Flux de travail quantitatif protéomique sans étiquette pour les interactions hôte-pathogène axées sur la découverte

La prévalence des infections fongiques invasives augmente considérablement et est corrélée avec des taux de mortalité inacceptablement élevés, le plus souvent signalés chez les personnes ayant des prédispositions immunodéficientes¹. Cryptococcus neoformans est un pathogène fongique opportuniste notoire capable de survie intracellulaire dans les cellules macrophages hôtes. L’intervention antifongique inadéquate a comme résultat la diffusion fongique et les manifestations représentant un danger pour la vie de la méningite cryptococcique et de la méningoencéphalite^2,3. L’augmentation mondiale du statut immunocompromisé a exigé une augmentation parallèle de l’utilisation d’agents antifongiques, dans laquelle de nombreuses espèces fongiques, y compris les néoformans C. ont de plus en plus évolué résistance vers^4,5,6. Par conséquent, il est impératif de mettre en œuvre des technologies robustes et efficaces pour répondre aux questions biologiques vitales concernant la réponse de la défense de l’hôte et la pathogénie microbienne.

La nouvelle ère du progrès technologique en spectrométrie de masse (SP), y compris la génération de puissants pipelines informatiques et bioinformatiques, fournit les bases d’une vision intégrative pour l’analyse à grande échelle de la recherche sur les pathogènes^{hôtes 7,8}. L’analyse protéomique conventionnelle axée sur la pathogénie dresse généralement le portrait de l’infection du point de vue de l’hôte ou de l’agent pathogène, y compris des méthodologies complètes telles que le profilage de corrélation protéique, la chromatographie par affinité combinée à la protéomique et l’interactomique⁹. Les études sur la virulence des agents pathogènes dangereux dans un système hôte sont d’une immense importance clinique; toutefois, l’application d’une analyse à double perspective dans une seule expérience était autrefois considérée comme inaccessible. Par exemple, la perspective de l’agent pathogène à l’égard de l’infection est souvent submergée par des protéines hôtes très abondantes, ce qui réduit la sensibilité à la détection de protéines fongiques^{faiblement abondantes 7}. En outre, la grande complexité de l’échantillon invite de nombreuses cibles à étudier dans un seul système expérimental et s’avère difficile à élucider les mécanismes d’action pour une protéine pathogène spécifique.

La protéomique ascendante est une technique populaire de SP qui permet une préparation gérable de l’échantillon, dans laquelle les peptides sont générés par digestion enzymatique spécifique à la séquence suivie d’une séparation, d’une identification et d’une quantification de la chromatographie liquide par MS^10,11. Ici, nous présentons une méthode démontrant une stratégie d’acquisition dépendante des données visant à atteindre une couverture impartiale d’un protéome ou d’un « infectome » basé sur l’infection. Plus précisément, la quantification sans étiquette (LFQ) réduit la dépendance à l’égard des étiquettes chimiques ou métaboliques pour une identification robuste et précise des changements de niveau de protéines à travers de multiples protéomes, réduisant ainsi les étapes de manipulation et de traitement^{des échantillons 12,13}. Cette application universelle interroge les protéines produites à un moment donné au sein d’une cellule indépendante de toute production de protéines attendue; ainsi, de nouvelles idées peuvent être découvertes qui sont critiques à l’infection.

Le flux de travail décrit ci-après est optimisé pour explorer les changements de niveau de protéines des néoformans C. pendant les conditions d’imitation de l’infection avec les cellules immunitaires hôtes ( figure1). Plutôt que de s’appuyer sur l’isolement et la séparation des types de cellules, cette approche extrait ensemble le protéome de l’hôte et de l’agent pathogène, et utilise la séparation bioinformatique à l’aide de deux bases de données spécifiques à l’organisme pour distinguer la production de protéines propres à chaque espèce. Cette méthode offre des avantages pour un nombre illimité d’échantillons à traiter sans les étapes de préparation supplémentaires coûteuses nécessaires dans les études d’étiquetage à base d’isotopes ou la fractionnement. En outre, ce flux de travail prend en charge des protocoles optimisés d’extraction de protéines transférables à un large éventail d’agents pathogènes fongiques et bactériens capables de cibler et d’infecter les cellules immunitaires hôtes. Dans l’ensemble, ce protocole décrit les étapes à suivre pour effectuer une extraction impartiale des protéines et le traitement de l’échantillon pour la SP à haute résolution, suivi de données et d’analyses statistiques, capables de fournir une mine de connaissances sur les protéines fongiques importantes pour l’infection combinées à un profilage complet de la réponse de la défense de l’hôte.