発見駆動型宿主間相互作用のためのラベルフリー定量プロテオミクスワークフロー

侵襲性真菌感染症の有病率は非常に増加しており、容認できないほど高い死亡率と相関しており、免疫不全素因を有する個体で最も一般的に報告される^1。クリプトコッカス・ネオフォーマンは、宿主マクロファージ細胞内で細胞内生存が可能な悪名高い日和見真菌病原体である。不十分な抗真菌介入は、真菌の播種およびクリプトコッカス髄膜炎および髄膜脳炎の生命を脅かす症状^{をもたらす 2,3}.免疫不全状態の世界的な増加は、C.ネオフォーマンを含む多くの真菌種が^4、5、6に対する耐性をますます進化させた抗真菌剤の使用の並行増加^を要求している。したがって、宿主の防御応答と微生物の病因に関する重要な生物学的質問に答えるために、堅牢で効率的な技術を実装することが不可欠です。

強力な計算およびバイオインフォマティクスパイプラインの生成を含む質量分析(MS)の技術進歩の新時代は、宿主病原体研究^7,8の大規模分析のための統合的ビジョンの基礎を提供する。従来の病原体主導のプロテオミクス解析は、タンパク質相関プロファイリング、プロテオミクスと結合したアフィニティークロマトグラフィー、およびインタークトミクス⁹などの包括的な方法論を含む、宿主または病原体の観点から感染の見解を一般的にプロファイルする。ホストシステムにおける危険病原体の病原性に関する調査は、非常に臨床的に重要である。しかし、単一の実験での二重遠近解析の適用は、以前は達成不可能と考えられていました。例えば、感染に対する病原体の視点は、多くの場合、低い豊富な真菌タンパク質の検出のための感度を低下させる豊富な宿主タンパク質によって圧倒^{される7。}さらに、高いサンプルの複雑さは、単一の実験システムで調査するために多くのターゲットを招き、特定の病原体タンパク質の作用機序を解明する挑戦を証明する。

ボトムアッププロテオミクスは、管理しやすいサンプル調製を可能にする一般的なMS技術であり、その後に液体クロマトグラフィー分離、同定、定量を^MS10、11で配列特異的酵素消化してペプチドを生成する。ここでは、感染に基づくプロテオームまたは「感染性」の公平なカバレッジを達成することを目的としたデータ依存的な取得戦略を示す方法を提示する。具体的には、ラベルフリー定量(LFQ)は、複数のプロテオーム間でタンパク質レベル変化を確実かつ正確に同定するための化学的または代謝ラベルへの依存性を低下させ、サンプル処理および処理ステップ^12、13を低減する。この普遍的なアプリケーションは、任意の予想されるタンパク質産生とは無関係に細胞内の特定の瞬間に産生されたタンパク質を尋問します。したがって、感染に不可欠な新しい洞察が発見される可能性があります。

本明細書に記載されているワークフローは、宿主免疫細胞を用いた感染模倣状態の間の C.ネオフォーマン のタンパク質レベル変化を探索するために最適化される(図1)。このアプローチは、細胞型の分離と分離に頼るのではなく、宿主と病原体プロテオームを一緒に抽出し、生物特異的な2つのデータベースを用いた生物情報分離を利用して、種特異的タンパク質産生を区別する。この方法は、同位体ベースのラベリング研究または分画に必要な余分なコストのかかる準備ステップなしで処理されるサンプルの無制限の数のための利点を提供します。さらに、このワークフローは、宿主の免疫細胞を標的化し感染させることができる幅広い真菌および細菌病原体に伝達可能な最適化されたタンパク質抽出プロトコルをサポートします。全体として、このプロトコルは、高分解能MSのための公平なタンパク質抽出とサンプル処理を完了するための手順を概説し、続いて、感染に有意な真菌タンパク質に関する豊富な知識を提供し、宿主防御応答の包括的なプロファイリングを行うことができるデータおよび統計分析を行う。