Procedimientos de trasplante de médula ósea en ratones para estudiar la hematopoyesis clonal

La hematopoyesis clonal (CH) es una condición que se observa con frecuencia en individuos mayores y ocurre como resultado de un clon expandido de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) portador de una mutación genética^1. Se ha sugerido que a la edad de 50 años, la mayoría de los individuos habrán adquirido un promedio de cinco mutaciones exónicas en cada HSPC^2,pero la mayoría de estas mutaciones resultarán en pocas o ninguna consecuencia fenotípica para el individuo. Sin embargo, si por casualidad una de estas mutaciones confiere una ventaja competitiva al HSPC, por ejemplo, promoviendo su proliferación, auto-renovación, supervivencia o alguna combinación de estos, esto puede conducir a la expansión preferencial del clon mutante en relación con los otros HSPCs. Como consecuencia, la mutación se extenderá cada vez más a través del sistema hematopoyético mientras que el HSPC transformado da lugar a las células de sangre maduras, llevando a una población distinta de células transformadas dentro de la sangre periférica. Mientras que las mutaciones en docenas de genes conductores candidatos diferentes se han asociado con eventos clonales dentro del sistema hematopoyético, entre estos, las mutaciones en el ADN metiltransferasa 3 alfa(DNMT3A)y diez once translocaciones 2(TET2)son las más prevalentes^3. Varios estudios epidemiológicos han encontrado que los individuos que llevan estas mutaciones genéticas tienen un riesgo perceptiblemente más alto de la enfermedad cardiovascular (CVD), del movimiento, y de la mortalidad todo-causal^3,4,5,6,7. Mientras que estos estudios han identificado que existe una asociación entre el CH y la incidencia creciente del CVD y del movimiento, no sabemos si esta relación es causal o un epiphenomenon compartido con el proceso del envejecimiento. Para obtener una mejor comprensión de esta asociación, se requieren modelos animales adecuados que recapitulan correctamente la condición humana del CH.

Varios modelos animales ch han sido establecidos por nuestro grupo y otros utilizando pez cebra, ratones y primates no humanos^{8,9,10,11,12,13,14.} Estos modelos a menudo utilizan métodos de reconstitución hematopoyética mediante trasplante de células modificadas genéticamente, a veces utilizando la recombinación Cre-lox o el sistema CRISPR. Este enfoque permite el análisis de una mutación genética específica en células hematopoyéticas para evaluar cómo contribuye al desarrollo de la enfermedad. Además, estos modelos emplean a menudo las células congénicas o del reportero para distinguir los efectos de células del mutante de las células normales o del salvaje-tipo. En muchos casos, se requiere un régimen de precondicionamiento para injerir con éxito las células madre hematopoyéticas donantes.

Actualmente, el trasplante de médula ósea a ratones receptores se puede dividir en dos categorías principales: 1) condicionamiento mieloablativo y 2) trasplante no condicionado. El condicionamiento mieloablativo puede lograrse por uno de dos métodos, a saber, la irradiación corporal total (LCT) o la quimioterapia¹⁵. La LCT se lleva a cabo sometiendo al receptor a una dosis letal de irradiación gamma o de rayos X, generando roturas de ADN o enlaces cruzados dentro de células que se dividen rápidamente, haciéndolas irreparables¹⁶. Busulfán y ciclofosfamida son dos medicamentos de quimioterapia de uso común que interrumpen el nicho hematopoyético y causan de manera similar daño en el ADN a las células que se dividen rápidamente. El resultado neto del preacondicionamiento mieloablativo es la apoptosis de las células hematopoyéticas, que destruye el sistema hematopoyético del receptor. Esta estrategia no sólo permite el engraftment acertado del HSPCs dispensador de aceite, pero puede también prevenir el rechazo del injerto suprimiendo el sistema inmune del recipiente. Sin embargo, el preacondicionamiento mieloablativo tiene efectos secundarios graves, como daño a los tejidos y órganos y a sus células inmunitarias residentes, así como la destrucción del nicho de médula ósea nativa¹⁷. Por lo tanto, se han propuesto métodos alternativos para superar estos efectos secundarios indeseables, particularmente en lo que respecta al daño a los órganos de interés. Estos métodos incluyen la irradiación blindada de ratones receptores y el BMT adoptivo a ratones no acondicionados^9,17. El blindaje del tórax, la cavidad abdominal, la cabeza u otras regiones de la irradiación mediante la colocación de barreras de plomo mantiene los tejidos de interés protegidos de los efectos perjudiciales de la irradiación y mantiene su población de células inmunes residentes. Por otro lado, el BMT adoptivo de HSPCs a ratones no acondicionados tiene una ventaja adicional porque preserva el nicho hematopoyético nativo. En este manuscrito, se describen los protocolos y resultados de la injerto de HSPC después de varios regímenes de trasplante en ratones, específicamente la entrega de HSPC a ratones TBI, a ratones parcialmente protegidos de la irradiación, y a ratones no acondicionados. El objetivo general es ayudar a los investigadores a comprender los diferentes efectos fisiológicos de cada método, así como cómo afectan los resultados experimentales en el contexto del CH y las enfermedades cardiovasculares.