Estrategia de análisis bioaformático y bioinformática basada en biosensores para la validación global de interacciones entre fármacos y proteínas
Summary
Este estudio tenía como objetivo presentar una estrategia para identificar las interacciones entre fármacos y péptidos. La estrategia consiste en la biopanning de péptidos cortos que reconocen fármacos basados en un biosensor de micropeso de cristal de cuarzo (QCM), seguido de análisis bioinformática para evaluar cuantitativamente la información obtenida para el reconocimiento de fármacos y la anotación de los sitios de unión a fármacos sobre proteínas.
Abstract
Los receptores y las proteínas enzimáticas son biomoléculas importantes que actúan como objetivos de unión para moléculas pequeñas bioactivas. Por lo tanto, la validación rápida y global de las interacciones fármaco-proteínas es altamente deseable no sólo para entender los mecanismos moleculares subyacentes a la eficacia terapéutica, sino también para evaluar las características de los fármacos, tales como adsorción, distribución, metabolismo, excreción, y toxicidad (ADMET) para uso clínico. Aquí, presentamos una estrategia de alto rendimiento basada en biosensores para el biopanning de péptidos cortos con exhibición de fago T7 que se pueden mostrar fácilmente en el fósforo capsid. También se muestra el análisis posterior de las secuencias de aminoácidos de péptidos que contienen segmentos cortos, como “reliquias rotas”, de los sitios de unión a fármacos que utilizan programas de bioinformática en la suite de contacto de ligando receptor (RELIC). Mediante la aplicación de este método a dos fármacos clínicamente aprobados, un irinotecán antitumoral y un oseltamivir anti-gripe, se explica en este artículo el proceso detallado para recoger las secuencias de péptidos que reconocen fármacos y resaltar los sitios de unión farmacológica de las proteínas diana. La estrategia descrita en este documento se puede aplicar para cualquier molécula pequeña de interés.
Introduction
La identificación de objetivos farmacorres unidos es esencial para el desarrollo de fármacos, así como para comprender los mecanismos moleculares de las enfermedades. En particular, las proteínas receptoras y enzimáticas son los objetivos moleculares más importantes de las moléculas pequeñas bioactivas1. Aunque la captura de afinidad es una técnica bien establecida para identificar las proteínas que unen fármacos2,las limitaciones técnicas, como la baja solubilidad de las proteínas, a menudo obstaculizan la validación de los objetivos farmacológicos2. Lo más importante es que las moléculas pequeñas inmovilizadas pierden el grado de libertad necesario para el acoplamiento y pueden ser inaccesibles para los sitios de unión internamente ubicados en proteínas objetivo más grandes. Además, el misfolding proteico, la incapacidad para analizar las condiciones de co-cristalización y las limitaciones debidas al tamaño molecular a menudo dificultan el uso de cristalografía por rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN) y otros análisis experimentales para estudiar las interacciones entre fármacos y proteínas.
El uso de la pantalla de fago T7 biopanning es una manera eficiente para determinar el sitio de unión en proteínas para cebos de moléculas pequeñas3. En particular, una biblioteca de péptidos aleatorios con foda T7, que se puede construir insertando ADN sintético en un sitio de clonación múltiple, es eficaz. En comparación con la biblioteca de fagos T7 que muestra proteínas, los péptidos cortos se pueden diseñar fácilmente para ser mostrados en el fago T7 capsid sin restricciones físicas, que puede entrar en contacto estetéricamente con cualquier fármaco de molécula pequeña fijado en un soporte sólido2. Además, la introducción de un biosensor de micropeso de cristal de cuarzo (QCM) en la plataforma de biopanning de exhibición de fago T7 permite la identificación de tales interacciones débiles pero específicas de péptidos cortos con fármacos mediante el seguimiento de la reducción en la frecuencia QCM4,5. El fago T7 enlazado se recupera directamente infectando el huésped Escherichia coli (BLT5615), y se determina la secuencia de ADN de la región que codifica el péptido seleccionado por afinidad que alberga segmentos cortos que reconocen fármacos. Análisis posterior de la secuencia de aminoácidos de la población de péptidos proporciona información sobre el reconocimiento de drogas. En silico alineación emparejada de las secuencias de aminoácidos rescatados se puede utilizar para obtener información sobre el objetivo biológico de la droga dentro de un proteoma seleccionado. Esta identificación de alto rendimiento de fragmentos de proteínas con afinidad hacia un fármaco se puede utilizar para reconstruir heurísticamente el sitio de unión a fármacos de una manera similar a la de reconstruir un artefacto antiguo a partir de fragmentos de cerámica6. En particular, este enfoque único puede ser útil cuando los enfoques proteómicos convencionales fallan.
Aquí, presentamos una estrategia basada en biosensores para el biopanning de péptidos exhibidos por fagos T7 y análisis bioinformática para la validación objetivo de las moléculas pequeñas. Más allá de las limitaciones técnicas de los métodos convencionales, esta estrategia permite la identificación de sitios de unión a fármacos en proteínas objetivo para cualquier molécula pequeña de interés bajo el protocolo idéntico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se ha presentado una estrategia para la biopanning basada en biosensores QCM de péptidos que reconocen fármacos, seguida de análisis bioinformática para validar interacciones fármaco-proteínas utilizando los péptidos identificados. El diseño de los derivados de moléculas pequeñas para la inmovilización en el electrodo de oro del biosensor es un paso importante, ya que el vinculador introducido puede obstaculizar la unión y la recolección del péptido que reconoce el fármaco. Para evitar esto, los derivados con diferentes posiciones del vinculador introducido se preparan23. Alternativamente, para inmovilizar moléculas pequeñas hidrofóbicas, el chip del sensor está sumergido en agua a granel en una placa Petri de 10 cm, y una solución de 20 μL de la molécula pequeña (solución de 10 mM en sulfóxido de dimetil) se cae sobre el electrodo de oro del biosensor, para cubrir su superficie, e incubada durante 5 minutos. Esto permite la retención de una frecuencia intrínseco de sub-cien hercios de moléculas pequeñas, que se mantiene durante al menos 10 minutos durante el biopanning. De hecho, utilizando dicha inmovilización, los péptidos seleccionados por afinidad de Osel destacaron claramente el sitio de enlace de Osel en NA (Figura 3).
El fago T7 utilizado para preparar la biblioteca de péptidos aquí está genéticamente diseñado utilizando el casete NNK15 que codifica 32 codón para los 20 aminoácidos estándar y reprime la aparición de 2 codos stop (UAA, UGA) y emerge sólo UAG (Figura 1)6,7. Esto es importante para mostrar péptidos de larga duración de 15 mer y aumentar la diversidad de la biblioteca. El sistema de visualización de fagos T7 tiene un límite de visualización técnica de 107—109 fagos T7. Sin embargo, la diversidad de la biblioteca de péptidos de 15 mer es teóricamente 2015 (3,27 × 1019); por lo tanto, no se puede utilizar para la construcción completa de la biblioteca. Sin embargo, la búsqueda de similitudes o la minería de motivos conservados permite la detección de los aminoácidos que comprenden los sitios de unión farmacológica de proteínas incluso con esta limitada diversidad de péptidos en la biblioteca. Además, 3-5 aminoácidos se extiende dentro del péptido de la biblioteca (la tasa de aparición está entre 1/203 y 1/ 205,que se puede realizar utilizando el sistema de visualización de fago T7) están involucrados en el reconocimiento de fármacos de moléculas pequeñas; por lo tanto, no se requiere una coincidencia del 100% de las secuencias de péptidos con secuencias de aminoácidos de 15 mer que constituyen el sitio de unión de fármacos de la proteína objetivo. De hecho, aproximadamente 30 péptidos seleccionados por afinidad destacaron con éxito el sitio de unión de la proteína objetivo para cada fármaco probado(Figura 4). Por lo tanto, la diversidad de la biblioteca de fago T7 padre utilizado (1.7 × 107 pfu/ mL) se puede utilizar para reconstruir heurísticamente el sitio de unión a fármacos.
Por lo general, 3-5 copias de fagos T7 que mostraban las mismas secuencias que las de las secuencias de aminoácidos de 15 mer que albergan estiramientos de aminoácidos que reconocen drogas surgieron dentro de las 16 placas aisladas arbitrariamente, lo que indica el éxito de la selección de afinidad bajo nuestro protocolo. Esto indica que entre 18 y 30 secuencias de péptidos diferentes que reconocen fármacos se recogen dentro de las 96 placas aisladas (el número está asociado con el formato de microplaca), que se identifican posteriormente mediante secuenciación del ADN y obteniendo la secuencia de aminoácidos correspondiente. En la estrategia actual, la inyección de 8 μL de la biblioteca de fagos T7 en la cubeta que contiene 8 ml de amortiguador (dilución de 1000 veces de la biblioteca) es adecuada para reducir la unión no específica de los fagos T7. Aumentar la diversidad de péptidos seleccionados por afinidad, repetir la selección de un ciclo varias veces y usar 16 o 32 aislamientos de placa por cribado demostró ser más eficaz que el aislamiento de una sola solución a la vez. Por ejemplo, para recopilar eficazmente aproximadamente 30 péptidos seleccionados por afinidad secuenciados de forma diferente, se llevaron a cabo entre 3 y 6 conjuntos de selección de un ciclo, 16 o 32 placas aisladas en cada experimento. La aparición de secuencias idénticas en las placas de fago 16 o 32 T7 se indica detección accidental de antecedentes o podría contaminación como arrastre. Por el contrario, la ausencia de fagos T7 con la misma secuencia o apariencia de muchos fagos T7 con péptidos más cortos que la longitud de 15 mer indica que los fagos T7 en la población no emergieron específicamente con alta probabilidad. Como la reducción de la frecuencia qcm se produce en la misma medida incluso en tales casos, el éxito de la selección debe evaluarse exhaustivamente secuenciando el ADN del fago aislado T7, seguido de análisis bioinformática de las secuencias de aminoácidos de los péptidos. Además, a diferencia del protocolo convencional de visualización de fagos T7, repetir rondas de selección es menos eficaz, ya que la variación y el número de los fagos T7 son pequeños y no se concentran incluso después de repetir los pasos de amplificación y selección23.
Es importante destacar que este método es aplicable para la minería de pequeños sitios de unión a moléculas en los proteomas de los seres humanos, virus patógenos, e incluso plantas. Curiosamente, la longitud de visualización corta posiblemente no estructurada de péptidos en el cástago de fago T7 puede imitar la dinámica molecular de péptidos de proteínas durante el acoplamiento con una molécula pequeña; esto puede reflejar el enlace dinámico24. Más allá de las limitaciones técnicas de los métodos convencionales, esta estrategia, aplicable a protocolos idénticos para moléculas pequeñas, puede ampliar el proteoma farmacológico, así como proporcionar más granularidad con respecto al análisis de interacción fármaco-proteína.
Deben tenerse en cuenta ciertas limitaciones técnicas de este enfoque. La síntesis orgánica es necesaria para la inmovilización de moléculas pequeñas en la superficie del electrodo de oro del chip del biosensor. Para los no expertos en química orgánica, algunos reactivos de inmovilización están disponibles comercialmente para fijar mecánicamente la molécula pequeña mediante acoplamiento. Además, ciertas porciones sin sentido de los péptidos podrían resultar en la detección de una porción de la proteína no relevante para el acoplamiento de fármacos como falsos positivos. Esto corresponde empíricamente a los dominios ricos en beta-hoja o leucina ricos en leucina o valina, que están codificados por más codón que otros aminoácidos estándar, cuando se producen copias del fago T7. Controlar la longitud del péptido de biblioteca podría controlar la aparición de falsos positivos. Por el contrario, puede haber casos en los que no se detecten residuos de aminoácidos en el sitio de unión a fármacos que participan en el acoplamiento, como se demuestra mediante cristalografía de rayos X o análisis nmr. Esto puede resolverse recogiendo un mayor número de péptidos que reconocen fármacos o cambiando la dirección de fijación de las moléculas pequeñas en el electrodo de oro.
Muchas interacciones farmaco-proteínas relacionadas con los principales y secundarios efectos del consumo de drogas todavía pueden no ser identificadas en el proteoma; además, las enzimas y transportadores responsables de la absorción de fármacos, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad, también podrían no ser identificados. La unión a proteínas no siempre es responsable de la bioactividad de un medicamento. Por lo tanto, una combinación de otra información de ensayos biológicos mejorará la identificación de objetivos esenciales de fármacos responsables de los principales y adversos efectos de los fármacos. Otras adaptaciones de esta técnica concisa aumentarán la practicidad y el rendimiento para la minería de los sitios de unión a proteínas de una amplia gama de fármacos de moléculas pequeñas. El método presentado en este documento contribuirá en gran medida no sólo a llevar a cabo investigaciones básicas en los campos relacionados, sino también a aclarar los mecanismos moleculares subyacentes a la eficacia terapéutica u otros efectos biológicos de los fármacos en el uso clínico.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor agradece a los Drs. Yujiro Hayashi y Hayato Ishikawa por proporcionar oseltamivir, y al Dr. Lee Makowski por proporcionar los programas independientes RELIC. El autor también reconoce a Tetsuya Kawagoe por la asistencia técnica del experimento QCM. Este trabajo fue parcialmente apoyado por JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.).
DECLARACIÓN DE DISPONIBILIDAD DE DATOS
Los programas RELIC independientes y los datos de secuencia de péptidos seleccionados por afinidad para fármacos, así como las secuencias proteicas de la base de datos de proteomas utilizadas en este artículo están disponibles en este autor bajo petición (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
Materials
| AFFINIXQN | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCM2008-STKIT | Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC |
| AADIV | Northeastern University (Lee Makowski) |
AADIV.exe | Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library. |
| Ceramic Sensor Chip | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMST27C | 4 sensor chips/package |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
D8418 | |
| Ethanol | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 09-0850 | |
| FASTAcon | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAcon.exe | Identifies proteins from a population with short consensus sequences. |
| FASTAskan | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAskan.exe | Lists proteins with high similarity to a peptide population. |
| Immiblization kit for AFFINIX | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMIMKT | SAM reagent and amine coupling reagent |
| INFO | Northeastern University (Lee Makowski) |
INFO.exe | Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule). |
| Liguid LB medium | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
L3522 | Autoclave for 20 min |
| MATCH | Northeastern University (Lee Makowski) |
MATCH.exe | Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length). |
| MOTIF1 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF1.exe | Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population. |
| MOTIF2 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF2.exe | Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths. |
| NaCl | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | S3014 | |
| Recptor ligand contacts (RELIC) | Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA) |
https://www.relic.anl.gov | Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request) |
| Tris | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 252859 |
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