Flusso di lavoro proteomica quantitativa senza etichette per interazioni host-patogeno guidate dalla scoperta

La prevalenza di infezioni fungine invasive è in costante aumento ed è correlata a tassi di mortalità inaccettabilmente elevati, più comunemente riportati in individui con predisposizioni immunodifese¹. Cryptococcus neoformans è un noto agente patogeno fungino opportunistico in grado di sopravvivere intracellulare all’interno delle cellule macrofagi ospiti. Un intervento antimicotico inadeguato si traduce in diffusione fungina e manifestazioni potenzialmente letali di meningite criptococcica e meningoencefalite^2,3. L’aumento globale dello status immunocomprotologico ha richiesto un parallelo aumento dell’uso di agenti antifungini, in cui molte specie fungine, tra cui c. neoformani, hanno sempre più evoluto la resistenza verso^4,5,6. Pertanto, è imperativo implementare tecnologie solide ed efficienti per rispondere a domande biologiche vitali riguardanti la risposta alla difesa dell’ospite e la patogenesi microbica.

La nuova era del progresso tecnologico nella spettrometria di massa (SM), compresa la generazione di potenti condotte computazionali e bioinformatiche, fornisce le basi per una visione integrativa per l’analisi su larga scala della ricerca ospite-patogeno^7,8. L’analisi proteomica convenzionale basata sulla patogenesi profila comunemente la vista dell’infezione dal punto di vista dell’ospite o dell’agente patogeno, incluse metodologie complete come il profilo di correlazione proteica, la cromatografia di affinità combinata con la proteomica e l’interaomica⁹. Le indagini sulla virulenza di agenti patogeni pericolosi in un sistema ospite sono di immensa importanza clinica; tuttavia, l’applicazione di un’analisi duale prospettica in un singolo esperimento era precedentemente considerata irraggiungibile. Ad esempio, la prospettiva dell’agente patogeno verso l’infezione è spesso sopraffatta da proteine ospiti altamente abbondanti con conseguente ridotta sensibilità per il rilevamento di proteine fungine a basso contenuto abbondante⁷. Inoltre, l’elevata complessità del campione invita molti obiettivi a indagare in un unico sistema sperimentale e si rivela difficile chiarire i meccanismi di azione per una specifica proteina patogena.

La proteomica bottom-up è una tecnica MS popolare che consente la preparazione gestibile del campione, in cui i peptidi sono generati dalla digestione enzimatica specifica della sequenza seguita dalla separazione, identificazione e quantificazione della cromatografia liquida da parte di MS^10,11. Qui presentiamo un metodo che dimostra una strategia di acquisizione dipendente dai dati volta a ottenere una copertura imparziale di un proteoma o “infectome” basato sull’infezione. In particolare, la quantificazione senza etichette (LFQ) perde la dipendenza dalle etichette chimiche o metaboliche per un’identificazione robusta e accurata dei cambiamenti del livello proteico tra più proteomi, riducendo le fasi di manipolazione e^{lavorazione del campione 12,13}. Questa applicazione universale interroga le proteine prodotte in un dato momento all’interno di una cellula indipendente da qualsiasi produzione proteica prevista; pertanto, si possono scoprire nuove intuizioni che sono fondamentali per l’infezione.

Il flusso di lavoro descritto nel presente documento è ottimizzato per esplorare i cambiamenti a livello proteico dei neoformani C. durante le condizioni di imitazione delle infezioni con le cellule immunitarie ospiti (Figura 1). Piuttosto che basarsi sull’isolamento e la separazione dei tipi di cellule, questo approccio estrae insieme il proteoma ospite e patogeno e utilizza la separazione bioinformatica utilizzando due database specifici dell’organismo per distinguere la produzione proteica specifica delle specie. Questo metodo offre vantaggi per un numero illimitato di campioni da trattare senza le costose fasi di preparazione necessarie negli studi sull’etichettatura o nel frazionamento a base di isotopi. Inoltre, questo flusso di lavoro supporta protocolli di estrazione proteica ottimizzati trasferibili a una vasta gamma di agenti patogeni fungini e batterici in grado di colpire e infettare le cellule immunitarie ospiti. Nel complesso, questo protocollo delinea i passaggi per completare un’estrazione di proteine imparziali e l’elaborazione del campione per la SM ad alta risoluzione, seguita da dati e analisi statistiche, in grado di fornire una ricchezza di conoscenza delle proteine fungine significative per l’infezione combinate con una profilazione completa della risposta della difesa ospite.