.15 M MgCl2 ، و 30٪ (وزن / حجم) PEG 6000. باستخدام إندوثيابسين 100 مجم / مل طازج ، أضف 25 ميكرولتر من البروتين إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. قم بخلط المخزن المؤقت للتبلور جيدا مع محلول البروتين بنسبة 1: 1 مع طرف ماصة. ضع الأنبوب في مسدس / دوار مع تحريض عالي عند 20 درجة مئوية. خذ بانتظام (5 ، 10 ، 30 ، 60 دقيقة ، 2 ، 5 ، 10 ، 24 ساعة) 2.5 ميكرولتر من القسمة وعرضها في مقياس الدم. سجل نطاق Xn و Xs . في حالة حدوث تغييرات، كرر الخطوات 3.2.3.1. إلى 3.2.3.4. ولكن زيادة أو تقليل تركيز البروتين و / أو المرسب و / أو البذور لاستعادة أي تغييرات في نطاق Xs و Xn عندما يكون نطاق Xs و Xn مقبولا ، انتقل إلى الخطوة 3.2.3.7. كرر الخطوات من 3-2-2-1 إلى 3-2-2-5، مع زيادة الحجم الكلي للتجربة تدريجيا إلى 200 ميكرولتر أو أكبر، حسب الاقتضاء. بروتوكول الدفعة النهائية المصنفة إعداد مخزون البذور. تحضير 2 مل من المخزن المؤقت للتبلور: 0.1 م Tris-HCl pH 7.0 ، 0.15 M MgCl2 ، و 40٪ (وزن / حجم) PEG 6000. باستخدام 100 مجم / مل إندوثيابسين طازج الذوبان ، أضف 100 ميكرولتر من البروتين إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. قم بخلط المخزن المؤقت للتبلور جيدا مع محلول البروتين بنسبة 1: 1 مع طرف ماصة. ضع الأنبوب في مسدس / دوار مع تحريض عالي عند 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح لبلورات 50 ميكرومتر بالنمو. أضف حبات زجاجية 10-15 1 مم إلى ملاط الكريستال 50 ميكرومتر. دوامة أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على الملاط والخرز عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. أعد أنبوب الطرد المركزي إلى الثلج لمدة 30 ثانية. كرر الخطوتين 3.2.4.1.5 و 3.2.4.1.6 10 مرات أخرى. هذا هو الآن 200 ميكرولتر من مخزون البذور 1x. تمييع مخزون البذور 10x بإضافة 1.8 مل من المخزن المؤقت للتبلور. قم بقسمة 10x من مخزون البذور على دفعات سعة 50 ميكرولتر وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. بروتوكول الدفعات المصنفة. تحضير المخزن المؤقت للتبلور: 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 ، 0.15 M MgCl2 ، و 40٪ (وزن / حجم) PEG 6000. في أنبوب الطرد المركزي ، امزج 100 ميكرولتر من محلول التبلور مع 50 ميكرولتر من مخزون البذور 10x المذاب حديثا. باستخدام 100 مجم / مل من الإندوثيابسين المذاب حديثا ، أضف 150 ميكرولتر من البروتين إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. امزج خليط المخزن المؤقت / البذور جيدا مع محلول endothiapepsin بطرف ماصة وضع الأنبوب في مسدس / دوار مع تحريض عالي عند 20 درجة مئوية. راقب التبلور عن طريق أخذ قسمة منتظمة 2.5 ميكرولتر وعرض البلورات في مقياس الدم. سجل نطاق Xn و Xs . بعد حوالي 80 دقيقة ، عندما تصل البلورات إلى Xs من 15 ميكرومتر ، قم بإخماد التفاعل بإضافة 150 ميكرولتر من 0.05 M Na Acetate pH 4.6 ، 0.05 M Tris-HCl pH 7.0 ، 0.075 M MgCl2 ، و 20٪ (w / v) PEG 6000 (محلول يتكون من عازل endothiapepsin ومخزن التبلور ، مختلط 1: 1). قم بتخزين البلورات على حرارة 20 درجة مئوية. هل أنتج البروتوكول نطاقا ورقما مقبولا لحجم الكريستال للتجربة المقصودة؟ نعم – تم – لا – ارجع إلى الخطوة 3.1. وحاول خيار تغيير حجم بديل. على سبيل المثال ، قد يكون من الممكن استخدام نسبة بروتين / راسب مختلفة أو إضافة بذور إذا لم يتم ذلك مسبقا. عندما يتم استنفاد كل هذه ، قد يكون من الضروري العثور على حالة جديدة في الخطوة 1.

Representative Results

تحسين مورفولوجيا الكريستالتم تضمين الخطوة 1 ، تحسين مورفولوجيا البلورة ، لتذكير القارئ بأهميتها. قد يكون من الممكن إنشاء بلورات دقيقة مثالية من كرات إبرة حيود ضعيفة ؛ ومع ذلك ، يقترح المؤلفون أنه من الأفضل تحسين الاثنين بشكل منفصل. أولا ، ابحث عن الظروف التي تؤدي إلى حيود جيد ، بلورة مفردة عن طريق انتشار البخار ، ثم قم بتحويل هذه الظروف إلى دفعة بدلا من محاولة الجمع بين الخطوتين معا. اكتشاف ظروف عالية النواة ، في هذه المرحلة ، ليس ضروريا. التشكل وجودة الحيود هي الأهداف الرئيسية. قبل البدء في التبلور الدقيق للإندوثيابسين ، تم إجراء تحليل لظروف تبلور البنية المودعة من PDB. يمكن الحصول على شروط التبلور والبروتوكولات التقريبية ل 47 من 48 ترسب من إنثوثيابسين. استندت جميعها على نطاق واسع إلى التبلور الأول للإندوثيابسين الذي أجراه Moews and Bunn (1970) 46. نظرا لأوجه التشابه بين هذه الظروف وأصلها “الكلاسيكي” ، تم إجراء 96 بئرا ، انتشار بخار ، شاشة مصفوفة متفرقة لاستكشاف مجموعة متنوعة من ظروف التبلور. تم تركيز Endothiapepsin إلى 70 مجم / مل وتم إجراء شاشة مصفوفة متفرقة PACT47 في صفيحة جلوس وإسقاط 96 بئرا عند 20 درجة مئوية لخلط 100 nL من البروتين مع 100 nL من محلول البئر. كل حالة من هذه التجربة بعد 36 ساعة أدت إلى ظهور بلورات. ومع ذلك ، أشار تحليل لمورفولوجيا البلورة إلى أن بعض الظروف قد تكون أفضل لتحسين التبلور الدقيق. يوضح الشكل 4 أ قطرة من شاشة PACT كانت ممثلة على نطاق واسع لتلك التي لوحظت في غالبية اللوحة. للوهلة الأولى ، قد يكون من المغري الاعتقاد بأن هذه البلورات قد تستحق المزيد من التحسين من أجل التبلور الدقيق. البلورات كبيرة ويبدو أن هناك نواة كبيرة. ومع ذلك ، فإن مورفولوجيا الكريستال الشاملة ليست مثالية. أولا ، البلورات ليست مفردة بشكل ملحوظ حيث يبدو أن بلورات متعددة تنمو من نقاط نواة واحدة. ثانيا ، حجم البلورة غير متماثل للغاية حيث يحدث النمو بشكل أساسي أسفل محور واحد. من المرجح نظريا أن تتماشى هذه البلورات بشكل تفضيلي عند تسليمها إلى شعاع الأشعة السينية. وتمثل كلتا الخاصيتين مشاكل أثناء جمع البيانات البلورية التسلسلية ومعالجتها. ومع ذلك ، يوضح الشكل 4B بلورات endothiapepsin نمت في وجود MgCl2. كان هذا التشكل متسقا في جميع الظروف التي تحتوي على MgCl 2 وبالتالي اقترح أن مورفولوجيتها كانت بسبب MgCl2. أنتجت ظروف MgCl2 بلورات مفردة تشبه الصندوق تمثل هدفا أفضل للتجارب التسلسلية النهائية. كانت هناك أربعة شروط داخل شاشة PACT تحتوي على MgCl2. لفهم تأثير جميع المكونات المختلفة لهذه الظروف بشكل أفضل على تبلور endothiapepsin ، تم إجراء تحسين عشوائي. تم إنشاء شاشة تحتوي على مجموعة عشوائية من المخازن المؤقتة والمرسبات في مجموعة من التركيزات والأس الهيدروجيني. كان تركيز MgCl2 متنوعا أيضا ثم تم تصنيف القطرات الناتجة بشكل تعسفي من 0-5 (0 لا توجد بلورات أو ترقيم) من حيث جودة البلورة البصرية ومستوى هطول الأمطار. يوضح الشكل 5A خريطة حرارية للنتائج من تحليل ارتباط بيرسون بين مستوى هطول الأمطار وجودة الكريستال ، ومتغيرات الشاشة (أمثلة على القطرات من هذه التجربة موضحة في الشكل 5B و C و D). أشارت النتائج إلى أن الرقم الهيدروجيني للمحلول كان مرتبطا ارتباطا وثيقا بمستوى هطول الأمطار ، حيث أدت المخازن القلوية إلى مزيد من هطول الأمطار. كان تركيز MgCl2 مرتبطا قليلا بمستوى هطول الأمطار ، وكذلك درجة الحموضة وتركيز الراسب لجودة البلورة. بناء على هذه النتائج ، تم اتخاذ قرار بأخذ البلورات المزروعة في 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 ، 0.15 M MgCl2 ، 20٪ (w / v) PEG 6,000 إلى الخطوة التالية من البروتوكول – الانتقال إلى الدفعة. كان مورفولوجيا البلورات مقبولا واقترح تحليل حيود الأشعة السينية ومقاييس جودة البيانات من هذه البلورات أنه لا يوجد فرق كبير بين البلورات المزروعة داخل وخارج وجود Mg2+ (الشكل 9). الانتقال إلى الدفعةبالنسبة للعديد من تحسينات التبلور الدقيق لعلم البلورات التسلسلي ، ستكون الخطوة 2 هي نقطة البداية. سيكون البروتين محل الاهتمام قد تبلور بالفعل من أجل علم البلورات بالتبريد وسيحتاج بروتوكول التبلور الآن إلى التحويل لإنشاء ملاط بلوري دقيق. استخدم هذا البروتوكول فقط ألواح نشر بخار 96 بئرا لإجراء التحويل إلى دفعة لأن انتشار البخار هو طريقة التبلور المستخدمة بنسبة 95٪ من إدخالات PDB26. تجنب البروتوكول الانتقال إلى الدفعة الدقيقة34،35،37 لأن هذا الانتقال قد لا يزال يتحمل تحسينا مشابها. هذا لا يعني أنه لا يمكن إجراء هذا البروتوكول إلا في ألواح انتشار البخار. جميع الخطوات المقدمة ، ستعمل أيضا في microbatch إذا كانت هذه هي طريقة التبلور الأصلية. لتقييم تبلور endothiapepsin في الحالة المختارة ، تم إنشاء مورفوغرام – أو مخطط طور خشن. الغرض من تجربة المورفوجرام هو ثلاثة أضعاف. أولا ، يعد تحليل المورفوجرام ذا فائدة كبيرة عند تقييم مسارات القياس في الخطوة 3 – التحجيم. ثانيا ، يعمل المورفوجرام كأداة تحسين ، مما يساعد على اكتشاف ظروف انتشار البخار التي تؤدي إلى ظهور البلورات عبر الدفعة [أي البلورات سريعة الظهور (< 24 ساعة)]. ثالثا ، إذا لم تظهر البلورات بسرعة ، فإن تحليل القطرات المصنفة يمكن أن يعطي عالم البلورات فكرة عن الموقع التقريبي للحالة الحالية على مخطط الطور. على سبيل المثال، إذا أعطت الظروف المصنفة بلورات ولكن غير المصنفة لا تعطيها، فمن المحتمل أن تكون هذه الظروف في المنطقة شبه المستقرة. تم إجراء تجربة مورفوغرام للإندوثيابسين بناء على 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 ، 0.15 M MgCl2 ، 20٪ (w / v) PEG 6000 حالة. تراوحت تركيزات البروتين و PEG من 100 إلى 12.5 مجم / مل و 5 إلى 40٪ (وزن / حجم) ، على التوالي. تم تحليل القطرات ورسم النتائج باستخدام ورقة العمل المقدمة (الشكل 6 أ). كان من الواضح أيضا من مرحلة تحسين مورفولوجيا الكريستال أن نمو بلورات endothiapepsin في هذه الحالة ، وعند تركيزات البروتين هذه ، سيؤدي إلى نمو بلورات في أقل من 24 ساعة. يشير هذا إلى أن التبلور كان يحدث عبر دفعة بدلا من عملية مدفوعة بانتشار البخار. لذلك كانت البلورة المزروعة في هذه الظروف مناسبة للتوسع إلى أحجام أكبر. إذا لم تكن البلورات مرئية في القطرات غير المصنفة بعد 24 ساعة ، فمن المحتمل أن التبلور لا يزال يعتمد على الانتقال (الشكل 1 ب) ، وبالتالي ليس الدفعة. في هذه الحالة ، لا تزال نتائج تجربة المورفوغرام ذات أهمية. إنها تعطي إشارة إلى نقطة البداية المحتملة للتبلور على مخطط الطور ، وبالتالي ، كيف يجب أن يستمر التحسين اللاحق. انظر إلى القطرات المصنفة. ستسمح البذور بنمو البلورات في المنطقة شبه المستقرة بغض النظر عن النواة. على سبيل المثال ، إذا ظهرت البلورات في غضون 24 ساعة في القطرات المصنفة ولكن ليس في القطرات غير المصنفة ، فهذا يشير إلى أنه يمكن ملاحظة جزء من المنطقة شبه المستقرة. إذا لم تلاحظ أي بلورات في القطرات المصنفة أو غير المصنفة ، تظل جميع الآبار غير مشبعة. القياسبالنظر إلى المورفوغرام (الشكل 6 أ) ، يمكن إجراء عدد من الملاحظات. يبدو أن كمية النوى تتأثر بكل من تركيزات البروتين والراسب. كان هناك أيضا ترسيم واضح جدا للقطرات التي تؤدي إلى ترسيب البروتين ، مع قطرات إما تحتوي على: لا شيء أو بلورات أو راسب (الشكل 6 ب). كما أدت إضافة البذور (الشكل 6D) إلى زيادة Xn بشكل كبير عند مقارنتها بالقطرات بدون بذور (الشكل 6C). بأخذ كل هذه النتائج معا ، تقرر محاولة توسيع نطاق كل من بروتوكول الدفعات والدفعات المصنفة عند 30٪ (وزن / حجم) PEG 6000 و 100 مجم / مل إندوثيابسين. تم إجراء اختبار القياس الأولي في ألواح إسقاط معلقة من 24 بئرا. تم زيادة أحجام الانخفاض تدريجيا بحيث يمكن ملاحظة أي تغييرات في سلوك التبلور (الشكل 7). كما يتضح ، في كل من قطرات غير البذور والمصنفة حدث نمو بلوري. نمت جميع القطرات غير المصنفة مجموعة من أحجام البلورات ، ولكن في الغالب بلورات كبيرة (100-200 ميكرومتر – أطول بعد). ومع ذلك ، أنتجت القطرات المصنفة بلورات أصغر (5-50 ميكرومتر – أطول بعد). اقترحت هذه الاختبارات الأولية أن البذور ستكون مطلوبة لتقليل Xs ، ولكن أيضا ، يجب أن تكون هذه الحالة مناسبة للأحجام الأكبر. عندما تم زيادة الحجم في 200 ميكرولتر ، تم تحريك حجم التبلور باستمرار أثناء نمو البلورة. كان السبب الرئيسي لهذا التحريض هو التأكد من أن محلول التبلور يظل متجانسا وأن البلورات النامية لا تستقر في قاع أو جوانب الأنابيب. يمكن أن يؤدي ترسب البلورات إلى وجود بلورات غير متجانسة مع بلورات كبيرة جدا وصغيرة. يمكن أن يؤدي تحريك محلول التبلور أيضا إلى تعزيز التنوي44,45. لسوء الحظ ، لم ينتج 30٪ (وزن / حجم) PEG 6000 غير المصنف أي بلورات ، لذلك تم زيادة تركيز PEG إلى 35٪ (وزن / حجم). أدت هذه الزيادة إلى تحسين التبلور بشكل ملحوظ ،مع نطاق X n و X s النهائي من 3.6 ± 1.2 × 106 بلورات · mL-1 و 42 ± 4.1 ميكرومتر ، على التوالي (الشكل 8A و B – أسود). على الرغم من التحسن الكبير والتركيز البلوري المقبول ، إلا أن البلورات النهائية كانت كبيرة جدا بالنسبة للتجربة المخطط لها ، لذلك تم إجراء المزيد من التحسينات. لتقليل حجم البلورات النهائية ، تم استكشاف طريقين (الشكل 1E): تقليل تركيز البروتين لمحاولة الحد من نمو البلورة النهائي (الشكل 8A و B – الوردي الساخن) ، وزيادة تركيز PEG لمحاولة زيادة النوى (الشكل 8A و B – الأخضر). لسوء الحظ ، أدى تقليل تركيز البروتين أيضا إلى تقليل Xn بشكل كبير ، مما أدى في النهاية إلى إنتاج بلورات أكبر. أدت زيادة تركيز PEG إلى 40٪ إلى تحقيق نطاق Xn و Xs النهائي من 3.1 ± 0.7 × 106 بلورات · mL-1 و 39 ± 2.3 ميكرومتر ، على التوالي. لم تكن هذه مختلفة بشكل كبير عن 35٪ ، ولكن منذ تقليل حجم البلورة النهائي ، استمر هذا الشرط مع مزيد من التحسينات. لزيادة Xn ، تمت إضافة البذور. أدى هذا إلى زيادة كبيرة في Xn (1.1 ± 1.8 × 108 بلورات · مل -1) وأدى إلى Xs أصغر (4.2 ± 4.0 ميكرومتر) (الشكل 8A و B – أرجواني متقطع). هذه البلورات ، على الرغم من أنها مناسبة جدا لبعض تجارب علم البلورات التسلسلي ، اعتبرت صغيرة جدا لذلك تم تغيير تركيز البذور المضافة. غير أنه ثبت أن من الصعب تكرار هذا الضبط لمخزون البذور المضافة على نحو موثوق؛ لذلك ، تمت محاولة التبريد. بعد إضافة مخزون البذور ، تمت مراقبة حجم البلورة وبمجرد تحقيق حجم بلوري مناسب (حوالي 10-20 ميكرومتر) ، تم إخماد تبلور الدفعة (الشكل 8C و D). تم اقتراح التبريد ، فيما يتعلق بالتبلور الدقيق ، في Kupitz et al. (2014) 25. على الرغم من أنها ربما ليست طريقة مثالية ، حيث سيتم إهدار محلول البروتين في النهاية26 ، إلا أن التقنية كانت مفيدة جدا في هذه الحالة حيث كان من الصعب التحكم في نمو البلورات. الفكرة وراء التبريد هي إعادة خليط التبلور بسرعة إلى نقطة أعلى مباشرة من خط الذوبان (الشكل 1F). بمجرد عودة المحلول إلى خط الذوبانية، يعود المحلول إلى محلول مشبع مستقر ولن يحدث نمو بلوري آخر. محاولة إخماد تفاعل التبلور لا تخلو من المخاطر. إذا أضيف محلول تبريد كبير جدا ، فقد يتم تخفيف البروتين الموجود في المحلول لدرجة أنه يتم تمرير خط الذوبان. في هذه الحالة ، سيصبح المحلول غير مشبع وستبدأ البلورات في الذوبان. لمنع ذلك ، من الممكن تقدير مقدار محلول التبريد المطلوب بناء على نتائج المورفوغرام. عند نقطة التبريد ، خذ تركيز محلول البروتين. بمقارنة تركيز البروتين عند خط الذوبانية وتركيز البروتين في المحلول، يمكن إجراء تقدير للتخفيف المطلوب. أعطت النسخة المروية من تجربة البذور المخففة 40٪ (w / v) PEG 6,000 ، 10 × تركيز بلوري نهائي ونطاق حجم 2.6 ± 3.1 × 106 بلورات · مل -1 و 15 ± 3.9 ميكرومتر ، على التوالي. طوال العملية بأكملها ، تم جمع مجموعات بيانات اختبار الأشعة السينية لبلورات endothiapepsin في خط شعاع مصدر الضوء السويسري PXII باستخدام تركيز 10 × 30 ميكرومتر ، وطاقة 12.4 كيلو فولت مخففة بنسبة 80٪ ، وتحت ظروف التبريد. تمت معالجة البيانات باستخدام الأقراص ويوضح الشكل 9 مقارنة بين CC1/2. لم يلاحظ أي تغيير جذري في CC1/2 على مدار التحسين. الشكل 1: نظرة عامة على التبلور الانتقالي والدفعي ، وطرق القياس المعينة على مخطط الطور. أ. مناطق وحدود مخطط مرحلة بلورة البروتين النموذجي. يتم رسم تركيزات المرسب والبروتين على المحورين x و y ، على التوالي ، مع نقطة الماء النقي في الأصل. يشير الخط الأرجواني إلى حد فرط التشبع البروتيني، وتظهر المناطق شبه المستقرة ومناطق النوى والترسب باللون الأزرق والأخضر والوردي على الترتيب. ب. مثال على حدود اختراق منطقة التنوي لطريقة تبلور “المرحلة الانتقالية” ، مثل انتشار البخار. في هذه التجربة النظرية ، تبدأ تركيزات راسب الانخفاض والبروتين أسفل خط الذوبان مباشرة – لم يتم تشبعها بعد. بينما يتوازن الانخفاض ، تزداد تركيزات مكونات الانخفاض بحيث يصبح الانخفاض مفرط التشبع ، ويستمر في التحرك – أو الانتقال – إلى منطقة النواة. عند التنوي البلوري ، يبدأ تركيز البروتين في المحلول في الانخفاض. يستمر التركيز في الانخفاض مع نمو البلورات حتى تتوقف أخيرا عند خط الذوبان. يمثل الخط الأزرق المنقط حدا نظريا للانتقال إلى منطقة النواة. بمجرد أن يبدأ التنوي ، سينخفض تركيز البروتين ، مما يمنع المزيد من الاختراق. ج. مثال على مسارات تبلور الدفعات والدفعة المصنفة. دفعة واحدة ، يجب أن يؤدي خلط البروتين والمرسب إلى إنشاء محلول مفرط التشبع داخل منطقة النواة بحيث يمكن أن يحدث نمو بلوري. في الدفعة المصنفة ، ليس من الضروري تماما أن تكون في منطقة النواة بسبب إضافة البذور الدقيقة ، لذلك يمكن أيضا استكشاف المواقع في المنطقة شبه المستقرة. د. تحسين افتراضي لتجربة التبلور الموضحة في B من انتشار البخار إلى الدفعة. انتقلت نقطة بداية انتشار البخار الأصلية ، عبر ناقل التحسين الناتج ، إلى موضع البدء الجديد ؛ داخل منطقة النواة. المتجه الناتج هو نتاج تحسينين: زيادة في كل من تركيزات البروتين والراسب. هاء. مثال على التحسينات عند تغيير حجم ظروف الدفعات لتخصيص Xn و Xs النهائيين. ف. إخماد تجربة التبلور بإضافة مخزن التبلور. من الضروري ألا يؤدي التبريد إلى إخراج تركيز البروتين من المنطقة شبه المستقرة ، وبالتالي ، تحت نقطة التشبع الفائق للبروتين. خلاف ذلك ، ستبدأ البلورات في الذوبان مرة أخرى في المحلول. ب. و C . تم تكييفها من Beale et al. (2019) 26 بإذن من المؤلفين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: زيادة Xn وتناقص Xs. العلاقة المثالية بين عدد البلورات الناتجة عن تجربة التبلور ومتوسط أطول بعد. لإنشاء هذا الرسم البياني ، تم استخدام تبلور بروتين نموذج افتراضي 10 كيلو دالتون. تبلور البروتين بتركيز 10 ملغم / مل وأسفر عن بلورات P2 121 21بأبعاد 49x50x51 Å. كان من المفترض أن ينتج عن كل حدث نواة بلورة. كان من المفترض أن يكون نمو الكريستال متجانسا من كل وجه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: مخطط انسيابي يوضح خطوات تحسين بلورة نمت في تجربة انتشار بخار صغيرة الحجم ( 100 ميكرولتر). ينقسم تحسين الكريستال إلى ثلاث مراحل: (1) تحسين مورفولوجيا الكريستال. (2) الانتقال إلى الدفعة. (3) التحجيم. في المرحلة 1 ، من المهم تحديد البلورات المناسبة للتبلور الدقيق. بعض البروتينات موجودة فقط في مورفولوجيا بلورية واحدة بغض النظر عن حالة التبلور. ومع ذلك ، يجدر البحث عن الظروف التي تؤدي إلى بلورات مفردة تشبه المكعب ، أو أقرب ما يمكن إلى هذه البلورات البشرية. البلورات المفردة الشبيهة بالمكعب ، افتراضيا وقصصيا ، ستؤدي عموما إلى نتائج أفضل من تجارب علم البلورات المتسلسلة. بمجرد اختيار مورفولوجيا بلورية وتأكيد الحيود ، من الضروري بعد ذلك نقل تجربة التبلور من انتشار البخار إلى الدفعة (المرحلة 2). هنا ، يجب تحسين البلورات من خلال وقت النواة. الهدف هو إيجاد الظروف التي تنتج بلورات سريعة الظهور (> 24 ساعة) حيث من المحتمل أن تصل هذه الظروف إلى منطقة النواة على الفور ، وبالتالي فهي دفعة. بمجرد العثور على حالة في منطقة النواة ، يمكن إنشاء مورفوغرام. يسمح المورفوجرام لغالبية منطقة التنوي برسم خرائط ومسارات القياس المحتملة المحددة للمرحلة 3. يمكن بعد ذلك تحجيم حجم حالة الدفعة المحددة إما تدريجيا أو بسرعة في الحجم لإنتاج حجم نهائي قدره >100 ميكرولتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تحليل لظروف تبلور الإندوثيابسين من شاشة مصفوفة متفرقة PACT. A و B. هي صور بعد 24 ساعة من الآبار A4 و C10 ، على التوالي من شاشة PACT . يتم تمييز مكونات المخزن المؤقت للتبلور على الشكل. المخزن المؤقت SPG هو حمض السكسينيك وفوسفات هيدروجين الصوديوم والجليكاين الممزوج بنسبة مولية 2: 7: 7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: تحليل لتحسين تبلور الإندوثيابسين من شروط PACT MgCl2. أ. خريطة حرارية للنتائج من تحليل ارتباط بيرسون بين درجة الحموضة العازلة وتركيز MgCl2 وتركيز الراسب ومستوى هطول الأمطار وجودة البلورة. تم تقييم كل من مستوى هطول الأمطار وجودة الكريستال بشكل تعسفي على مقياس من 0-5 (مع 0 لا توجد بلورات أو هطول الأمطار) بعد 24 ساعة قبل الميلاد. و D. إظهار أمثلة على التبلور والترسيب في ثلاث قطرات مختلفة. كما يتم عرض حالة التبلور وتقييمات مستوى هطول الأمطار وجودة البلورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: مورفوغرام إندوثيابسين عندما يتبلور في 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2 و PEG 6,000. أ. مورفوغرام تم إنشاؤه من جدول بيانات “مولد مخطط الطور” المقدم. يشار إلى العدد النسبي للبلورات في كل قطرة بحجم الدوائر ، ويتم تمييز النتائج من الانخفاض 1 (البروتين والمرسب) والقطرة 2 (البروتين والراسب والبذور) باللون الأخضر والأزرق ، على التوالي. تشير قيم البروتين وتركيزات المرسب ، على المحور x و y ، على التوالي ، إلى قيم سابقة الخلط لكل منها بدلا من الأحجام النهائية. بناء على النتائج، تم رسم خطوط سوداء وخط أرجواني لتوضيح حدود منطقة التنوي والمنطقة شبه المستقرة، على الترتيب. ب. ج. د. عرض بعض الأمثلة على نتائج التجربة. تشير النقاط الحمراء والزرقاء المميزة على A. إلى مواقع B. و C. و D. ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 7: تجارب التحجيم الأولية للإندوثيابسين في ألواح إسقاط معلقة من 24 بئرا. تم استخدام نفس تركيزات البروتين والراسب لجميع المسارات: 100 مجم / مل إندوثيابسين في 0.1 M Na Acetate pH 4.6 و 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl2 و 30٪ (w / v) PEG 6,000 ، على التوالي. تم التقاط جميع الصور المعروضة بعد 24 ساعة ويتم تسمية أحجام الإسقاط النهائية على كل صورة. اللوحة اليسرى (A و D و G) عبارة عن مزيج 1: 1 من البروتين والراسب ، واللوحة الوسطى (B و E و H) عبارة عن مزيج 1: 2: 3 من البذور والراسب والبروتين واللوحة اليمنى (C و F و I) هي صور مكبرة للوحة الوسطى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 8: تحليل التبلور الدقيق للإندوثيابسين في أحجام 200-300 ميكرولتر. يوضح A. و C . كيف تغير Xn خلال وقت التجربة. ب. و D . توضح كيف تغير Xs (أطول بعد) بمرور الوقت. تم فصل نتائج التجارب من أجل الوضوح. يظهر الخط الأحمر المنقط على C . و D . النقطة التي تم فيها إجراء التبريد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 9: نتائج CC1/2 وصور البلورات التي تم الحصول عليها في كل مرحلة من مراحل عملية التبلور الدقيق لتقييم جودة الحيود أ. تم رسم CC 1/2 مقابل الدقة من البيانات التي تم جمعها من البلورات المزروعة: مع وبدون Mg – جزء من تحسين المرحلة 1 ، بحجم 200 nL ، وحجم 10 ميكرولتر والحجم النهائي 300 ميكرولتر. يظهر BC و D. البلورات من حجم 200 nL و 10 μL و 300 μL على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. معلومات البروتين بروتين إندوثيابسين الوزن الجزيئي (كيلو دالتون) 33.8 مجموعة الفضاء ص 12 11 أ ، ب ، ج (Å) 45.2, 73.3, 52.7 α, β, ɣ (°) 90.0, 109.2, 90.0 معلمات الهدف الثابت حجم التحميل لكل شريحة (ميكرولتر) 150 Aperatures لكل رقاقة 25,600 تركيز البلورة المطلوب (بلورات / مل) 500,000 معلومات عينة كتلة البروتين المستخدمة لصنع 200 ميكرولتر من العينة (ملغ) 10 أطول أبعاد كريستالية (ميكرومتر) 15 تركيز البلورة (بلورات / مل) 2,500,000 المتغيرات التجريبية عدد النقاط الزمنية المطلوبة 5 عدد الصور المطلوبة لكل نقطة زمنية 50,000 معدل الإصابة (الأنماط / الصور المدمجة التي تم جمعها) 0.3 الأهداف الثابتة المطلوبة لكل نقطة زمنية (مقربة لأعلى) 7 متطلبات العينة حجم العينة المطلوب لكل نقطة زمنية (ميكرولتر) 1,050 إجمالي حجم العينة المطلوب للتجربة (مل) 5.25 الكتلة الكلية للبروتين المطلوب (ملغ) 52.5 الجدول 1: مثال على متطلبات العينة لتجربة مسبار مضخة بصرية افتراضية أجريت باستخدام أهداف ثابتة. كان البروتين المستخدم في هذه التجربة النظرية هو إندوثيابسين. استندت المعلمات ذات الهدف الثابت إلى التجارب المبلغ عنها في Ebrahim et al. (2019) 48 و Davy et al. (2019) 49. جاءت معلومات العينة من البروتوكول الذي تم الإبلاغ عنه في مقالة الفيديو هذه وكانت المتغيرات التجريبية تقديرات متحفظة تستند إلى التجربة الحية. تم حساب متطلبات العينة التالية لاحقا في ضوء الافتراضات السابقة.

Discussion

توضح الطريقة المقدمة كيفية تحسين تبلور endothiapepsin من بلورات كبيرة (أطول بعد ≥ 100 ميكرومتر) ، نمت في شاشات متفرقة ذات مصفوفة 96 بئرا ، إلى بلورات دقيقة ، نمت في أنابيب طرد مركزي (حجم 300 ميكرولتر) عبر الدفعة. الفكرة وراء البروتوكول هي أن الخطوات المتخذة لتحسين endothiapepsin يمكن استخدامها أيضا للبروتينات الأخرى. في نهاية المطاف ، الإجابة على مشكلة إنشاء كميات كبيرة (>100 ميكرولتر) من البلورات الدقيقة (10-20 ميكرومتر) لتجارب علم البلورات التسلسلية في XFELs والسنكروترونات.

يقسم البروتوكول مهمة التبلور الدقيق كبير الحجم إلى ثلاث خطوات: (1) تحسين مورفولوجيا البلورة ، (2) الانتقال إلى الدفعة ، و (3) التحجيم. في الخطوة 1 ، يجب استكشاف مجموعة الأشكال البلورية التي يمكن أن ينتجها البروتين في ألواح انتشار البخار. يجب أن تكون الظروف التي تؤدي إلى بلورات مفردة تشبه الصندوق تنحرف إلى الدقة المطلوبة هي الهدف. في الخطوة 2 ، يمكن بعد ذلك تحويل الظروف المحددة من انتشار البخار إلى الدفعة. هنا ، معيار التحسين هو وقت نمو البلورات وإيجاد الظروف التي تؤدي إلى بلورات البروتين في غضون 24 ساعة. يمكن أيضا رسم مورفوجرام لإعطاء المجرب فكرة عن موقع خط الذوبان وحدود منطقة النواة. هذا المورفوغرام له فائدة كبيرة في الخطوة 3 ، التحجيم. سيعطي المورفوجرام مؤشرا على ما إذا كانت النواة وحدها يمكن أن تزيد X_n وتدفع X_s إلى أسفل. مع زيادة حجم التجربة ، يمكن تقييم X_n و X_s باستمرار كمعايير رئيسية لتوسيع نطاق النجاح.

في حالة Endothiapepsin ، اكتشفت الخطوة 1 ما يحتمل أن يكون مورفولوجيا بلورية غير معروفة سابقا ل endothiapepsin. كان لهذا التشكل نفس المجموعة الفضائية مثل تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، ولكن الأهم من ذلك بالنسبة لعلم البلورات التسلسلي ، شكل يشبه الصندوق. يبدو أيضا أن البلورات المفردة تنمو من نقاط نواة مفردة ، على عكس المراوح التي تم إنشاؤها من ظروف أخرى (الشكل 4). بالنسبة للحالة المحددة ، كانت الخطوة 2 راضية جزئيا بالفعل حيث حدث نمو بلوري في < 24 ساعة. أشار المورفوجرام إلى أن كلا من بروتوكول الدفعات المستقيمة أو المصنفة قد يكون ناجحا عند التوسع في الخطوة 3. أدى التحجيم الأولي في دفعة مستقيمة إلى إنشاء حالة أنتجت بلورات بنطاق X_n و X_s من 3.6 ± 1.2 × 10⁶ بلورات · ^mL-1 و 42 ± 4.1 ميكرومتر ، على التوالي. هذه البلورات ، على الرغم من أنها مقبولة لبعض تجارب علم البلورات التسلسلي ، اعتبرت كبيرة جدا. لذلك تم إجراء تحسينات إضافية. أنتج البروتوكول النهائي بلورات بتركيز ونطاق حجم 3.1 × 10⁶ بلورات · مل ^-1 و 15 ± 3.9 ميكرومتر ، على التوالي. كان هذا أكثر من مثالي للتجارب المخطط لها.

تركز الطريقة على تحويل بلورات البروتين “القابلة للذوبان” المزروعة في ألواح انتشار البخار إلى دفعة. والسبب في هذا التركيز هو أن الغالبية العظمى من بلورات البروتين القابلة للذوبان تزرع عن طريق انتشار البخار²⁶. ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق المفاهيم المقدمة على بلورات البروتين القابلة للذوبان المزروعة باستخدام طرق أخرى ، مثل الدفعة الدقيقة. قد تكون المفاهيم قابلة للتطبيق أيضا على بلورات البروتين الغشائية المزروعة في LCP. لأن هذه أيضا عملية بلورة دفعية.

يتمثل أحد الجوانب الرئيسية للبروتوكول في عملية تحويل ظروف البلورات المزروعة في ألواح انتشار البخار بحيث يمكن زراعتها دفعة واحدة. لهذا التحول ، تستخدم الطريقة المعيار الذي اقترحه Beale et al. (2019) ²⁶. تتشكل البلورات المزروعة عبر عملية الدفعات ، حتى في ألواح انتشار البخار ، بسرعة (< 24 ساعة). هذا المعيار هو تقريب يعتمد على سرعة توازن انخفاض انتشار البخار ، وهو أكثر صحة بالنسبة لظروف الراسب القائمة على PEG. ومع ذلك ، ستحتوي ظروف التبلور على مجموعة متنوعة من المركبات التي ستؤثر على وقت التوازن. يمكن أن يحدث توازن ظروف التبلور القائمة على الملح ، على سبيل المثال كلوريد الأمونيوم عالي التركيز ، في 1-2 أيام. لذلك ، قد لا يكون معيار 24 ساعة صحيحا بالنسبة للظروف القائمة على الملح. يمكن أن تحتوي الظروف القائمة على الملح أيضا على مخططات طور أكثر تعقيدا ^26,30 قد لا تتوافق مع النموذج الأصلي المقدم في هذا البروتوكول. قد يكون من الضروري تقليل المعيار الزمني للظروف القائمة على الملح إلى 12 أو 6 ساعات إذا ثبت أن التوسع إلى أحجام أكبر مستحيل.

قيد آخر لهذه الطريقة هو تعقيدها الواضح. البروتوكول الذي تم اتباعه لتحسين التبلور الدقيق للإندوثيابسين غير الحالة الأصلية من شاشة المصفوفة المتناثرة قليلا نسبيا. كانت الضربة الأولى التي لوحظت في شاشة PACT هي 0.1 HEPES pH 7.0 و 0.2 M MgCl₂ و 20٪ (وزن / حجم) PEG 6000. كان المخزن المؤقت النهائي للتبلور المتدرج 0.1 Tris-HCl pH 7.0 و 0.15 M MgCl₂ و 40٪ (w / v) PEG 6000. من الممكن أيضا أن يكون التغيير في المخزن المؤقت من HEPES إلى Tris-HCl ، وتركيز MgCl₂ ، قد ساهم قليلا في نجاح العملية. ترك الزيادة في تركيز PEG 6,000 هو التحسين الوحيد ، والذي كان من الممكن تحقيقه بكل بساطة.

غير أن هذا التقييم مفرط في التبسيط. إنه لا يقلل فقط من المشاكل التي تواجهها أثناء التحجيم (أي استخدام البذور والتبريد) ، ولكن أيضا حقيقة أنه لمجرد أن هذا البروتين أثبت أنه واضح ومباشر ، فليس هناك ما يضمن أن البروتين التالي سيثبت أيضا. تم وضع الخطوات الموصى بها في البروتوكول لأن تحسين حجم أحجام بلورة البروتين يمكن أن يكون مكلفا للغاية بالنسبة للبروتين. خلال تجارب تحجيم الإندوثيابسين السبع الموضحة ، تم استهلاك 100 ملغ من البروتين. ومن المسلم به أن بعض هذه الخطوات قد نفذت لإظهار عواقبها في ضوء هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن 100 ملغ من البروتين ، بالإضافة إلى 50 ملغ أخرى للبروتين المستهلك أثناء التجربة (الجدول 1) ، يمكن أن يكون استثمارا كبيرا في الوقت أو المال.

لحسن الحظ ، ليس من الواضح أن هذه الكتلة من العينة المطلوبة موجودة في كل مكان عبر جميع البروتينات. كان Endothiapepsin قابلا للذوبان بدرجة عالية ، وبالتالي يتطلب تركيزا كبيرا من البروتين للوصول إلى التشبع الفائق. في حالات أخرى (قيد التحسين حاليا) ، يمكن الوصول إلى التشبع الفائق عند 10 أو حتى 5 مجم / مل. هذه المتغيرات خاصة بالبروتين وتحتاج إلى تبنيها عند ظهورها.

تشمل القيود الأخرى للطريقة اعتمادها على المعدات المعقدة مثل روبوتات معالجة السوائل لإنشاء الشاشة واللوحة ، وأجهزة التصوير لتصوير اللوحات تلقائيا عند الحاجة. تم تقديم إجراءات بديلة للحد من الحاجة إلى بعض هذه القطع من المعدات ، لكن البروتوكول سيستغرق وقتا أطول للمتابعة بدونها. يقترح البروتوكول أيضا اختبار حيود البلورات المحسنة. بالنسبة لعلماء البلورات الذين ليس لديهم وصول منتظم إلى السنكروترون ، قد تكون هذه الاختبارات صعبة. قد لا تكون عناصر التحكم في كل خطوة ضرورية ، ولكن يوصى بشدة بهذه الاختبارات بمجرد تحديد النتيجة ، وقبل القياس وبعده. البلورات غير الحيود في XFEL ، للأسف ، ليست أمرا غير شائع. بالنظر إلى هذا ، من الأفضل أن نخطئ في جانب الحذر فيما يتعلق بالافتراضات حول حيود البلورة.

في النهاية ، سيقدم هذا البروتوكول والنتائج المعروضة هنا دليلا وأفكارا ومثالا لأولئك الذين يكافحون من أجل إنتاج عينات لتجارب علم البلورات التسلسلية. ومن المأمول، مع زيادة تطوير علم البلورات التسلسلي، أن تقل متطلبات العينات لهذه التقنية بحيث تقل الحاجة إلى بروتوكولات كهذه. ومع ذلك ، حتى في هذا الحدث ، ستظل الاستراتيجيات المقدمة هنا مفيدة لأولئك الذين يرغبون في استكشاف مساحة تبلور البروتين الخاصة بهم.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie رقم 701647. شكرا جزيلا لمساعدة ودعم علماء خط الشعاع في خط شعاع مصدر الضوء السويسري X10SA-PXII.

Materials

Swissci 96-well 2-Drop plates	Molecular Dimensions	MD11-002	96-well 2-drop crystallisation plate
Swissci 96-well 3-Drop plates	Molecular Dimensions	MD11-003	96-well 3-drop crystallisation plate
mosquito LCP liquid handling robot	sptlabtech	mosquito LCP	Crystallisation robot
ClearVue Sheets	Molecular Dimensions	MD6-015	96-well crystallization plate seals
Safe-Tube 1.5 mL	Eppendorf	30120086	1.5 mL centrifuge tubes
Scaple	Swan and Morton	No. 3 scalple and No. 3 handle	Scalple for cutting open plate seals
MS 3 Vortex	IKA	3319000	Vortex for mixing solution and making seed stocks
24-well XRL Plate	Molecular Dimensions	MD3-11	24-well hanging-drop plates
Tube revolver/rotator	Thermo Fischer Scientific	88881001	Tube revolver for mixing solution during scaling
Eppendorf Research plus pipettes	Eppendorf		Range of manual pipettes, 0.5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 µL
Eppendorf pipette tips	Eppendorf		Range of tip sizes for manual pipettes
Suparen 600	Prochem AG	Suparen 600	Endothiapepsin solution
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	241245-1KG	Sodium Acetate
Tris	Merck	8382T014	Tris
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M2670-1kg	Magnesium Chloride
PEG 6,000	Sigma-Aldrich	81255-1kg	PEG 6,000
Ethelyene glycol	Sigma-Aldrich	324558-1L	Ethelyene glycol for cyro-protecting the crystals
PACT Premier HT screen	Molecular Dimensions	MD1-36	PACT Premier 96-well crystal screen
DOW CORNING high vacuum grease	Molecular Dimensions	MD6-02	Grease for sealing 24-well plates
Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides	Hirschmann	8000104	Cover slides for sealing 24-well sitting drop plates
Crystal pins	PSI	Manufactured inhouse	Thin-film supports for micro-crystals.
1-1.3 mm SiLibeads Type S	Faust	6239547	Glass beads for making mico-seed stocks
Macbook Pro	Apple	Macbook Pro	Computer for performing data analysis
CCP4 software suite	CCP4		Diffraction pattern data processing software
Excel	Microsoft	Microsoft Office	Plotting tool for phase diagram
Hausser Scientific Bright-Line counting chamber	Thermo Fischer Scientific	02-671-51B	Tool to calculate crystal concentration
PACT Premier	Molecular Dimensions	MD1-29-ECO	Sparse-matrix crystallization screen
Rock Imager	Formulatrix	Rock Imager	Temperature controlled crystal plate storage and imager
Rock MakerWeb	Formulatrix	Rock MakerWeb	Crystal plate creation and image storage stoftware
Formulator	Formulatrix	Formulator	96-well crystal screen creation liquid handling robot
Leica MZ16 Microscope	Leica	Leica MZ16	Light microscope
LAS V4.6	Leica	LAS V4.6	Software for Leica microscopes
Spectra/Por 3.5 kDa dialysis tubing	Spectrumlabs	Spectra/Por 3 Dialysis Membrane	3.5 kDa dialysis membrane
Dialysis tubing closures	Spectrumlabs	Spectra/Por 3 Duniversal Closures	Clips to seal the dialysis tubing ends
Amicon 10 kDa centrifugal concentrator	Merck-Millipore	Amicon Ultra-15 10 kDa centrifugal concentrator	10 kDa centrifugal filter
5810 R swing bucket centrifuge	Eppendorf	5810 R Centrifuge	Swing bucket centrifuge

References

DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. Journal of Physics D: Applied Physics. 41 (19), 195505 (2008).
Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Scientific Reports. 4 (1), 6026 (2014).
Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5 (1), 1-6 (2014).
Roessler, C. G. G., et al. Acoustic Injectors for Drop-On-Demand Serial Femtosecond Crystallography. Structure. 24 (4), 631-640 (2016).
Sherrell, D. A., et al. A modular and compact portable mini-endstation for high-precision, high-speed fixed target serial crystallography at FEL and synchrotron sources. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1372-1378 (2015).
Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5 (1), 1-11 (2015).
Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
Nango, E., et al. A three-dimensionalmovie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
Fraser, J. S., et al. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
Fenwick, R. B., van den Bedem, H., Fraser, J. S., Wright, P. E. Integrated description of protein dynamics from room-temperature X-ray crystallography and NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (4), 445-454 (2014).
Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. Elife. 4, (2015).
Thomaston, J. L., et al. XFEL structures of the influenza M2 proton channel: Room temperature water networks and insights into proton conduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 13357-13362 (2017).
Haas, D. J., Rossmann, M. G. Crystallographic studies on lactate dehydrogenase at -75 °C. Acta Crystallographica Section B Structural Crystallography and Crystal Chemistry. 26 (7), 998-1004 (1970).
Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
Wu, W., et al. Batch crystallization of rhodopsin for structural dynamics using an X-ray free-electron laser. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 71 (7), 856-860 (2015).
Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and delivery of protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
Andersson, R., et al. Well-based crystallization of lipidic cubic phase microcrystals for serial X-ray crystallography experiments. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (10), 937-946 (2019).
Luft, J. R., et al. The detection and subsequent volume optimization of biological nanocrystals. Structural Dynamics. 2 (4), 041710 (2015).
Lee, D. B., et al. Supersaturation-controlled microcrystallization and visualization analysis for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
Kupitz, C., et al. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1647), 20130316 (2014).
Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
Rayment, I. Small-scale batch crystallization of proteins revisited: An underutilized way to grow large protein crystals. Structure. 10 (2), 147-151 (2002).
García-Ruiz, J. M. Nucleation of protein crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 22-31 (2003).
McPherson, A., Kuznetsov, Y. G. Mechanisms, kinetics, impurities and defects: Consequences in macromolecular crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (4), 384-403 (2014).
Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71, 247-260 (2015).
Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
Forsythe, E. L., Maxwell, D. L., Pusey, M. Vapor diffusion, nucleation rates and the reservoir to crystallization volume ratio. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (10), 1601-1605 (2002).
Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Maeder, D. L., Blow, D. M. IUCr An automated system for micro-batch protein crystallization and screening. Journal of Applied Crystallography. 23 (4), 297-302 (1990).
Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil – a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
Chayen, N. E. Comparative studies of protein crystallization by vapour-diffusion and microbatch techniques. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (1), 8-15 (1998).
D’Arcy, A., Mac Sweeney, A., Stihle, M., Haber, A. The advantages of using a modified microbatch method for rapid screening of protein crystallization conditions. Acta Crystallographica – Section D Biological Crystallography. 59 (2), 396-399 (2003).
Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
Cheng, R. K. Y. Towards an optimal sample delivery method for serial crystallography at XFEL. Crystals. 10 (3), 215 (2020).
Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. 2013, 1-10 (2013).
Oberthuer, D., et al. Double-flow focused liquid injector for efficient serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 44628 (2017).
McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, 2-20 (2014).
Yaoi, M., et al. Effect of stirring method on protein crystallization. Japanese Journal of Applied Physics, Part 2: Letters. 43 (10), 1318 (2004).
Castro, F., Ferreira, A., Teixeira, J. J., Rocha, F. Influence of Mixing Intensity on Lysozyme Crystallization in a Meso Oscillatory Flow Reactor. Crystal Growth & Design. 18 (10), 5940-5946 (2018).
Moews, P. C., Bunn, C. W. An X-ray crystallographic study of the rennin-like enzyme of Endothia parasitica. Journal of Molecular Biology. 54 (2), 395-397 (1970).
Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta crystallographica. Section D, Biological. 61, 1426-1431 (2005).
Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75, 151-159 (2019).
Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Beale, J. H., Marsh, M. E. Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments. J. Vis. Exp. (168), e61896, doi:10.3791/61896 (2021).

Automatically Generated