Vi præsenterer en metode, der er specielt skræddersyet til at afbilde hele hjernen hos voksne Drosophila under adfærd og som reaktion på stimuli. Hovedet er placeret for at give optisk adgang til hele hjernen, mens fluen kan bevæge sine ben og antenner, spidsen af proboscis, og øjnene kan modtage sensoriske stimuli.
Vi præsenterer en metode udviklet specielt til at billedet hele Drosophila hjernen under løbende adfærd såsom at gå. Hovedfiksering og dissektion er optimeret for at minimere deres indvirkning på adfærd. Dette opnås først ved hjælp af en holder, der minimerer bevægelseshindringer. Bagsiden af fluens hoved er limet til denne holder i en vinkel, der giver optisk adgang til hele hjernen, samtidig med at fluens evne til at gå, soignere, lugte, smage og se. Bagsiden af hovedet dissekeres for at fjerne væv i den optiske sti og muskler, der er ansvarlige for hovedbevægelsesgenstande. Fluehjernen kan efterfølgende afbildes for at registrere hjerneaktivitet, for eksempel ved hjælp af calcium- eller spændingsindikatorer, under specifik adfærd som gang eller pleje og som reaktion på forskellige stimuli. Når den udfordrende dissektion, som kræver betydelig praksis, er blevet mestret, denne teknik gør det muligt at registrere rige datasæt, der vedrører hele hjernens aktivitet til adfærd og stimulus svar.
Imaging hjerneaktivitet ved hjælp af forskellige teknikker har uddybet forståelsen af hjernens funktion. Hos mennesker har hjernebilleddannelsesteknikker vigtige begrænsninger: Mens funktionel magnetisk resonansbilleddannelse (fMRI) tilbyder spatio-temporal opløsning langt under enkelt neuronopløsning, tillader hurtige teknikker som elektroencefalografi (EEG) kun indirekte og delvis adgang til hjernen1. I tilstrækkeligt store dyremodeller såsom gnavere giver registrering af fluorescerende aktivitetssensorer (f.eks. GCaMP) ved hjælp af hovedmonterede mikroskoper mulighed for at observere hjerneaktivitet, mens dyret bevæger sig i sit miljø2. Ikke desto mindre giver disse teknikker i øjeblikket kun adgang til en lille del af hjernen. Hovedfaste dyr kan afbildes mere omfattende, men dækningen er stadig delvis (f.eks. cortexoverfladen3). Det er kun i små dyr, såsom zebrafisk larverne, C. elegans og Drosophila, at hele hjernen kan afbildes med tidsmæssig og rumlig opløsning på niveau med eller tæt på enkelte neuroner4.
D. melanogaster er særligt lovende, fordi det længe har været brugt som en genetisk model organisme5 og kraftfulde genetiske værktøjer er blevet udviklet6. Suppleret med det nye store anatomiske netværk afledt af elektronmikroskopi7, kunne fluen give unikke muligheder for at studere kompleks hjernedynamik genereret på et stort netværk8. Selv om kutikula ikke er gennemsigtig, og skal derfor fjernes for at billedet hjernen, in vivo funktionel billeddannelse er blevet mere og mere almindeligt sted siden den første undersøgelse i 20029 og flere protokoller er allerede blevet offentliggjort. Men disse metoder indebærer enten at adskille fluehovedet fra kroppen10, hvilket i alvorlig grad begrænser fluens bevægelser og/eller reaktioner på stimuli11,12,13,14,15eller kun tillader en lille en del af hjernen, der skal afbildes9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. For at supplere disse ikke desto mindre kraftfulde tilgange udviklede vi for nylig et præparat til at billedet hele hjernen under adfærd og reaktioner på forskellige stimuli28.
Her bygger vi videre på denne undersøgelse for at præsentere en metode, der er specielt udviklet til at afbilde hele hjernen, mens fluen udfører semi-naturalistisk adfærd (dvs. gå og pleje) og reagerer på sensoriske stimuli. Dette opnås ved hjælp af en observationsholder, der er designet til at give adgang til hele hjernen fra den dorsale-bageste side, mens antennerne og proboscis er intakte, og tillader fluen at bevæge benene til at gå (f.eks. på en luftpudet bold). Trin til dissekering af bagsiden af hovedet er blevet raffineret til hastighed, reproducerbarhed og for at minimere deres virkning på flyvens levedygtighed og mobilitet.
Drosophila er et af de sjældne voksne dyr, hvor hele hjernen kan afbildes under kompleks adfærd. Her præsenterer vi en metode til at forberede fluen og udsætte hele sin hjerne for at billedet løbende hele hjernens aktivitet. Der er flere vigtige punkter, der skal bemærkes.
Dissekere et lille dyr som D. melanogaster er udfordrende. Metoden kræver derfor en masse praksis og tålmodighed til at mestre det. Efter træning tager proceduren dog mindre end 30 minutter og giver reproducerbare resultater.
Den metode, vi præsenterede, har yderligere begrænsninger. For det første fører vippe fluehovedet fra sin naturlige position til at strække halsen, hvilket kan være skadeligt for bindevæv, nerver eller muskler. For det andet, selv om den ventrale subesophageal zone (SEZ) er optisk tilgængelig, er den under den halvgennemsigtige spiserøret, hvilket reducerer intensiteten og opløsningen i dette område. Endelig, selvom indehaveren er uden for rækkevidde i de fleste retninger, indser fluen stadig nogle gange sin tilstedeværelse og skubber på den for at forsøge at flygte.
På trods af disse begrænsninger vil de omfattende data, der er opnået fra hele hjernescanning under adfærd og reaktioner på stimuli, gøre det muligt at dechifrere hjernefunktionen på niveau med hele netværket, når dyret interagerer med og navigerer i komplekse, naturalistiske miljøer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Heidi Miller-Mommerskamp for teknisk hjælp og Iveth Melissa Guatibonza Arevalo for nyttige kommentarer til manuskriptet. Indledende versioner af protokollen blev udviklet i laboratoriet af Ralph Greenspan. Dette arbejde blev støttet af den tyske forskningsfond (DFG), især gennem et tilskud PÅ 2705 (TP3) til IGK og af Simons foundation (Aimon – 414701) og Kavli Institute for Brain and Mind (tilskudsnummer #2017-954) modtaget af SA.
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |