İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi
Summary
Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.
Abstract
Reseptörler ve enzim proteinleri, biyoaktif küçük moleküller için bağlayıcı hedefler görevi gören önemli biyomoleküllerdir. Bu nedenle, ilaç-protein etkileşimlerinin hızlı ve küresel olarak doğrulanması, sadece terapötik etkinliğin altında kalan moleküler mekanizmaları anlamak için değil, aynı zamanda klinik kullanım için adsorpsiyon, dağılım, metabolizma, atılım ve toksisite (ADMET) gibi ilaç özelliklerini değerlendirmek için de son derece arzu edilir. Burada, faj kapsid üzerinde kolayca görüntülenebilen T7 faj ekranlı kısa peptitlerin biyopanlanması için biyosensör tabanlı yüksek verim stratejisi sunuyoruz. Reseptör ligand contact (RELIC) süitinde biyoinformatik programları kullanan ilaç bağlayıcı bölgelerin “kırık kalıntılar” olarak kısa segmentler içeren peptitlerin amino asit dizilerinin daha sonra analizi de gösterilmiştir. Bu yöntem klinik olarak onaylanmış iki ilaca, bir anti-tümör irinotecan’a ve bir anti-grip oseltamivirine uygulanarak, ilacı tanıyan peptit dizilerinin toplanması ve hedef proteinlerin ilaç bağlayıcı bölgelerinin vurgulanması için ayrıntılı süreç bu makalede açıklanmıştır. Burada açıklanan strateji, ilgi çekici herhangi bir küçük molekül için uygulanabilir.
Introduction
İlaç bağlayıcı hedeflerin belirlenmesi, ilaçların geliştirilmesinin yanı sıra hastalıkların moleküler mekanizmalarının anlaşılması için de gereklidir. Özellikle, reseptör ve enzim proteinleri biyoaktif küçük moleküllerin en önemli moleküler hedefleridir1. Benzeşim yakalama, ilaç bağlayıcı proteinleri tanımlamak için iyi kurulmuş bir teknik olmasına rağmen2, proteinlerin düşük çözünürlüğü gibi teknik sınırlamalar, genellikle ilaç hedeflerinin doğrulanmasını engeller2. En önemlisi, hareketsiz küçük moleküller kenetlenme için gerekli özgürlük derecesini kaybeder ve daha büyük hedef proteinler üzerinde dahili olarak bulunan bağlama bölgelerine erişilemez olabilir. Ayrıca, protein yanlış katlanması, ko-kristalizasyon koşullarının analiz edilemezliği ve moleküler boyuta bağlı sınırlamalar genellikle X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve ilaç-protein etkileşimlerini incelemek için diğer deneysel analizlerin kullanımını engeller.
T7 faj ekran biyopanning kullanımı, küçük molekül yemleri için proteinler üzerindeki bağlama bölgesini belirlemek için etkili bir yoldur3. Özellikle, sentetik DNA’nın çoklu klonlama bölgesine yerleştirilmesiyle oluşturulabilen T7 fajlı rastgele peptit kütüphanesi etkilidir. Proteinleri görüntüleyen T7 faj kütüphanesi ile karşılaştırıldığında, kısa peptitler fiziksel kısıtlamalar olmadan T7 faj kapsidinde görüntülenecek şekilde kolayca tasarlanmıştır, bu da katı bir destek üzerine sabitlenmiş herhangi bir küçük molekül ilacı ile sterik olarak temas edebilir2. Ayrıca, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörün T7 faj ekran biyopanning platformunagirmesi,QCM frekansındaki azalmayı izleyerek kısa peptitlerin ilaçlarla zayıf ama spesifik etkileşimlerinin tanımlanmasını sağlar4,5. Bağlı T7 fajı daha sonra konak Escherichia coli (BLT5615) enfekte edilerek doğrudan iyileşir ve uyuşturucu tanıyan kısa segmentleri barındıran benzeşim tarafından seçilen peptidi kodlayan bölgenin DNA dizisi belirlenir. Peptit popülasyonunun amino asit dizisinin daha sonraki analizi ilaç tanıma hakkında bilgi sağlar. Kurtarılan amino asit dizilerinin siliko çift yönlü hizalamasında, seçilen bir proteom içinde ilacın biyolojik hedefi hakkında bilgi edinmek için kullanılabilir. Bir ilaca yakınlığı olan protein parçalarının bu yüksek verim tanımlaması, ilaç bağlama bölgesini, çömlek parçalarından eski bir eserin yeniden inşasına benzer bir şekilde sezgisel olarak yeniden oluşturmak için kullanılabilir6. Özellikle, geleneksel proteomik yaklaşımlar başarısız olduğunda bu benzersiz yaklaşım yararlı olabilir.
Burada, T7 fajla görüntülenen peptitlerin biyopanningi için biyosensör tabanlı bir strateji ve küçük moleküllerin hedef doğrulaması için biyoinformatik analizi sunuyoruz. Geleneksel yöntemlerdeki teknik sınırlamaların ötesinde, bu strateji, aynı protokol kapsamında herhangi bir küçük ilgi molekülü için hedef proteinlerdeki ilaç bağlayıcı bölgelerin tanımlanmasını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, ilaç tanıyan peptitlerin QCM biyosensör bazlı biyopannlaması için bir strateji ve ardından tanımlanan peptitleri kullanarak ilaç-protein etkileşimlerini doğrulamak için biyoinformatik analizi sunulmuştur. Biyosensörün altın elektrodu üzerinde hareketsizleştirme için küçük molekül türevlerinin tasarlanması önemli bir adımdır, çünkü tanıtılan bağlayıcı ilacı tanıyan peptitin bağlanmasını ve toplanmasını engelleyebilir. Bunu önlemek için, tanıtılan bağlayıcının farklı pozisyonlarına sahip türevler hazırlanır23. Alternatif olarak, hidrofobik küçük molekülleri hareketsiz hale getirmek için, sensör çipi 10 cm Petri kabında dökme suya batırılır ve küçük molekülün 20 μL çözeltisi (dimetil sülfitte 10 mM çözeltisi) biyosensörün altın elektroduna, yüzeyini örtmek için bırakılır ve 5 dakika boyunca inkübe edilir. Bu, biyopannlama sırasında en az 10 dakika tutulan küçük moleküllerin yüz altı hertz iç frekansının tutulmasına izin verir. Gerçekten de, bu tür hareketsizleştirmeyi kullanarak, Osel benzeşimi tarafından seçilen peptitler, NA’daki Osel bağlama bölgesini açıkça vurgulamıştır (Şekil 3).
Buradaki peptit kütüphanesini hazırlamak için kullanılan T7 fajı, standart amino asitlerin 20’si için 32 kodon kodlayan ve 2 stop kodonunun (UAA, UGA) ortaya çıkışını bastıran ve sadece UAG ( Şekil 1 ) 6,7ortaya çıkan NNK15kaseti kullanılarak genetik olarak tasarlanmıştır. Bu, 15 mer tam boy peptitlerin görüntülenmesi ve kütüphanenin çeşitliliğinin artırılması için önemlidir. T7 fajlı ekran sistemi 107 —109 T7 fajlık teknik ekran sınırına sahiptir. Bununla birlikte, 15-mer peptit kütüphanesinin çeşitliliği teorik olarak 2015 ‘tir (3.27 × 1019); bu nedenle, tam kütüphane yapımı için kullanılamaz. Bununla birlikte, korunmuş motiflerin benzerlik araması veya madenciliği, kütüphanedeki bu sınırlı peptit çeşitliliği ile bile proteinlerin ilaç bağlama alanlarını oluşturan amino asitlerin tespit edilmesine izin verir. Ek olarak, kütüphane peptidi içinde 3-5 amino asit uzanır (görünüm oranı T7 faj görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilebilen 1/203 ile1/ 20 5arasındadır) küçük moleküllü ilaçların tanınmasında rol oynar; bu nedenle, peptit dizilerinin hedef proteinin ilaç bağlama bölgesini oluşturan 15-mer amino asit dizileri ile% 100 eşleşmesi gerekli değildir. Gerçekten de, yaklaşık 30 benzeşim seçilmiş peptit, test edilen her ilaç için hedef proteinin bağlama bölgesini başarıyla vurgulamıştır (Şekil 4). Böylece, kullanılan ana T7 faj kütüphanesinin çeşitliliği (1.7 × 107 pfu/mL) ilaç bağlama bölgesini sezgisel olarak yeniden oluşturmak için kullanılabilir.
Tipik olarak, T7 fajlarının 3-5 kopyası, ilaç tanıyan amino asit esnemelerini barındıran 15-mer amino asit dizilerinin dizileriyle aynı dizileri gösteren, keyfi olarak izole edilen 16 plak içinde ortaya çıktı ve bu da protokolümüz kapsamındaki benzeşim seçiminin başarısını gösterdi. Bu, izole edilen 96 plakta (sayı mikro plaka formatı ile ilişkilidir) 18-30 farklı ilaç tanıyan peptit dizisinin toplandığını ve daha sonra DNA’nın dizilimi kullanılarak ve ilgili amino asit dizisinin elde edildiğini gösterir. Mevcut stratejide, T7 faj kütüphanesinin 8 μL’lik kısmının 8 mL tampon (kütüphanenin 1000 kat seyreltilmesi) içeren cuvette’e enjektesi, T7 fajlarının spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için uygundur. Benzeşim tarafından seçilen peptitlerin çeşitliliğini artırmak için, bir döngü seçimini birkaç kez tekrarlamak ve tarama başına 16 veya 32 plak izolasyonu kullanmak, aynı anda tek bir çözeltiden izolasyondan daha etkili olduğunu kanıtladı. Örneğin, yaklaşık 30 farklı sıralı benzeşim seçilmiş peptitleri etkili bir şekilde toplamak için, 3-6 set tek döngülü seçim yapıldı, her deneyde 16 veya 32 plak izole edildi. 16 veya 32 T7 faj plaklarının hepsinde aynı dizilerin ortaya çıkması, arka planın yanlışlıkla tespit edildiği veya taşıma olarak kontaminasyon olabileceği belirtilmektedir. Buna karşılık, 15 mer uzunluğundan daha kısa peptitlere sahip birçok T7 fajının aynı dizilimi veya görünümüne sahip T7 fajlarının bulunmaması, popülasyondaki T7 fajlarının özellikle yüksek olasılıkla ortaya çıktığını göstermektedir. QCM frekans azalması bu gibi durumlarda bile aynı ölçüde gerçekleştiğinden, seçimin başarısı izole T7 fajının DNA’sı sıralanarak kapsamlı bir şekilde değerlendirilmeli ve ardından peptitlerin amino asit dizilerinin biyoinformatik analizi yapılmalıdır. Ayrıca, geleneksel T7 faj ekran protokolünden farklı olarak, T7 fajlarının varyasyonu ve sayısı küçük olduğundan ve amplifikasyon ve seçim adımlarını tekrarladıktan sonra bile konsantre olmadığı için seçim turlarının tekrarlanması daha az etkilidir23.
Daha da önemlisi, bu yöntem insanların, patojenik virüslerin ve hatta bitkilerin proteomlarında küçük molekül bağlayıcı bölgelerin madenciliği için geçerlidir. İlginçtir ki, T7 faj kapsid üzerindeki peptitlerin muhtemelen yapılandırılmamış kısa ekran uzunluğu, küçük bir molekülle kenetlenme sırasında protein peptitlerinin moleküler dinamiklerini taklit edebilir; bu dinamik bağlamayı yansıtabilir24. Geleneksel yöntemlerin teknik sınırlamalarının ötesinde, küçük moleküller için aynı protokoller için geçerli olan bu strateji, ilaçlanabilir proteomu genişletebilir ve ilaç-protein etkileşim analizi ile ilgili daha ayrıntılılık sağlayabilir.
Bu yaklaşımın bazı teknik sınırlamaları göz önünde bulundurulmalıdır. Biyosensör çipinin altın elektrot yüzeyinde küçük molekül hareketsizleştirme için organik sentez gereklidir. Organik kimya uzmanı olmayanlar için, bazı hareketsizleştirme reaktifleri, küçük molekülü kaplinle mekanik olarak sabitlemek için ticari olarak mevcuttur. Ayrıca, peptitlerin bazı saçma kısımları, ilacın kenetlenmeyle ilgili olmayan proteinin bir kısmının yanlış pozitif olarak tespit edilmesine neden olabilir. Bu, T7 fajının kopyaları üretildiğinde, diğer standart amino asitlerden daha fazla kodon tarafından kodlanan lösin veya valin kalıntıları bakımından zengin beta-tabaka veya lösin bakımından zengin alanlara ampirik olarak karşılık gelir. Kitaplık peptit uzunluğunun kontrol altına alındırıcısı yanlış pozitiflerin oluşumunu kontrol edebilir. Buna karşılık, X-ışını kristalografisi veya NMR analizi kullanılarak gösterildiği gibi, kenetlenmede rol oynayan ilaç bağlama bölgesinde amino asit kalıntılarının tespit edilmediği durumlar olabilir. Bu, ilaç tanıyan peptitlerin daha fazla sayıda toplanması veya altın elektrot üzerindeki küçük moleküllerin sabitleme yönünün değiştirilmesiyle çözülebilir.
İlaç kullanımının ana ve ikincil etkileri ile ilgili birçok ilaç-protein etkileşimi henüz proteomda tanımlanamayabilir; ek olarak, ilaç emilimi, dağılımı, metabolizması, atılımı ve toksisiteden sorumlu enzimler ve taşıyıcılar da hala tanımlanamayabilir. Protein bağlama her zaman bir ilacın biyoaktivitesi için sorumlu değildir. Bu nedenle, biyolojik tahlillerden elde edilen diğer bilgilerin bir kombinasyonu, ilaçların ana ve olumsuz etkilerinden sorumlu temel ilaç hedeflerinin tanımlanmasını geliştirecektir. Bu özlü tekniğin daha fazla adaptasyonu, çok çeşitli küçük moleküllü ilaçların protein bağlayıcı alanlarının madenciliği için pratikliği ve verimi artıracaktır. Burada sunulan yöntem, sadece ilgili alanlarda temel araştırmaların yapılmasına değil, aynı zamanda klinik kullanımda ilaçların terapötik etkinliğinin veya diğer biyolojik etkilerinin altında kalan moleküler mekanizmaların açıklığa kavuşturulmasına da büyük ölçüde katkıda bulunacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazar, oseltamivir sağladıkları için Dr. Yujiro Hayashi ve Hayato Ishikawa’ya ve bağımsız RELIC programlarını sağladıkları için Dr. Lee Makowski’ye teşekkür ediyor. Yazar ayrıca Tetsuya Kawagoe’yi QCM deneyinin teknik yardımı için kabul ediyor. Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.) tarafından kısmen desteklendi.
VERI KULLANıLABILIRLIĞI BILDIRIMI
Tek başına RELIC programları ve ilaçlar için benzeşim tarafından seçilen peptitlerin sıra verileri ve bu makalede kullanılan proteom veritabanındaki protein dizileri talep üzerine bu yazardan edinilebilir (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
Materials
| AFFINIXQN | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCM2008-STKIT | Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC |
| AADIV | Northeastern University (Lee Makowski) |
AADIV.exe | Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library. |
| Ceramic Sensor Chip | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMST27C | 4 sensor chips/package |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
D8418 | |
| Ethanol | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 09-0850 | |
| FASTAcon | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAcon.exe | Identifies proteins from a population with short consensus sequences. |
| FASTAskan | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAskan.exe | Lists proteins with high similarity to a peptide population. |
| Immiblization kit for AFFINIX | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMIMKT | SAM reagent and amine coupling reagent |
| INFO | Northeastern University (Lee Makowski) |
INFO.exe | Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule). |
| Liguid LB medium | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
L3522 | Autoclave for 20 min |
| MATCH | Northeastern University (Lee Makowski) |
MATCH.exe | Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length). |
| MOTIF1 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF1.exe | Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population. |
| MOTIF2 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF2.exe | Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths. |
| NaCl | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | S3014 | |
| Recptor ligand contacts (RELIC) | Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA) |
https://www.relic.anl.gov | Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request) |
| Tris | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 252859 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack. Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Piggott, A. M., Karuso, P. Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display. Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule. Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).
- Takakusagi, Y., et al. Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display. ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).
- Novagen. T7 Select® System Manual. Novagen. , (2009).
- Novagen. OrientExpressTM cDNA Manual. Novagen. , (2009).
- Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. RELIC–a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites. Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).
- Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. . Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).
- Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins. Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).
- Harel, M., et al. The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action. Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).
- Dodds, H. M., Rivory, L. P. The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11). Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).
- Bencharit, S., et al. Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases. Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).
- Kim, C. U., et al. Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity. Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).
- Hoffmann, G., et al. Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).
- Wishart, D. S., et al. DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).
- Takakusagi, K., et al. Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).
- Takakusagi, Y., et al. Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).
- Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device. World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).
- Kusayanagi, T., et al. The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).
- Takakusagi, Y., et al. Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).
- Rodi, D. J., et al. Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).
